微量法和傾注接種法對金黃色葡萄球菌計數的影響

樓津圻 王媛 蔡玲斐 康艷華

杭州師范大學，浙江 杭州 311121

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種臨床常見的呼吸系統疾病，主要以肺水腫、肺上皮和內皮細胞損傷為病理特征［1］。細菌感染是造成ALI/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的主要誘因［2-3］。金黃色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）感染引起的ALI由于缺乏有效的藥物與干預措施，其死亡率居高不下，已成為危重癥患者死亡的主要原因［4］。耐藥菌感染是危重病領域面臨的棘手難題，給臨床抗感染治療帶來巨大挑戰。近年來，從MRSA感染的致病機制和機體免疫防御角度探尋新的治療靶標頗受關注，但其確切機制仍有待闡明。在研究過程中感染模型的構建、組織器官的細菌載量以及固有免疫細胞對細菌的吞噬殺傷功能的檢測等都是影響實驗結果穩定、可靠的關鍵環節。而準確的細菌定量在此環節中起著決定性作用。

細菌定量主要通過測定活菌數來實現。目前國內外使用較為普遍的活菌計數方法是平板菌落計數法，然而該方法在實際操作過程以及結果統計方面存在著很大爭議。國內學者不斷的探索新方法、新策略來排除各種影響及干擾因素，比如改進試驗樣本的稀釋方式、菌種的繁殖方式、接種方式以及計數方法等［5-9］。本研究采用傾注法和微量法培養細菌，比較兩種不同接種方式對活菌總量的影響；同時應用可見光分光光度計檢測菌懸液的吸光度，探討微量法接種培養的細菌總量與菌液吸光度之間關系，建立標準曲線，以便快捷穩定的計算細菌濃度，提高工作效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 自控手提式壓力蒸汽滅菌器、霉菌培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；數顯恒溫浴鍋（上海碩光電子科技有限公司）；生物安全柜（Thermo公司）；721型可見分光光度計（上海菁華科技有限公司）；營養瓊脂、營養肉湯培養基（杭州濱和微生物試劑有限公司）；哥倫比亞血瓊脂平板（杭州怡丹生物技術有限公司）。

1.2 菌種MRSA USA300菌株由杭州師范大學基礎醫學院免疫與病原生物系實驗室分離并保存。

1.3 菌種復蘇與培養 取出-80℃冰箱中保存的MRSA USA300菌株甘油管，冰上自然溶解，挑取少量菌液劃線接種于血瓊脂平板上，37℃恒溫培養箱培養過夜。次日挑取具有透明溶血環的單克隆菌落再次接種血瓊脂平板上，37℃恒溫培養箱培養18～24h后，備用。

1.4 菌懸液的配制 刮取血平板上的菌苔置于10mL無菌生理鹽水中，吹打混勻配成菌懸液。

1.5 細菌的接種與計數

1.5.1 傾注平板接種法。在試管中將菌懸液進行10倍系列稀釋。取稀釋度為10-5、10-6、10-7、10-8的菌液各1mL接種于無菌培養皿中，將10mL冷卻至45℃左右的普通瓊脂培養基倒于已加入菌液的培養皿中，并輕輕轉動使其與菌液均勻混合，待凝固后置37℃培養18～24h后，觀察菌落生長狀態，拍照并用ImageJ軟件對平板上的菌落進行計數［10］。見圖1。每個稀釋度接種3個平板，并計算同一稀釋度的平均菌落數。

圖1 ImageJ軟件統計菌落數目的示意圖

1.5.2 微量滴注接種法。使用96孔板將原液進行10倍系列稀釋。取同樣稀釋度的菌液各0.01mL滴注于普通瓊脂平板表面，每個梯度點種3個重復，待菌液被完全吸收后，倒置放于37℃培養箱中培養18～24h。次日，觀察平板上的菌落生長狀態，并采用傳統的人工計數。

1.6 微量滴注接種培養平板計數法與菌懸液吸光度值之間的相關性 取稀釋度為10-6的菌懸液作1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5稀釋，以無菌生理鹽水作對照，分光光度計測定波長600nm處的吸光度（OD600）值，同時取0.01mL菌懸液采用滴注接種培養法進行平板計數，每個稀釋度做3個重復。記錄OD600值，稀釋倍數和相應菌落數，并建立金黃色葡萄球菌菌懸液與吸光度值間的線性關系。

1.7 統計學處理 采用GraphPad Prism 7軟件，數據以均數±標準差（）表示，通過Ordinary one-way ANOVA進行組內分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種接種方法菌落特征的比較 培養相同時間后，傾注法接種培養的平板上菌落大小不一，位于瓊脂深層的菌落小且形態不規則，瓊脂表層的菌落大小一致，呈圓形凸起且色素明顯；菌落分布不均勻，部分菌落生長在培養基邊緣的深層（圖2A）。相比之下，微量法接種培養的平板上菌落大小一致，呈金黃色的圓形凸起且均勻分布于接種區域的瓊脂表面（圖2B）。

圖2 兩種接種方法培養細菌菌落形態

2.2 兩種接種方法培養細菌總數的比較 細菌總數的計算公式分別按：N×稀釋倍數（傾注法）和N×稀釋倍數×100（微量法）計算，N為菌落個數。結果表明，隨著稀釋倍數的增加，兩種接種方法在10-6，10-7稀釋度時所統計的菌落個數呈遞減關系，10-8時的菌落數與10-7相比僅呈減少趨勢。而從不同稀釋度的細菌總數層面來講，微量接種法三個不同稀釋度所得的細菌總數在同一數量級，組內差異無統計學意義（P＞0.05），傾注接種法記錄的三個不同稀釋度的細菌總數呈遞減趨勢且組內統計差異有統計學意義（P＜0.05），提示與微量接種法相比，傾注接種法對細菌總數具有不穩定性，這可能與菌落形態形成有一定關系。見表1。

表1 不同接種方式培養的細菌總數

2.3 菌懸液在600nm處的吸光度值與活菌數量之間的相關性 用GraphPad Prism 7軟件對獲得的數據進行相關性分析，以微量法接種培養的計數結果為縱坐標（Y，×108cfu/mL），對應的菌液在600nm處的光密度值為橫坐標（X），得出細菌濃度的線性回歸方程為Y＝7.996X+0.183，Pearson相關系數的平方為0.995，線性范圍為0.233～6.433（×108cfu/mL）。見圖3。

圖3 MRSA濃度與OD600值的線性關系

3 討論

近年來，MRSA引起院內感染日益增多，由于MR－SA 的廣泛耐藥性，其感染后的治療問題已成為當前臨床以及科學研究中的難題。在開展相關研究的實驗（如造模時的攻毒劑量、感染模型中組織器官的細菌載量、固有免疫細胞中細菌的存活率等）中，需要進行準確細菌計數才能得到穩定和可靠的實驗結果。目前，平板菌落計數是微生物實驗教學、科研以及生產實踐中最常用的活菌總數測定方法，然而計數結果的準確性與接種方法之間的關系一直備受關注［11-12］。此外，本實驗以MRSA 為待測菌株，采用傾注法與微量法接種培養，從菌落形態、計數測定方式、計數準確性方面比較了兩種方法的差異，并使用光密度法探討了菌懸液的吸光度與細菌總量之間的相關性。

本研究對兩種接種方法培養的菌落形態進行了比較。培養相同時間后，相比傾注法培養的菌落，微量法接種培養的菌落大小一致，形態均一，色素明顯，極易判斷是金黃色葡萄球菌。對于來源于肺泡灌洗液或肺組織勻漿液等標本，如果采用傾注接種法培養細菌，很難從形態上判斷出感染細菌的類型，而微量滴注接種則具有顯著的優勢。

本研究對細菌總數進行了統計，結果表明微量法接種培養的細菌總數高于傾注法，盡管兩者在同一數量級，但具有兩倍的差異。在統計細菌總數時，借鑒并改進了黃曉輝等［10］報道的方法。不僅使數據來源更加科學、可信，而且節省大量的人力、物力與時間［9］，拍照取樣只能統計平板底部的菌落，忽略了平板邊緣深層或深層與底部重疊的菌落，這可能是導致總數偏低的原因；另外，傾注法對瓊脂培養基溫度的控制是個難點，如果培養基溫度過高會影響細菌的存活，這也是導致細菌總數偏低的另一原因，因此該方法對操作者的技術要求相對較高。微量法接種培養的細菌，由于菌落生長在瓊脂的表面，在適當的稀釋倍數下能清楚地數出菌落個數，菌落粘連程度不大，計數結果比較穩定，但是該接種方法對稀釋比例要求較高，如果稀釋倍數過低，會導致菌落粘連在一起，不易計數，如果稀釋倍數過高，有可能長不出菌落。在試劑和耗材的消耗方面，微量法優于傾注接種法。一個瓊脂平板上，微量法可以同時檢測出6～9 個稀釋梯度的菌落數，節省了大量的培養基和培養皿，減少了工作量，節省大量的時間，尤其是樣本量較大時。

有不少研究者通過光電比色法、酶聯免疫檢測儀、紫外－可見光分光光度［13-16，17］測定法對菌懸液的光密度值與細菌的數量之間的關系進行了探討，發現兩者之間存在線性相關，然而這種相關性可能受細菌的種類、大小、色素等因素的影響。本研究結合微量法培養的細菌計數分析了MRSA 在OD600處的光密度值和活菌數量之間的線性關系。研究顯示，菌懸液的光密度值與細菌總數之間呈良好的線性相關，相關系數平方值為0.995。由此，可以通過線性回歸方程準確地進行細菌定量，提高實驗的準確性和可重復性。

本研究通過分析兩種不同的接種方法比較了對金黃色葡萄球菌活菌計數的差異。微量滴注法具有操作簡便，省時省力、上樣量少、節省實驗耗材，且計數結果準確性高和重現性好等優勢。同時可采用相應的回歸方程精確地進行細菌定量，縮短實驗周期，增加實驗結果的穩定性和可靠性。