糞菌移植干預治療潰瘍性結腸炎的免疫學機制研究

翁劍鋒，徐佳，劉朋，葛巍，陳教華，彭迎迎，胡家麗，崔曼曼，張磊昌*

本研究創新性：

本項目從傳統醫學和現代醫學兩個方面探討糞菌移植（FMT）和腸道菌群的相關性，擬為FMT干預潰瘍性結腸炎（UC）提供中醫和西醫雙重理論支持，且本項目創新之處在于將FMT和中藥金汁進行聯系，首次從中藥的角度分析FMT的藥物性味，并基于轉錄因子→CD4+T細胞→細胞因子通路分析其干預UC的可能機制，有望為FMT干預UC奠定中醫中藥和免疫學理論基礎。

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的范疇，是主要累及直腸、結腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥，臨床以腹痛、腹瀉、黏液膿血便等為主要表現［1］，以發作、緩解及復發交替為疾病特點，好發于直腸和乙狀結腸，多見于20～40歲青壯年人群，是消化系統的常見病、多發病、疑難?。?］。近年來，UC的發病率及向結腸癌轉化率升高，已逐漸成為全球重點關注的疾病之一，但關于UC的病因、發病機制尚不明確［3］?，F代醫學認為其是在遺傳、環境、心理等多種因素的共同影響下，導致腸黏膜屏障損傷，神經內分泌功能失調和免疫失衡，從而引起腸黏膜局部潰瘍而發病，免疫狀態紊亂是其公認的發病機制之一［4］。

目前針對UC尚無治愈的方法，藥物治療本病原則上以控制急性發作、黏膜修復、維持緩解、減少復發、預防并發癥為主，治療藥物包括氨基水楊酸制劑、糖皮質激素類等［4］。但藥物不良反應較強，病情容易反復。糞菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是指將健康人糞便中的功能菌群，采用某些方式移植入患者胃腸道內，重建具有正常功能的腸道菌群，治療腸道及腸道外某些疾病。該方法由來已久，且在2013年治療難辨梭狀芽孢桿菌感染被寫入美國食品藥品監督管理局指南，其安全性及有效性進一步得到了印證，適應證得到進一步擴展［5］。

許多研究表明UC發病還與免疫細胞、炎性細胞因子的參與有關聯，免疫調節的失衡會導致炎性細胞和炎性遞質釋放異常，最終引發腸黏膜組織損害［2］。本研究以陽性藥物5-氨基水楊酸（5-ASA）為實驗對照，通過FMT治療濕熱型UC模型驗證其療效，通過檢測不同種類T細胞、相關炎性因子含量，探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6小鼠（4周齡），共60只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司〔許可證號：SCXK（湘）2019-0004〕，在常溫常態下適應性飼養1周。本實驗獲得江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（審批編號：JZYYLL20200420007）。

1.2 實驗試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（DSS）（貨號：9011-18-1，上海源葉生物科技有限公司）；5-ASA（貨號：89-57-6，上海源葉生物科技有限公司）；高脂高糖飼料（配方：糖15%、豬油10%、膽固醇4%、膽鹽0.3%、蛋黃粉10%、基礎飼料60.7%，南京盛民科研動物養殖場）；便隱血（OB）試劑（批號：B200101，珠海貝索生物技術有限公司）；水合氯醛（批號：119957，上海展云化工有限公司）；異氟烷（批號：S10010533，上海玉研科學儀器有限公司）；干擾素γ（IFN-γ）PE（505808，Biolegend）；白介素（IL）-17A PE（506904，Biolegend）；FOXP3 Alexa Fluor? 488（126406，Biolegend）；CD4 APC-CY7（100460，Biolegend）；CD25 PE（101904，Biolegend）；IL-4 PE（504104，Biolegend）；True-NuclearTMTranscription Factor Buffer Set（424401，Biolegend）；Fixation/Permeabilization Solution Kit（554714，Biolegend）；小鼠IL-2試劑盒（MM-0701M1，酶免）；小鼠IL-4試劑盒（MM-0165M1，酶免）；小鼠IL-10試劑盒（MM-0176M1，酶免）；小鼠IL-17試劑盒（MM-0170M1，酶免）；小鼠轉化生長因子β（TGF-β）試劑盒（MM-0689M1，酶免）；小鼠IFN-γ試劑盒（MM-0182M1，酶免）；人工氣候箱（PRX-80A，江蘇天翔儀器）；動物呼吸麻醉機（ABM-100，上海玉研科學儀器）；透射電鏡（JEM-1230，JEOL）；流式細胞儀（NovoCyte 2060R，艾森生物）；多功能酶標儀（S/N502000011，TECAN）； 顯 微 鏡（CX41 OLYMPUS）；切片機（BQ-318D，伯納）。

1.3 實驗分組與動物造模 2019年12月至2020年4月，采用隨機數字表法將小鼠分為4組，每組各15只，分組如下：（1）正常對照組（Control組）：不進行任何干預處理，給予小鼠自由飲用正常水，普通飼料喂養，常溫常態下飼養，不進行其他特殊處理；（2）UC模型組（Model組）：造模成功后，常溫常態下普通飼料正常飲水飼養，給予磷酸鹽緩沖液（PBS）0.2 ml/次對小鼠進行灌腸，1次/2 d，持續10 d，共計5次；（3）UC模型+糞菌移植治療組（Model+FMT組）：造模成功后，常溫常態下普通飼料正常飲水飼養，給予制備的糞菌液0.2 ml/次對小鼠進行灌腸，1次/2 d，持續10 d，共計5次；（4）UC模型+5-ASA治療組（Model+5-ASA組）：造模成功后，常溫常態下普通飼料正常飲水飼養，按照0.195 g/kg的劑量，5-ASA藥物濃度為0.019 5 g/ml，即20 g小鼠灌腸0.2 ml，1次/2 d，持續10 d，共計5次。

UC模型造模：將小鼠適應性飼養7 d后，置于鼠籠飼養IVC系統（設置參數如下：溫度36 ℃、濕度80%，每日持續12 h）中飼養，給予高脂高糖飼料，并給予小鼠自由飲含2% DSS蒸餾水，連續飼養10 d即可。

糞菌（fecal microbiota，FM）制備：取Control組小鼠的5 g新鮮晨便，取標本溶于10 ml無菌PBS中充分混勻，分別用2.0、1.0、0.5、0.25 mm的不銹鋼篩過濾，以6 000×g離心15 min，取菌體，用無菌PBS清洗3次，重懸于25 ml PBS中，4 ℃冰箱保存。

1.4 動物取樣 給藥結束后，將各組小鼠用10%水合氯醛按照400 mg/kg腹腔注射麻醉，打開動物的腹腔及胸腔，用1 ml注射器抽取0.02 ml飽和EDTA溶液潤管，從小鼠心臟處采血，收集血液用于流式細胞檢測；將結腸和盲腸取出，表面血跡沖洗干凈，內容物取出后切去盲腸，用于透射電鏡檢測、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測。

1.5 透射電鏡觀察 各組組織樣品2.5%戊二醛固定2 h以上，用0.1 mmol/L磷酸漂洗，1%鋨酸固定液固定2 h，0.1 mmol/L磷酸漂洗梯度乙醇（50%～90%）溶液脫水，再用丙酮脫水，包埋固化，切片切成厚度為70 nm薄片。3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡觀察。

1.6 流式細胞檢測 輔助性T細胞（Th）17細胞檢測：各組取100 μl血液置于12孔板中，加入150 μl 1640完全培養基，加入1 μl PMA/Ionomycin mixture佛波酯/離子霉素混合物，放入培養箱中孵育30 min后加入1 μl BFA/Monensin Mixture，放入培養箱中孵育24 h。結束后，將血液轉至EP管中離心，棄150 μl上清液，將細胞吹勻加入CD4 APC-CY7各5 μl，避光孵育15 min，1 ml PBS，400×g離心5 min清洗2次，棄上清液。加入500 μl Fixation/Permeabilization Solution避光固定破膜40 min，400×g離心5 min后，加入1 ml 1×BD Perm/WashTMbuffer，清洗2次，再100 μl 1×BD Perm/WashTMbuffer重懸細胞，加入5 μl IL-17A PE，避光孵育15 min。1 ml 1×BD Perm/WashTMbuffer，清洗2次，再500 μl 1×BD Perm/WashTMbuffer重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

Th1、Th2細胞檢測步驟同上，CD4 APC-CY7孵育重懸后，其中Th1檢測加入IFN-γ PE孵育，Th2檢測加入IL-4 PE孵育；Treg細胞檢測步驟同上，CD4 APCCY7孵育重懸后，加入FOXP3 Alexa Fluor? 488孵育。

1.7 ELISA 檢 測 將 IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β試劑盒中所有試劑取出恢復到室溫，并對上述指標進行檢測，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl。分別設空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl。每孔加入酶標試劑100 μl，空白孔除外，用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干洗滌，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 ml，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μl，終止反應，450 nm波長測量各孔的OD值。

1.8 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 透射電鏡分析 各組腸組織透射電鏡超微結構顯示：Control組微絨毛形態規則，排列整齊，較多杯狀細胞，線粒體豐富，嵴結構清楚，粗面內質網未見改變；Model組上皮細胞表面微絨毛稀疏，長短不一，形態不規則，細胞連接間隙增寬，杯狀細胞減少，胞質內有空泡，線粒體腫脹，部分嵴消失，個別內質網擴張或呈空泡變化；Model+FMT組與Model+5-ASA組微絨毛較為致密，形態正常，杯狀細胞數目較多，線粒體輕微腫脹，粗面內質網病變不明顯，見圖1。

2.2 流式細胞檢測 各組Th17、Th1、Th2、Treg細胞含量比較，差異均有統計學意義（P＜0.001）；其中Model組Th17細胞含量高于Control組，Model+FMT組Th17細胞含量高于Control組、低于Model組，Model+5-ASA組Th17細胞含量低于Control組、Model組、Model+FMT組；Model組Th1細胞含量高于Control組，Model+FMT組、Model+5-ASA組Th1細胞含量均分別低于Control組、Model組；Model組Th2細胞含量低于Control組，Model+FMT組Th2細胞含量低于Control組、高于Model組，Model+5-ASA組Th2細胞含量低于Control組、高于Model組和Model+FMT組；Model組Treg細胞含量低于Control組，Model+FMT組、Model+5-ASA組Treg細胞含量均分別低于Control組、高于Model組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖2。

表1 各組小鼠腸組織中Th17、Th1、Th2、Treg細胞含量比較（±s，ng/L）Table 1 Comparison of Th17，Th1，Th2，and Treg cell content in intestinal tissues of mice in each group

表1 各組小鼠腸組織中Th17、Th1、Th2、Treg細胞含量比較（±s，ng/L）Table 1 Comparison of Th17，Th1，Th2，and Treg cell content in intestinal tissues of mice in each group

注：a表 示 與 Control組 相 比 P＜0.05，b表 示 與 Model組 相 比P＜0.05，c表 示 與 Model+FMT組 相 比 P＜0.05；Th=輔 助 性 T細胞，Control組=正常對照組，Model組=潰瘍性結腸炎模型組，Model+FMT組=潰瘍性結腸炎模型+糞菌移植治療組，Model+5-ASA組=潰瘍性結腸炎模型+5-氨基水楊酸治療組

組別 只數 Th17 Th1 Th2 Treg Control組 15 0.88±0.15 8.86±3.00 7.71±1.30 5.94±1.24 Model組 15 5.60±1.00a 28.20±3.30a 1.76±1.01a 0.97±0.51a Model+FMT 組 15 1.77±0.30ab 12.50±2.22ab 3.70±1.61ab 3.64±1.28ab Model+5-ASA 組 15 0.47±0.12abc 11.09±2.07ab 4.65±1.21abc 4.20±0.85ab F值 189.191 160.214 54.751 61.371 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 ELISA 檢測各組 IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β細胞含量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中Model組IFN-γ細胞含量高于Control組，Model+5-ASA組IFN-γ細胞含量低于Model組；Model組IL-2細胞含量高于Control組，Model+FMT組、Model+5-ASA組IL-2細胞含量低于Model組；Model組IL-17細胞含量高于Control組，Model+FMT組、Model+5-ASA組IL-17細胞含量均分別低于Control組和Model組，Model+5-ASA組IL-17細胞含量低于Model+FMT組；Model組IL-4細胞含量低于Control組，Model+FMT組IL-4細胞含量低于Control組、高于Model組，Model+5-ASA組IL-4細胞含量高于Model組；Model組IL-10細胞含量低于Control組，Model+FMT組IL-10細胞含量高于Control組和Model組，Model+5-ASA組IL-10細胞含量高于Model組；Model組TGF-β細胞含量低于Control組，Model+FMT組、Model+5-ASA組TGF-β細胞含量均分別低于Control組、高于Model組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β細胞含量比較（±s，ng/L）Table 2 Comparison of serum IFN-γ，IL-2，IL-17，IL-4，IL-10，TGF-β cell levels in each group of mice

表2 各組小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β細胞含量比較（±s，ng/L）Table 2 Comparison of serum IFN-γ，IL-2，IL-17，IL-4，IL-10，TGF-β cell levels in each group of mice

注：a表示與Control組相比P＜0.05，b表示與Model組相比P＜0.05，c表示與Model+FMT組相比P＜0.05；IFN-γ=干擾素γ，IL=白介素，TGF-β=轉化生長因子β；各組分別有6只小鼠存在技術操作原因造成脫落

組別 只數 IFN-γ IL-2 IL-17 IL-4 IL-10 TGF-β Control組 9 147.98±22.57 57.42±10.37 6.01±0.95 23.48±2.62 97.49±5.56 130.79±17.55 Model組 9 183.65±27.12a 73.87±14.64a 12.56±1.73a 10.48±1.73a 57.93±11.46a 76.30±14.12a Model+FMT 組 9 160.33±43.92 49.57±12.24b 4.36±0.89ab 20.35±2.39ab 118.00±10.85ab 104.88±11.63ab Model+5-ASA 組 9 142.31±33.65b 52.17±7.59b 2.96±0.87abc 22.00±4.26b 109.84±22.82b 98.88±11.87ab F值 2.811 8.089 119.367 36.873 31.883 23.051 P 值 0.048 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

UC是一種消化系統的慢性炎癥性疾病，其病變主要累及結腸黏膜層，以潰瘍病變為主，臨床以反復發作的腹瀉、黏液膿血便、腹痛為主要表現。微生物群在代謝、免疫和腸道保護上具有重要的作用和功能?？咕蜃雍投ㄖ部剐缘漠a生是腸道菌群調控的重要手段方式，其可以通過拮抗營養物質和受體，阻止潛在致病菌的生長。在正常情況下，人體內腸道微生態結構處于動態平衡的“穩態”結構，但在諸多研究中，明顯發現UC患者和實驗性UC小鼠腸道內處于菌群紊亂失衡的狀態，其表現出致病菌增多、有益菌減少的狀態［2，7］。而針對于此，近年來，從中醫藥出發探索治療UC的臨床療效頗為明顯，也為研究腸道菌群與UC的相關性提供了一個新的角度和策略。根據本研究透射電鏡超微結構結果分析，FMT對UC模型小鼠有顯著的療效，且效果不弱于5-ASA。流式細胞檢測結果表明FMT可以改善T細胞比例，使UC模型中Th1細胞與Th17細胞顯著減少，Th2細胞與Treg細胞顯著增多。ELISA結果表明FMT可以使UC模型中IFN-γ、IL-2、IL-17降低，IL-4、IL-10、TGF-β升高，趨于正常水平。本研究結果表明，FMT治療UC的機制可能與改善腸道菌群結構，酸化腸道抑制致病菌生長，提高腸道抗炎代謝物如短鏈脂肪酸的水平、增加有益菌豐度、改善Th1/Th2細胞平衡和Th17/Treg細胞比例、調節促炎因子與抗炎因子的平衡、誘導機體免疫系統對腸道菌群產生免疫耐受等多方面相關［8］。

本研究結果顯示，Model組Th1、Th17較Control組明顯增加，Th2、Treg明顯出現反向減少，但在Model+FMT組 及 Model+5-ASA組 中，Th1、Th17較Control組和Model組均出現減少，而Th2、Treg均增加，表明無論是FMT還是5-ASA對UC均有抑制促炎因子生成、增加抗炎因子水平的作用，且Model+FMT組中Th1、Th17低于Model+5-ASA組，而Th2、Treg相對較高，同樣的情況也出現在ELISA檢測結果中，IFN-γ、IL-2、IL-17出現降低，而IL-4、IL-10、TGF-β升高，趨于正常水平，且Model+FMT組上述指標增減趨勢較Model+5-ASA組更為明顯，因此，從中可以推論FMT及5-ASA對UC均有良好的療效，且FMT療效相對優于5-ASA。眾所周知，T淋巴細胞在機體的免疫應答和免疫調節作用中占據中心地位，Th細胞為初始CD4+T細胞活化后分化而成的效應細胞，其通過釋放細胞因子、輔助B細胞活化產生抗體，以及和細胞間直接接觸的方式發揮免疫效應［9］。在受到不同性質抗原和局部微環境中細胞因子調控后，Th細胞主要可分化為Th1、Th2亞型。Th1細胞以分泌IL-2、IFN-γ等為主，參與細胞免疫應答、炎性反應和急性排斥反應過程；Th2細胞以分泌IL-4、IL-5為主，參與體液免疫應答［10-11］。根據本研究結果，UC模型中Th1細胞占據主導，FMT治療后，轉變為以Th2細胞為主導，Th1/Th2平衡趨于Control組。Th17細胞是新發現的一種獨特Th亞群，其在TGF-β、IL-6、IL-23等多種細胞因子參與發生活化，并通過分泌IL-17、IL-22等細胞因子，參與炎性反應、細菌感染免疫應答和自身免疫性疾病等過程［12］。研究顯示，Th17細胞及其相關因子IL-17、IL-21在UC活動期表達增多，并隨著疾病活動程度增加呈逐漸上升趨勢［13-14］。Treg是一類具有負調節作用的CD4+CD25+Foxp3+T細胞亞群，Foxp3是其重要轉錄因子，不僅是Treg的標志，也參與Treg的分化和功能調節［15］。研究表明Treg通過釋放TGF-β、IL-10等細胞因子發揮免疫抑制功能，Treg與炎性腸病的發病關系緊密。通過流式細胞檢測UC患者治療前后外周血Treg細胞的數量，治療后明顯增多，可以認為其參與了UC的發病。

綜上可知，FMT可改善UC模型小鼠，且效果明顯，推測其發揮功效的可能是通過調節Th1/Th2細胞平衡，Th17/Treg細胞比例，達到治療的目的，本研究為FMT治療UC提供了理論依據，但還需更進一步深入的研究。

作者貢獻：翁劍鋒進行文章的構思與設計，對文章整體負責，監督管理；張磊昌進行研究的實施與可行性分析，負責文章的質量控制及審校；胡家麗、崔曼曼進行數據收集；劉朋、陳教華、彭迎迎進行數據整理；陳教華、彭迎迎進行統計學處理；葛巍、胡家麗、崔曼曼進行結果的分析與解釋；翁劍鋒、徐佳撰寫論文；徐佳、劉朋進行論文的修訂。

本文無利益沖突。