骨相關間充質干細胞CD166+亞群治療炎性腸病模型小鼠的研究*

孟煒程 陳要臻 安寧 張婧 陳禹彤 胡興斌

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性非特異性的腸道炎癥性疾病，目前病因不明，發病機制尚不十分清楚。IBD好發于青壯年人群，有潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD）兩種臨床亞型，目前不可治愈[1-2]。IBD病程長且反復發作，導致生活質量和工作效率下降，甚至出現抑郁癥等癥狀，對患者的身心健康造成嚴重損害。同時，IBD患者需要反復住院治療，手術和藥物的使用，特別是生物制劑的使用，導致高昂的醫療費用[3]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來源廣泛，具有多向分化潛能，近年來因其突出的免疫調節功能被廣泛用于治療慢性炎癥性疾病研究[4-5]。前期實驗室利用小鼠IBD模型，也證實MSCs可以抑制結腸炎癥狀，促進炎癥修復[6]。但MSCs是混合群細胞具有多向分化潛能，發揮作用的可能是其中的某個亞群。經流式分選可獲得到CD146+、CD166+、Sca1+三種骨相關MSCs亞群；這些MSCs亞群可能具有不同的功能，我們前期已發現它們支持骨髓移植后造血干細胞體內重建存在差異[7]。CD166+細胞是數量相對較多的細胞，考慮到細胞獲得難度以及轉化的前景，本研究對骨相關間充質干細胞進行分選得到MSCs CD166+亞群，并檢測其應用于小鼠IBD模型的治療效果。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：雄性野生C57BL/6無特定病原體小鼠（體重19～22 g，8～12周齡）由空軍軍醫大學實驗動物中心提供并飼養。造模前，適應性飼養3 d，普通飼料喂養。本實驗過程均嚴格按照實驗動物倫理相關要求進行。

1.2 主要試劑：磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；0.5% Ⅰ型膠原酶；紅細胞裂解液（ACK）；間充質干細胞免疫磁珠富集試劑盒（Stem cell公司）；CD166磁珠分選試劑盒（Stem cell公司）；3%葡聚糖硫酸鈉（DSS）；MEM-α培養基；胎牛血清（FBS）。

2 方法

2.1 MSCs的制備：根據實驗室前期制備MSCs的方法制備MSCs混合群細胞[8]。主要步驟為：①取C57BL/6小鼠股骨和脛骨，手術刀片清理去除所有肌肉組織。骨頭放于研磨杯內研磨至骨髓釋放，加入PBS沖洗骨頭以去除骨髓，再次研磨和沖洗，直到骨頭全部變成白色。②加入0.5%Ⅰ型膠原酶混勻后，搖床上37℃消化1 h，然后取70 μm孔徑濾網，過濾消化后骨混合物，收集過濾液，用ACK裂解紅細胞后PBS洗滌三次，獲得骨相關間充質干細胞。③使用間充質干細胞免疫磁珠富集試劑盒將骨相關細胞中的血細胞（CD45+細胞和Ter119+細胞）去除，獲得骨相關MSCs混合群細胞。

2.2 CD166+MSCs的制備：將得到的骨相關MSCs細胞轉入5 mL試管中并計數，然后按照CD166磁珠分選試劑盒要求加入適量的分選緩沖液以及標記緩沖液和磁珠。按照磁珠分選試劑盒的操作要求進行細胞分選獲得CD166+MSCs亞群。

2.3 CD166+MSCs的鑒定：將分選得到的細胞計數，取適量細胞轉入流式管中，1 500 r/min離心5 min后棄上清。在20 μL流式緩沖液中加入抗CD45，抗Ter119，抗CD166混勻。將上述預混的流式抗體加入到所得的細胞沉積中，2～8℃染色20 min，流式緩沖液重懸后1 500 r/min離心5 min，細胞重懸于300 μL流式緩沖液，流式細胞儀上機分析。

2.4 MSCs的培養：MSCs在含有15% FBS的MEM-α培養基中，接種在12孔板中，培養密度為2×105個細胞/孔。在37℃、5%CO2的培養箱中培養。

2.5 小鼠IBD模型的建立：根據實驗室已建立的成熟方法[8]，主要步驟是① 取C57BL/6小鼠10只，平均分成兩組，一組自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液7 d，隔天換入新的DSS溶液；另一組自由飲用消毒后普通水7 d。② 每天觀察、記錄兩組模型小鼠的一般情況、體重、糞便、隱性或顯性出血情況以及活動力，并根據臨床評分標準（表1[8]）進行評分。

表1 IBD小鼠模型臨床評分標準

2.5 CD166+MSCs細胞輸注治療：①將上面獲得的CD166+MSCs通過靜脈注射方式，給予IBD模型小鼠進行輸注治療。輸注量為5×105/只。②每日稱量小鼠體重，觀察大便性狀及血便情況，并參照上述方法做臨床評分。③移植輸注3 d后，處死小鼠，解剖結腸，并做病理切片組織染色分析。

2.6 結腸組織石蠟切片及H&E染色：將小鼠的結腸取出后，在PBS中沖洗干凈，放入4%多聚甲醛中固定24 h；用ddH2O沖洗掉固定液，分別在30%、50 %、70%、80%、90%濃度梯度乙醇中進行脫水40 min；將組織放入無水乙醇和二甲苯1∶1比例混合液中15 min，再放入二甲苯30 min；放入二甲苯和石蠟1∶1比例混合液中15 min，接著按順序放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ中透蠟30 min； 使用石蠟包埋經過透蠟的組織，投入冷水中，使其凝固成蠟塊； 進行切片并將其貼在載玻片上；切片經二甲苯脫蠟5 min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%梯度乙醇溶液中各5 min，再放入ddH2O中3 min；將切片放入蘇木精中染色5 min，自來水沖洗2 min，放于5%乙酸醇溶液中分色40 s；自來水沖洗切片直至切片變藍，吸除水分后伊紅染色5 s，70%、80%、90%、95%、上行酒精梯度脫水5 s，放無水乙醇中1min，二甲苯處理5 min；晾干，蓋玻片和中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結果。

3 統計學方法 所有數據均采用SPSS16.0軟件進行統計分析，結腸長度、 組織病理學評分和臨床評分等計量資料以表示，各組間比較采用獨立樣本t檢驗，當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

結 果

1 CD166+MSCs的鑒定 取C57BL/6小鼠股骨和脛骨，按照圖1的方式制備CD166+MSCs亞群。流式分析CD45+、Ter119+細胞的含量，圖2A結果顯示CD45+、Ter119+細胞的比例僅為0.088%和0.056%。說明我們成功分離出CD45-/Ter119-MSCs細胞。使用CD166陽性磁珠分選后進一步流式驗證CD166+MSCs的純度，圖2B說明成功分選獲得了CD166+MSCs亞群。CD166+MSCs經過7 d培養后如圖2C所示，說明分選的CD166+MSCs活性較好。流式檢測CD166標記陽性率可達90%以上，說明培養7 d后CD166+MSCs未分化。

圖1 CD166+ MSCs分選流程圖

圖2 CD166+MSCs的分選鑒定情況

2 CD166+MSCs抑制了IBD模型小鼠的血便和體重減輕 為了探究CD166+MSCs對IBD的治療效果，我們嘗試將CD166+MSCs靜脈輸入小鼠體內，對照組輸注PBS，如圖3所示。每天觀察IBD模型小鼠活動力、大便情況。根據表1 IBD小鼠模型臨床評分標準，評定各組小鼠的臨床評分，結果顯示對照組與CD166+MSCs處理組的臨床評分分別為（4.967±0.291）和（3.200±0.1732），臨床評分均數比較采用獨立樣本t檢驗，t=5.222，P＜0.01，如圖4A。初步說明CD166+MSCs對IBD具有一定的治療效果。

圖3 IBD小鼠處理模式圖

圖4 CD166+MSCs移植輸注的治療效果

3 CD166+MSCs改善了IBD模型小鼠結腸的縮短和組織學評分 為進一步驗證CD166+MSCs對IBD的治療效果，我們處死小鼠，解剖結腸，并做病理切片組織染色分析。結果顯示，對照組與處理組結腸長度分別為（6.433±0.404）cm和（8.267±0.252）cm，P＜0.01，如圖4 B&C。并且處理組的組織病理學切片中的隱窩破壞較少，杯狀細胞增多，對照組與處理組的組織病理學評分分別為（6.133±0.203）和（3.067±0.145），P＜0.001，如圖4 D～E。以上結果提示了CD166+MSCs對IBD具有明確的治療效果。

討 論

炎癥性腸病的發病與遺傳傾向、免疫失衡、環境、感染、飲食、人種、地域等多個因素相關。近20年來，IBD患者在我國有明顯增多趨勢，增多的原因被認為與經濟快速發展、城市化進程及環境飲食變化有關[9]。IBD常用的治療藥物有：氨基水楊酸、激素、硫唑嘌呤、環孢素、沙利度胺以及英夫利昔單抗、阿達木單抗、維多珠單抗等生物制劑[10-14]，選擇性白細胞吸附療法和糞菌移植也有一定療效[15-16]，但迄今為止，仍無治愈IBD的藥物和方法。

MSCs來源廣泛、且在體外的增殖能力強，具有向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞分化的多向潛能，還具有免疫調節功能，在多種難治性疾病中受到廣泛關注。另外在創傷修復、貧血、移植等領域內具有極高的臨床應用價值，已成為各類疾病治療研究的熱點。此前已有多項研究將MSCs應用于IBD治療，YAN等[17]用IL-35-MSCs，MSCs和鹽水處理IBD小鼠模型，發現IL-35-MSC處理小鼠的結腸長度明顯長于其他兩組，炎癥明顯減輕，認為間充質干細胞表達IL-35通過抑制黏膜免疫反應保護結腸。XU等[18]從人胚胎干細胞中生成了表型一致的間充質干細胞，并發現靜脈輸注MSCs能夠提高循環胰島素樣生長因子1（IGF-1）水平，IGF-1的增加維持了上皮細胞的完整性，并促進其修復和再生，從而減輕小鼠結腸炎。YANG等[19]發現人誘導性多能干細胞來源的MSCs以AKT信號依賴的方式通過透明質酸- CD44相互作用，通過腫瘤壞死因子-α-刺激基因6促進小鼠結腸炎模型上皮細胞增殖，加速黏膜愈合。本實驗室前期也證實了MSCs對IBD有一定的治療作用，但是效果并不穩定，推測可能是由于MSCs具有多種亞群，而不同的亞群的功能存在差異，導致最終治療效果不穩定。因此，本研究分離純化其中的一個亞群即MSCs CD166+亞群。為了探究該亞群的治療效果，我們構建了IBD小鼠模型，將分選的CD166+MSCs亞群注射入模型小鼠，與未進行MSCs亞群細胞移植治療的IBD模型小鼠相比，IBD模型小鼠的臨床評分、結腸長度以及結腸組織病理情況都有好轉。說明CD166+MSCs可獲得較顯著的臨床治療效果。

綜上所述，本研究的結果證明CD166+MSCs能有效抑制小鼠IBD的繼續發展，改善結腸的形態和功能，具有較顯著的治療效果。但是，未分選的MSCs治療效果不穩定的具體機制如何，本研究并未闡明。且目前MSCs治療IBD主要集中在動物實驗，臨床研究尚缺乏有力證據。因此，下一步的研究重點是探究CD166+MSCs發揮作用的效應分子以及信號轉導通路，為MSCs臨床合理化應用提供實驗基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突