冰凍紅細胞質量評價指標專家共識

國防科技創新特區重點項目專家組

紅細胞在深低溫或超低溫（-80℃或-196℃）條件下將處于凍結狀態，其生理代謝和化學反應幾乎完全停止，因此相比4℃冷藏保存，低溫冰凍儲存的紅細胞，其血紅蛋白結構、細胞膜狀態以及胞內能量物質都幾乎不受儲存時間的影響，可實現真正意義上的長期保存[1-2]。1987年9月，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準，-80℃條件下甘油化紅細胞可冰凍保存10年，VALERI等人也報道了經過21年、37年冰凍保存后的甘油化紅細胞在完成復溫洗滌處理后質量仍符合臨床使用標準[3-4]。目前國內血站通常將冰凍紅細胞保存技術應用于Rh陰性和類孟買等稀有血源保存，可有效保存稀缺的血液資源，減少因儲存時間短而引起的稀缺血液資源過期報廢[5]。近年來，越來越多的血液中心建立了常規紅細胞冰凍保存儲備庫，應對國家重大事件的應急血液保障需求。

然而，在紅細胞凍存保存過程中也存在多種儲存損傷，其主要來源于添加和去除保護劑過程中的滲透損傷，冰凍過程中的溶液損傷和胞內冰晶損傷，復溫過程中的重結晶損傷等[6]。常用的紅細胞凍存劑和凍存方法主要有：40%高濃度甘油儲存在-65℃及以下冰箱中，20%中濃度甘油儲存在-120℃以下的液氮中，14%低濃度甘油儲存在-150℃液氮中[1，7]。還可以采用非滲透性冰凍保護劑在冰凍前脫水紅細胞，如羥乙基淀粉（Hetastarch，HES）[6-12]，聚乙烯吡啶烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）[13-14]，海藻糖[15-18]和右旋糖酐。與此同時，針對紅細胞凍存過程中產生的低溫損傷，研究者們嘗試探究紅細胞低溫保存新方法，如開發新型低溫保護劑：滲透壓調節劑[16-17，21-22]、海藻酸鈣水凝膠纖維[13]等；采用紅細胞的冰凍干燥新技術胞內遞送海藻糖，如冰凍或者滲透壓誘導的膜相變、聚合物或者多肽誘導的膜通透性調節劑、溶血素類的成孔劑、脂質體等，或納米顆粒封裝遞送、電穿孔及超聲輔助等[22-23]；開發冰晶重結晶抑制劑如小分子化合物、高分子聚合物、聚兩性電解質及其他納米材料等[24]。

在面對需大量紅細胞資源搶救傷員的自然災難或戰創傷急救等特殊情況時，建立紅細胞儲備庫顯得尤為重要。輸注具有良好功能的紅細胞能夠快速改善貧血，糾正重要臟器氧供不足，提高輸注療效。當前冰凍紅細胞的價值受到重視，在我國臨床應用也越來越普遍，雖目前國家標準GB18469-2012對冰凍解凍去甘油紅細胞的質量控制項目和要求進行了規定，提升其安全性，但其中尚未包括提示其輸注有效性的諸多質量指標。筆者組織全國臨床輸血、輸血醫學及低溫生物學等領域專家共同編寫了“冰凍紅細胞質量評價指標專家共識”，建議在臨床及實驗室使用冰凍紅細胞前抽樣檢測各項指標，評估冰凍紅細胞質量。其意義在于：一方面，保證臨床輸注冰凍紅細胞的安全性和有效性，減少因低溫儲存損傷引起的輸血不良反應；另一方面，為業內研究者們評價和改進新型紅細胞低溫保存技術提供參考。筆者參考國內外凍存紅細胞標準，例如國家標準“全血及成分血質量要求GB18469-2012”、北京市紅十字血液中心編撰的《全血成分血質量要求與血液標準化》、國務院衛生行政部門印發的《血站基本標準》、國衛醫函【2019】98號附件《血站技術操作規程（2019版）》；還有來源于歐洲輸血委員會的譯著《血液成分的制備、使用和質量保證指南（第20版）》、《AABB技術手冊（第20版）》、FDA及日本紅十字會制定相關標準/要求，結合現有臨床及實驗室制備和使用冰凍紅細胞經驗，在其質量評價指標及參考范圍方面，形成如下專家共識，以期保障臨床及應急使用冰凍紅細胞輸注的安全性和有效性。值得注意的是，本共識中提到的“冰凍紅細胞”是指經凍存保護劑冰凍、解凍、復溫、洗滌后并重懸，臨床使用前的冰凍紅細胞。具體內容如下。

1 推薦項目及參考范圍[7，25-34]推薦項目包括：紅細胞外觀、容量與比容、無菌試驗、血紅蛋白含量及紅細胞計數等、洗滌后回收率、甘油殘留量、白細胞殘留量、游離血紅蛋白含量、紅細胞滲透脆性、pH值。凍存使用的紅細胞制品應符合HIV、HBV、HCV、梅毒感染標志物檢測的最終結論均為無反應性， ABO/RhD血型正確定型，ALT正常。

1.1 外觀：肉眼觀察應無色澤異常、溶血、凝塊、氣泡等情況；血袋完好，并保留注滿冰凍解凍去甘油紅細胞經熱合的導管至少20 cm。

1.2 容量與比容：來源于200 mL全血：200 mL±20 mL ；來源于300 mL全血：300 mL±30 mL ；來源于400 mL全血：400 mL±40 mL。值得注意的是，容量大小受到洗滌設備的影響，目前設備離心杯容量大多是250 mL±50 mL。紅細胞比容：一般要求洗滌后為0.35 ～ 0.70。

1.3 無菌試驗：無細菌生長。

1.4 血紅蛋白含量及紅細胞計數等：來源于200 mL全血：含量為≥16 g；來源于300 mL全血：含量為≥24 g；來源于400 mL 全血：含量為≥32 g。

紅細胞計數、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）和紅細胞體積分布寬度（RDW）等指標可通過血常規測量得出，數值以一般臨床要求為準。

1.5 洗滌后回收率：洗滌后冰凍紅細胞回收率≥75%。

冰凍紅細胞回收率=[（洗滌后血紅蛋白濃度×洗滌后容量）/（冰凍前血紅蛋白濃度×洗滌前容量）]× 100%

1.6 甘油殘留量：≤10 g/L。

1.7 白細胞殘留量：來源于200 mL全血：含量≤2.0×107個；來源于300 mL全血：含量≤3.0×107個；來源于400 mL全血：含量≤4.0×107個。

1.8 游離血紅蛋白含量：≤1 g/L。

或者紅細胞溶血率≤0.8%，紅細胞溶血率（%）=[（1－紅細胞比容）×懸浮液游離血紅蛋白濃度/總血紅蛋白濃度]×100%

1.9 紅細胞滲透脆性：紅細胞滲透脆性指紅細胞在低滲溶液中發生破裂以致溶血的特性，紅細胞對不同濃度低滲鹽水的抵抗能力與紅細胞表面積和體積比值有關，體積越大，該比值越小，抵抗力越小，即滲透脆性越大，可反映冰凍對紅細胞膜的影響。紅細胞鹽水滲透脆性試驗可反映紅細胞容量與表面積的比例，也與細胞內鈉、鉀平衡和糖酵解及紅細胞生理功能密切相關[35]，若凍融后的紅細胞膜結構不穩定，或保存過程中加入保存液時瞬時滲透梯度過高，紅細胞脆性增大，對低滲溶液抵抗力小，會使溶血率增高，紅細胞破壞嚴重，無法應用于臨床。操作程序推薦參照《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）要求[36]。也可以在低滲氯化鈉溶液中紅細胞50%溶血率時的濃度為滲透脆性測量值[37]，稱紅細胞中間脆性。該測量值越高，說明紅細胞對低滲鹽抵抗力越低，滲透脆性越大。根據文獻[38-39]，本共識推薦滲透脆性值不宜超過質量百分比濃度為0.56%氯化鈉溶液。

1.10 pH值：pH值是影響紅細胞能量代謝的重要因素，也是影響紅細胞變形性的外部因素之一，凡細胞內的生化改變均受到血液pH值的影響，因此評價凍存紅細胞質量時血液pH值應加以監測。有研究發現，隨著pH值的下降，紅細胞逐漸趨于增大和腫脹。當pH值＜4.0時，紅細胞腫脹明顯，部分呈溶解現象，出現典型的紅細胞鬼影；而當pH值＞9.0時，紅細胞則出現皺縮，出現鋸齒狀紅細胞。

血液pH值一般要求為血液酸堿度即血液內氫離子濃度的負對數值，紅細胞儲存液pH值檢測方法通常為離子選擇電極法[40]，也可采用血氣分析為參考方法。pH值檢測結果受溫度影響較大，4℃與37℃檢測結果會相差1單位pH值，室溫檢測結果在二者之間[41]。本共識中要求室溫下冰凍紅細胞使用前pH值在6.0～7.4之間[26]。在洗滌后24 h內使用的冰凍解凍紅細胞，一般重懸在生理鹽水中，其pH值不要求測試。

2 可選項目及參考范圍 根據紅細胞凍存原理、文獻調研及實驗研究，總結出以下指標提示凍存紅細胞質量及狀態變化，旨在指示紅細胞凍存后生理狀態以確認洗滌后是否符合輸注標準。以下指標可列入凍存紅細胞質量評價備選項目。

2.1 血小板殘留量：≤1%，殘余血小板（%）=（洗滌后血小板總數/洗滌前血小板總數）×100%。

2.2 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）：ATP對維持紅細胞膜上鈉鉀泵的運轉、紅細胞鈣離子內環境的恒定以及紅細胞膜脂質的不斷更新和啟動糖酵解等[40]，均有重要作用。紅細胞內ATP與其輸注后體內回收率（post-transfusion recovery，PTR）及細胞內氧化應激之間存在顯著的相關性[42-43]，是紅細胞能量代謝的重要指標。

ATP含量檢測有4種方法，包括熒光測定法、肌酸激酶法、高效液相色譜質譜串聯分析法和比色法[44]。熒光測定法是國際血液標準化委員會（International Council for Standardization in Haematology，ICSH） 推薦的標準方法，最常用的方法是比色法?？紤]到市場上不同試劑盒之間計量方式的差異，可對比凍存后紅細胞與其凍存前或新鮮紅細胞之間ATP測量值比值。一般推薦凍存后ATP應保留30% ～ 40%以上。

2.3 2，3-二磷酸甘油酸（2， 3-diphosphoglycerate，2，3-DPG） ：2，3-DPG是紅細胞內糖酵解途徑2，3-二磷酸甘油酸支路的產物，是血紅蛋白的變構調節劑[35]。紅細胞高濃度2，3-DPG可看作是能量的儲備。除此之外，2，3-DPG還與血紅蛋白相互作用并影響血紅蛋白對氧氣的親和力。2，3-DPG代謝分解導致血紅蛋白氧親和力和紅細胞向組織供氧能力降低。2，3-DPG也與細胞內氧化應激具有顯著相關性，其含量下降會誘導胞漿內抗氧化物質的形成，最終結果是膜脂質及蛋白質的氧化損傷[40]。

2，3-DPG含量檢測方法有等電速率法[46]、甘油示差水解法[47]和分光光度計比色法[48-49]，分光光度計比色法為常用方法。

2.4 磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）暴露率：PS暴露與紅細胞的促凝活性呈顯著正相關，是反映紅細胞膜損傷及氧化損傷的重要指標。紅細胞膜PS外翻暴露也是導致紅細胞凋亡及介導其體內被單核吞噬系統吞噬降解的信號之一。

PS暴露率檢測方法有使用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標記的膜聯蛋白-V（Annexin-V）[50]作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生，還有一些使用高效液相色譜法[51]，常使用Annexin-V檢測PS暴露率。

2.5 半氧飽和度分壓P50：血氧飽和度達50%時血液的氧分壓稱為P50，P50是反應紅細胞氧親和力的常用指標，是呼吸循環的重要生理參數。P50值越小，則紅細胞與氧親和力越大，紅細胞與氧的結合能力越強。一般使用全自動血氣分析儀檢測計算得出。實驗室大部分使用基于多波長光度法測定半氧飽和度分壓及氧解離曲線。紅細胞懸液的pH值、2，3-DPG含量及測量溫度等因素均對P50值有影響。常使用血氧分析儀[49，52]測定P50。

表1 冰凍紅細胞質量評價指標推薦項目及參考范圍

表2 冰凍紅細胞質量評價指標可選項目及參考范圍

2.6 紅細胞變形性：紅細胞變形性是影響血液表觀黏度和體內微循環及有效灌注的重要因素之一，同時又是紅細胞壽命的重要決定因素。紅細胞變形性是由細胞膜的黏彈性、胞漿的黏度（內黏度）、細胞的幾何形狀等內在因素決定的，紅細胞粘滯性與其生理功能密切相關。一般來說解凍后的紅細胞和新鮮的紅細胞一樣，為平滑的雙凹圓盤狀。然而，甘油在洗脫過程中主要由紅細胞通過緩慢的被動擴散釋放出來，當保護劑濃度不合適或洗滌方式不恰當時，紅細胞呈不規則細胞形狀萎縮，可見棘球狀紅細胞。嚴重時紅細胞發生的滲透性變化，可引起大量水進入紅細胞。

紅細胞的變形能力是影響血液流動和粘滯性的最主要因素，可利用黏度測定法、反向旋轉流變儀測定法、微孔濾過法、激光衍射法等間接地估計紅細胞群體的平均變形性大小。國內應用最廣的是粘性測定法和微孔篩濾法?？刹捎醚毫髯儗W測定儀檢測紅細胞變形指數、剛性指數和聚集指數等流變學特征[42]。

以上指標可結合必選指標評價凍存紅細胞質量變化，若在參考范圍內或與新鮮紅細胞比較無顯著性差異，則預示著較好的細胞形態及生理功能，為凍存紅細胞的安全有效輸注提供參考依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

本共識專家委員會由國防科技創新特區重點項目專家組牽頭，由全國各地輸血醫學研究及臨床輸血等領域專家組成，專家名單如下（以姓氏筆劃為序）：

丁國良（東營市中心血站）、于洋（中國人民解放軍總醫院第一醫學中心）、王小慧（中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院 衛生勤務與血液研究所）、尹文（中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院）、付涌水（廣州血液中心）、戎霞（廣州血液中心）、劉敏霞（中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院 衛生勤務與血液研究所）、李翠瑩（中國人民解放軍空軍特色醫學中心）、吳濤（中國人民解放軍總醫院第七醫學中心）、汪德清（中國人民解放軍總醫院第一醫學中心）、張雷（天津大學）、張玉華（中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院 衛生勤務與血液研究所）、周虹（中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院 衛生勤務與血液研究所）、周芙玲（武漢大學中南醫院）、查占山（中國人民解放軍海軍軍醫大學第一附屬醫院）、趙剛（中國科學技術大學）、胡興斌（中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院）、駱群（中國人民解放軍總醫院第五醫學中心）、袁曉燕（天津大學）、桂嶸（中南大學湘雅三醫院）、錢寶華（中國人民解放軍海軍軍醫大學第一附屬醫院）、欒建鳳（中國人民解放軍東部戰區總醫院）、黃遠帥（西南醫科大學附屬醫院）、梁聲強（中國人民解放軍聯勤保障部隊第909醫院）、蔣學兵（中國人民解放軍總醫院第六醫學中心）、韓穎（中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院 衛生勤務與血液研究所）、詹林盛（中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院 衛生勤務與血液研究所）、歐陽錫林（中國人民解放軍總醫院第四醫學中心）