南京地區無償獻血者戊型肝炎病毒篩查策略探討*

陳曉莉 馮雅頌 朱瑞 蔣昵真

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）為無包膜單鏈RNA病毒，屬于戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒屬，是全球范圍內引起急性肝炎的最主要病原體之一。HEV感染普遍，且多為無癥狀感染，近年來日本和歐洲報道了很多HEV經輸血及移植傳播的病例[1-3]，在輸血行業引起越來越多的關注。目前，英國、荷蘭和愛爾蘭已經實施了普遍的HEV RNA篩查。德國和法國對用于高?；颊叩难獫{進行HEV RNA篩查。西班牙的17個血庫中已有2個實施了普遍HEV RNA篩查，日本對北海道地區實施HEV RNA篩查。但也有部分發達國家考慮到當地流行率不高，并未開展，如：美國、丹麥、瑞典及澳大利亞[4-6]。我國尚未制定有關HEV的篩查策略，但已經進行了許多前瞻性研究，可能受限于成本及操作方面的考慮，目前國內的研究大多是檢測HEV IgM和IgG抗體[7-8]或在抗體陽性基礎上進行HEV RNA或HEV Ag的檢測[9]。但是有研究表明，血清學檢測并不能為血液制品是否含有HEV RNA提供足夠的證實證據[10-11]，檢測HEV RNA仍然是確認病毒血癥的金標準[12]。同時，隨著HEV Ag檢測方法不斷改良發展，其靈敏度和特異性大大提高，對于血液篩查和急性戊肝診斷有很好的應用價值。HEV RNA及HEV Ag可作為戊肝現癥感染的指標，說明存在戊型肝炎病毒感染[13]。結合國外篩查策略，故本次研究聯合使用HEV RNA及HEV Ag對2020年10月～2021年6月南京地區獻血者進行普遍性篩查，評估南京地區獻血者戊肝病毒的現癥感染情況，并為是否需要將戊型肝炎納入本地區的血液篩查項目及其篩查策略的選擇提供數據支持。

材料與方法

1 標本 2020年10月～2021年6月無償獻血者標本26 048人份，這些標本均經過血清學常規篩查（HBV、HCV、HIV、TP及ALT），其中檢測項目全部合格25 869人份，ALT不合格（＞50 U/L）179人份。

2 儀器與試劑 STAR全自動加樣系統（瑞士Hamilton公司），全自動酶免工作站FAME24/20（瑞士Hamilton公司），科華HEV核酸檢測系統，AU480全自動生化儀，戊型肝炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（上?？迫A生物工程股份有限公司），戊型肝炎病毒抗原檢測試劑盒（ELISA）（北京萬泰生物藥業股份有限公司）（僅供研究使用），戊型肝炎病毒IgG抗體檢測試劑盒（ELISA）（北京萬泰生物藥業股份有限公司），戊型肝炎病毒IgM抗體檢測試劑盒（ELISA）（北京萬泰生物藥業股份有限公司），奧林巴斯ALT檢測試劑盒，HEV RNA質控品（由國家衛生健康委臨床檢驗中心提供）。

3 實驗方法

3.1 HEV的篩查流程：檢測流程見圖一，凡HEV Ag反應或HEV RNA拆分反應者進行抗體補充實驗并隨訪。HEV抗原及抗體檢測均采用酶聯免疫吸附法檢測，操作嚴格按照說明書，檢測OD值≥臨界值（CUTOFF）者判為陽性。HEV RNA采用PCR-熒光探針法，測定結果CT值＜40，表示該樣本為HEV RNA反應性。

圖1 戊型肝炎病毒篩查流程圖

3.2 獻血者隨訪：獻血者首次被檢出HEV RNA病毒及HEV Ag的時間被定義為第0天，間隔1～3月左右至少進行1次隨訪，隨訪至HEV IgM抗體轉陰時結束。隨訪時采集標本分別進行HEV RNA單人份檢測、HEV Ag以及HEV IgG/IgM抗體、ALT檢測。隨訪時詢問獻血者有無從事農業養殖活動、有無生食飲食習慣，有無戊肝疫區接觸史等情況。

3.3 HEV IgG抗體篩查：從26 048人份標本中隨機抽取無償獻血者標本2 552人份同時進行HEV IgG抗體篩查。

結 果

1 戊肝篩查反應性檢測結果 在26 048人份獻血者標本中，共檢出3例HEV RNA反應性，反應性率為0.12‰；檢出2例HEV Ag反應性，反應性率為0.08‰，此5例反應性獻血者的ALT均小于50 U/L。對這5例HEV反應性獻血者標本再補充HEV IgM和IgG 抗體檢測，結果見表1。此外，26 048人份標本中含179例ALT均大于50 U/L（50.1 U/L～95.7 U/L），其HEV RNA及HEV Ag檢測均無反應性。

表1 戊肝篩查反應性獻血者信息及其檢測結果

2 戊肝篩查反應性獻血者的隨訪結果 5例中的D、E兩位HEV Ag反應性獻血者由于本人不愿意配合而失訪，剩余3例HEV RNA反應性獻血者A、B、C隨訪成功，隨訪結果見表2。值得注意的是，被隨訪的幾名獻血者無從事農業養殖活動、無生食飲食習慣，無戊肝疫區接觸史，但均表示有外出烤肉店就餐史。

表2 HEV RNA反應性獻血者隨訪檢測結果

3 南京地區部分健康人群中HEV IgG抗體反應性率 2 552人份獻血者標本進行HEV IgG抗體篩查，共檢出530例反應性，反應性率達20.67%。

討 論

目前關于HEV感染的檢測主要借助病原學及血清學檢測，主要為HEV RNA、HEV Ag、HEV IgM及IgG抗體。戊型肝炎病毒的潛伏期約15～60天，感染后首先在血液和糞便中可以檢測到HEV RNA及HEV Ag，隨后出現HEV IgM抗體，持續時間相對較短，HEV IgG抗體出現在HEV IgM抗體之后。

HEV IgG抗體作為既往感染的指標，一般僅用于流行病學調查[14]，其在體內存在時間較長，在感染戊肝恢復后10年仍然可以檢測到[15]。在本次研究中，3例HEV RNA反應性獻血者A、B、C（表2）在篩查出時均已存在HEV IgM和IgG抗體，隨訪可見HEV RNA最先轉陰，其次是HEV IgM抗體分別在隨訪156天、62天、87天轉陰，而未見HEV IgG抗體轉陰，最長的第156天時仍存在HEV IgG抗體。根據2011年日本北海道[4]的數據報道，合格獻血人群中HEV IgG抗體陽性率為3.4%，西班牙獻血者的HEV IgG指標陽性率高達20%[6]，對這類人群并未采取屏蔽。如果以IgG這一既往感染的指標屏蔽或延期這類獻血者將會大大影響到血液供應。此外，也有不少研究提示HEV IgG抗體可能是一種保護性抗體：一項通過恒河猴的實驗得出高濃度的IgG是預防HEV再感染的重要因素[16]，在戊肝疫苗的一項研究中也發現74.41%的疫苗接種者可檢測到HEV IgG抗體[17]。因此，不宜使用HEV IgG抗體作為戊肝輸血風險的篩查指標。

HEV IgM抗體是HEV近期感染的標志物，從獻血者的隨訪結果看，IgM抗體與HEV RNA在時間上存在交集，但是IgM抗體的轉陰均晚于HEV RNA，即體內HEV RNA清除后IgM抗體仍然存在。有報道稱，有的個體其IgM抗體在戊型肝炎恢復后存在5個月的拖尾期[13]，甚至長達3年[18]。因此，如果用IgM抗體作為篩查項目，則可能會將一部分早期感染恢復者誤判為現癥感染者。其次，在免疫系統受到抑制和慢性HEV感染者中通常也檢測不到HEV IgM抗體，這些都使得IgM指標診斷戊肝的特異度降低，很難作為血液機構篩查戊肝的可靠指標。再次，國際上有關戊肝抗體的商品化試劑，不同廠家的抗體陽性率差異可達10倍以上[19]，且重復性差，抗體試劑盒檢測的靈敏度和特異性有待進一步提升。這可能也是國外血液機構對HEV僅進行核酸檢測而不進行抗體篩查的原因之一[5-6]。

HEV RNA檢測對戊肝診斷具有高靈敏度和高特異性，尤其對于慢性戊肝患者以及免疫功能低下人群有著極大的優勢，是戊肝診斷的“金標準”[13，20]，本次篩查出3例HEV RNA反應性獻血者，其中獻血者B的混樣檢測CT值達到36.41，通過隨訪證明確為真陽性，可見HEV RNA檢測對低病毒載量的標本仍能檢出。HEV Ag是戊肝現癥感染的另一個指標，存在于急性戊肝感染的早期階段，在慢性戊肝感染中可能持續更長時間。目前，戊肝抗原診斷試劑經過不斷優化，達到了95.24%的靈敏度及98.75%的特異性[21]，尤其在急性肝炎、肝衰竭、免疫抑制及爆發人群中，表現明顯優于商業化的HEV IgM抗體試劑。從本次研究的HEV RNA、HEV Ag的篩查結果看，兩種篩查指標結果存在不一致，這兩種方法不可互相替代。HEV RNA反應性獻血者的HEV Ag呈非反應性，分析原因可能是抗原被中和導致，因為3位獻血者體內均已存在HEV IgM和IgG兩種抗體。2例HEV Ag反應性獻血者的HEV RNA、HEV IgM、IgG抗體均呈非反應性，與廈門地區一項研究中4例HEV Ag反應性獻血者，核酸及抗體均無反應性相一致[22]，可能這類獻血者處于感染早期，病毒載量較低，而且戊肝是RNA病毒，容易降解，因此抗原反應性者體內反而檢測不到HEV RNA。當然，也不排除HEV Ag是假反應性的可能。遺憾的是2例HEV Ag陽性獻血者因本人不愿意配合而失訪，未能開展后續的驗證實驗。

既往有研究認為ALT檢測可作為HEV感染的篩查指標[23]，在本次研究的26 048名獻血者中共有179例標本為單純ALT不合格，均未發現HEV RNA、HEV Ag呈反應性；而本次篩查出的HEV感染獻血者的ALT均為正常。本次研究結果與日本SAKATA等人[24]的研究結果一致，說明ALT篩查對HEV感染的獻血者可能是一個不敏感的篩查指標，不宜用于篩查。

對HEV RNA陽性獻血者隨訪發現3例獻血者在獻血前均存在烤肉食用史，這種感染可能與攝入含病毒的未煮熟的食物有關。根據檢出人群性別結果顯示，男性與女性戊肝現癥感染率之比為3∶2，男性感染概率更大，可能與社交活動、職業選擇以及生活方式的差異有關。在本次研究中戊肝的現癥感染者覆蓋各年齡層，與文獻中報道的中老年人戊肝發病率較高[25]不一致，可能是因為本文研究對象為獻血人群，年齡限制在18周歲～55周歲，已經剔除了老年人這部分人群。南京獻血人群戊肝感染者多為職員，與其他報道的感染人群多從事養殖、農業活動[25]有所差異，這種差異的主要來源為南京城鎮化率較高，企事業單位和學生為獻血主要人群。

中國醫學科學院輸血研究所系統分析了五個電子數據庫22項獨立研究的14篇文章，最終結果顯示

中國獻血者HEV IgG、HEV Ag、HEV RNA的陽性率分別為29.2%、0.1%、0.1%[26]。在本次研究中南京市獻血者IgG抗體陽性率為20.67%，HEV Ag反應性率為0.08‰，HEV RNA反應性率為0.12‰，南京HEV Ag、HEV RNA的陽性率遠遠低于全國數據庫的研究結果，反映南京地區戊肝病毒感染處于一個低水平狀態，輸血感染HEV的風險較低。當然，VOLLMER等人[27]發現，與核酸混檢相比，核酸單檢的檢測率要高出約50%，本實驗中核酸檢測采用6混樣模式，有存在漏檢的可能性。本次研究未滿一整年且HEV IgG抗體篩查僅隨機抽取部分人群，導致本文在戊肝流行病學特征研究方面有所欠缺；同時，隨訪策略需要進一步優化，有助于提高隨訪成功率。

綜上所述，HEV RNA及HEV Ag聯用可作為戊型肝炎的血液篩查指標；南京地區作為戊型肝炎的低流行地區，尚無必要在現有血液篩查基礎上增加HEV篩查。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突