血清熱休克蛋白90α與甲胎蛋白異質體檢測對肝細胞肝癌的診斷價值研究

楊麗萍 毛寶宏 梁勤 楊建忠 馬國珍

1.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌的一種主要病理學類型，約占85%～90%［1］。世界范圍內，HCC仍然是發生和死亡上升最快的癌癥之一，也是導致癌癥死亡的第三大病因［2，3］?，F有的研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）和/或丙型肝炎病毒（HCV）感染、酗酒、黃曲霉毒素污染等是HCC的主要危險因素，在亞太地區，HBV感染是導致HCC的主要病因［4］。近年來，隨著HCC早期診斷與治療技術的不斷發展，HCC患者生存時間有所增加，但長期預后仍然較差。有研究顯示［5］，如果HCC患者能早期診斷并盡早進入臨床治療，其5年生存率將超過60%。因此，早發現、早診斷能顯著降低HCC的疾病負擔，改善總體生存時間。目前，臨床最常用的HCC檢測生物標志物為甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），但其診斷特異度不高，容易漏診，診斷價值受限。熱休克蛋白90α（heat shock protein 90a，Hsp90α）是細胞中與應激損傷關系密切的一種分子伴侶蛋白，參與PI3K-Akt等相關通路，在HCC患者血清和組織中高表達［6］，可作為HCC的診斷和預后指標。為此，本研究通過對血清Hsp90α、AFP及甲胎蛋白異質體L3（AFP-L3）聯合檢測，分析其對HCC的診斷價值，為提高HCC的早期診斷提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 以2020年1月至2021年8月在甘肅省中醫院肝病科連續就診的113例HCC患者及165例慢性乙型肝炎患者為研究對象。納入的HCC患者均符合原發性肝癌規范化病理診斷標準［7］，慢性乙型肝炎患者符合最新慢性乙型肝炎防治指南中的病理學診斷標準［8］。排除標準：①合并有其他功能障礙性疾??；②轉移性肝癌；③合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染；④伴有自身免疫性疾??；⑤妊娠或哺乳期女性。選取同期在我院進行體檢的188例健康人群為對照組，排除各系統疾病患者，注意年齡、性別等一般特征的可比性。所有研究對象均知情同意后納入本研究，并經院倫理委員會批準。

1.2 研究方法 清晨空腹抽取研究對象靜脈血3mL，于2小時內送至檢驗中心，以4000r/min的轉速持續離心10min，分離血清。采用羅氏公司cobas 8000全自動電化學發光系統測定血清AFP-L3及AFP水平，當檢測結果大于原液檢測上限時，手動稀釋后重新上機測定。以酶聯免疫吸附法（普羅吉生物科技有限公司）測定血清Hsp90α水平。以上所有操作均嚴格按照儀器說明書逐步進行，相應標準品與質控品均由儀器配套試劑公司提供。以診斷性試驗的可靠性（診斷符合率）與真實性（靈敏度、特異度、約登指數），評價分析其單獨或聯合作用下對HCC的診斷價值，用ROC曲線比較其應用價值。

1.3 統計分析 采用SAS 9.4軟件建立數據庫進行統計分析，計數資料用率（%）表示，組間差異比較用χ2檢驗。計量資料用均數±標準差（）表示，多組間的差異比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。用O－rigin 9.2軟件繪制ROC曲線評價血清Hsp90α、AFP-L3及AFP在單獨或聯合作用下對HCC的診斷價值。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 組間基本情況 本研究共納入研究對象466例，其中HCC患者113例，慢性乙型肝炎患者165例，健康對照人群188例。60歲以上307例（65.88%），60歲以下159例（34.12%）；男性328例（70.39%），女性138例（29.61%）。經組間均衡性檢驗，三組研究對象年齡、性別、民族、文化程度及體質指數間的差異均無統計學意義（P>0.05），說明三組研究對象基線資料均衡可比。見表1。

表1 組間基本情況比較［例（%）］

2.2 組間血清腫瘤標志物水平 經方差分析，三組研究對象AFP、Hsp90α及AFP-L3差異具有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較后結果顯示，肝細胞肝癌組與慢性乙肝組的血清AFP、Hsp90α及AFP-L3的水平均高于健康對照組（P<0.05）。見表2。

表2 組間血清腫瘤標志物差異情況（）

表2 組間血清腫瘤標志物差異情況（）

注：a：肝細胞肝癌組與健康對照組兩兩比較P<0.05；b：慢性肝炎組與健康對照組兩兩比較P<0.05

血清腫瘤標志物 肝細胞肝癌組（n=113） 慢性乙肝組（n=165） 健康對照組（n=188） F P Hsp90α（ng/mL） 139.46±46.82a 73.41±16.40b 50.19±13.86 407.98 <0.001 AFP-L3（%） 27.49±11.58a 5.38±2.80b 2.34±1.09 686.12 <0.001 AFP（ng/mL） 247.48±119.13a 55.15±31.04b 11.23±4.40 549.013 <0.001

2.3 各腫瘤標志物單獨或聯合檢測對HCC的診斷價值分析 單一指標檢測診斷HCC時，AFP-L3的診斷符合率最高（85.16%），其約登指數也最大（0.687）。進一步聯合診斷分析顯示，當Hsp90α、AFP-L3及AFP檢測均陽性（串聯試驗）時，診斷肝細胞肝癌的靈敏度、特異度、診斷符合率、約登指數等均最大，分別為91.29%、93.42%、93.72%、0.847，提示三種血清標志物串聯試驗時，對肝細胞肝癌的診斷價值最高。見表3。

2.4 血清腫瘤標志物單獨或聯合檢測ROC曲線下面積比較Hsp90α、AFP-L3及AFP診斷HCC的ROC曲線分析顯示，三種血清標志物聯合檢測診斷HCC的曲線下面積最大（AUC=0.945），高于各指標單獨或聯合檢測的曲線下面積，見表3與圖1。經假設檢驗，與AFP曲線下面積相比（AUC=0.812），Z=5.205，P<0.001；與Hsp90α曲線下面積相比（AUC=0.806），Z=5.093，P<0.001，均具有統計學差異。與AFP+Hsp90α曲線下面積相比（AUC＝0.921），Z＝1.357，P＝0.087，差異無統計學意義，說明三種指標聯合檢測的診斷價值更高，但AFP+Hsp90α聯合診斷與AFP+Hsp90α+AFP-L3聯合診斷的效能差異無統計學意義。

圖1 Hsp90α、AFP-L3及AFP聯合檢測診斷HCC的ROC曲線圖

表3 Hsp90α、AFP-L3與AFP對HCC的診斷價值分析

3 討論

據統計，全球約有20億人感染HBV，其中有2.6億人目前仍處于持續感染狀態，每年由HBV感染引起的肝硬化和肝癌患者達88.7萬人，其中與HBV感染相關的癌變占19.20%［9，10］。作為全球范圍內發病率最高的癌癥之一，肝癌已成為繼肺癌和結直腸癌之后的世界第三大癌癥死亡原因［11］，而這其中絕大多數為HCC。由于缺乏早期癥狀和體征，大多數HCC患者在臨床上被發現時已是侵襲性腫瘤進展階段，嚴重影響了患者的預后。因此，發現一組特異性高、可靠性強的HCC早期診斷標志物已成為當下一個緊迫任務。

AFP是目前HCC輔助性診斷中常用的血清標志物，它會隨著肝細胞的再生而升高，在部分肝硬化及肝臟炎癥患者中也會出現不同程度的升高［12］，降低了AFP作為腫瘤標志物的特異性。近年來，隨著人們對AFP糖基化形式的不斷研究，發現血清中不同AFP糖基化特征不僅反映其數量的改變，而且能定性評估原發性肝癌表達的蛋白質［13］。美國FDA已將甲胎蛋白異質體比率（AFP-L3%）作為高特異性指標納入原發性肝癌的預警標志，并將AFP-L3%≥10%作為診斷原發性肝癌的臨界值。Hsp 90α是一種分子伴侶蛋白，廣泛參與轉錄調控、信號轉導等生理活動，在多種惡性腫瘤中均有異常表達。正常靜止的細胞不分泌Hsp90α［14］，但在輻射、缺氧等細胞環境改變的情況下，Hsp90α可分泌到細胞外，與Hsp70、轉化生長因子α（TGF-α）等組織損傷釋放的細胞因子共同影響腫瘤實體的微血管浸潤、侵襲、生長及轉移，這一過程很可能在肝細胞癌變的初期或前期就已啟動［6，14］。也有研究證實，使用Hsp90α抑制劑可顯著減少Hsp90α的過表達，阻止肝腫瘤細胞的增殖與分裂［15］。由此表明，Hsp90α不僅可作為HCC的早期診斷標志物，還可為其靶向治療提供理論支持。

本研究顯示，HCC患者血清Hsp90α與AFP-L3水平均高于慢性乙肝患者及健康人群。進一步分析發現，單一指標診斷HCC時，AFP的靈敏度最低（72.26%），Hsp90α最高（80.25%），而AFP-L3的特異度較好（90.46%）且約登指數最大，這與國內外相關研究結果類似［16］，提示血清AFP-L3能很好區分肝臟的良惡性病變，而Hsp90α在HCC患者血清和組織中表達較高。三種指標聯合診斷時，其靈敏度、特異度、約登指數均最大，經ROC曲線下面積比較具有統計學意義，說明聯合檢測能規避單一指標的檢測缺點，使靈敏度和特異度具有良好的互補作用，減少了HCC的誤診和漏診，顯著提升了診斷符合率，具有較好的臨床應用價值。

HCC的早期篩查與診斷具有重要的臨床意義，能較早選擇理想的治療方案，提高患者的生活質量，減輕了患者的疾病負擔。近年來，隨著轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學研究的不斷深入，使HCC的早期篩查與診斷逐漸成為可能。目前已報道能用于早期診斷HCC的血清標志物較多，但還沒有發現較為理想的組合篩查形式［17］。本研究結果表明，血清Hsp90α、AFP-L3及AFP聯合檢測可顯著提升HCC的診斷符合率，彌補單一檢測指標的不足，提高了HCC的早期診斷價值，具有臨床應用價值。