核酸適配體在腫瘤液體活檢中的應用

田彩平 李瑞 馬佰菁 閔建平 荊曉 楊碎勝

1.甘肅省醫學科學研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省腫瘤醫院，甘肅 蘭州 730050

眾所周知，癌癥是引起死亡的一個主要原因，也是世界性難題。若能早期發現腫瘤，就可以進行早期干預，從而提高療效，減少死亡，因此腫瘤的早期發現至關重要［1］。目前腫瘤標記物、醫學影像以及穿刺活檢是主要的腫瘤診斷方式，其中腫瘤標記物是檢測腫瘤生長過程中分泌到血液中的特異性蛋白質含量，醫學影像是借助X 光、CT、核磁等技術進行檢測病灶，穿刺活檢是通過穿刺或外科手術的方式取得腫瘤組織，這三種診斷方式均存在局限性，不能在腫瘤早期檢測到疾病信息而錯過最佳治療時機，從而導致腫瘤患者治愈率低，生存期短［2］。因此，尋求一種能夠在腫瘤早期階段方便檢測的方法至關重要。

新興的液體活檢可以實時反映原始組織的生理和病理狀態，能夠在疾病早期被檢測出來，可以方便無創的取樣。與傳統有創的活檢相比，液體活檢具有及時、個體化診療的優勢。然而，液體活檢在檢測靶標的有效分離、信號放大等方面存在不足，而核酸適配體由于其特殊的空間構象，可以進行修飾和組裝，從而可以進行信號放大，能夠彌補液體活檢存在的不足。本文從液體活檢的類型、優缺點，核酸適配體在腫瘤液體活檢中的應用、優缺點等方面進行綜述，為腫瘤的早期檢測提供參考依據。

1 液體活檢的主要檢測靶標及在腫瘤檢測中的優點和不足

1.1 液體活檢的主要檢測靶標 液體活檢是一種源自體液的疾病診斷和監測工具，體液主要有血液、腦脊液、唾液、尿液等，它們要么在體內循環，要么在體外分泌，具有營養輸送、廢物收集以及潤滑等一系列生理功能，隨著現代醫學和分析技術的發展，在體液中發現了越來越多的生物分子、細胞外囊泡甚至細胞，它們可以作為疾病管理的標記物具有重要的臨床價值［3］。檢測分析這些體液靶標（循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌體（Exosome）可以實時、全面、動態的反映原始組織的全局生理和病理信息，其結果可以對腫瘤進行早期篩查、指導治療、監測療效和監控復發［4-5］。

1.2 液體活檢在腫瘤檢測中的優點和不足 液體活檢與傳統腫瘤診斷方式相比，具有很多優勢。首先，液體活檢能夠診斷出疾病的早期階段，使及時治療成為可能；其次，液體活檢可以方便且無創的進行取樣，使疾病篩查更便捷，即使稀少的樣本也能檢測到，樣本還可以進行重復檢測和分析；再次，液體活檢能夠提供全面、動態的病理信息來精準全面的指導疾病診斷和治療方案［6］。同時它們在實際應用中存在一些不足［7］，如CTCs 在體液中含量極低，很難被捕獲和識別到，并且體液是相對復雜的基質，特別是外周血中有數十億血細胞和很多種蛋白質，捕獲和識別都需要高效富集和高信號放大策略。ctDNA 存在檢測方法不統一，缺少標準化流程。外泌體在分離、分析靈敏度等方面技術受到限制。此外，脆弱的檢測靶標需要溫和的分離和釋放方法進行下游分析，不同程度的異質性檢測靶標需要綜合的檢測分析方法，克服這些困難需要高特異性和高靈敏度的靶標檢測技術。核酸適配體檢測方法的出現彌補了液體活檢的不足。

2 核酸適配體的特性及其在不同腫瘤液體活檢中的應用

2.1 核酸適配體的特性 近年來，廣泛研究的核酸適配體由于其具有獨特的空間構象，能夠與病毒、細菌和細胞等多種靶點高特異的結合，它是利用指數富集的配基進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從大容量的寡核苷酸隨機文庫中迭代篩選出來的一類具有特異性識別功能的單鏈DNA 或RNA 核酸分子，它易于被合成，并根據靶標特點通過體外方法進行修飾，便于高效篩選到與核酸適配體高特異性、高親和力結合的檢測靶標，更便于檢測信號的放大和檢測靶標的充分釋放［8］。該技術于1990 年首次報道，后續開發出了許多改良的SELEX技術，并結合高效的篩選平臺和生物信息學工具，核酸適配體檢測方法促進了CTCs、ctDNA 和外泌體等液體活檢的發展，分別于2009 年、2012 年和2016 年探索了基于核酸適配體的檢測靶標分離方法、釋放策略以及用于CTCs 研究的亞群分析平臺［9］。

2.2 核酸適配體在腫瘤液體活檢中的應用 核酸適配體在腫瘤診療中作為識別配體，其性質決定其親和力、特異性和穩定性等性能。親和力決定核酸適配體與檢測靶標之間的結合力，從而影響檢測效率和靈敏度。核酸適配體的特異性識別保證了檢測的選擇性和可靠性，核酸適配體三級結構的穩定性在實際應用中非常重要。許多針對特定腫瘤生物標志物的核酸適配體已被開發應用于液體活檢中檢測靶標的捕獲和分析，比如黏液蛋白1（MUC1）和表皮生長因子受體2（HER2）的核酸適配體［10-11］，CD63 和 HSP70 的胞外結構域已成為開發特異性核酸適配體的目標，用以分離和分析外泌體［12-13］。在此，我們總結了現有的一些成功應用于不同腫瘤液體活檢的核酸適配體（表1）［14-16］。但是在親和力、特性性以及穩定性方面還需大力提升，因此許多努力致力于研發親和力強、特異性高和穩定性好的核酸適配體篩選方法。

表1 核酸適配體在不同腫瘤液體活檢中的應用

3 核酸適配體檢測的靈敏度、特異性方面的優勢

3.1 核酸適配體具有提高親和力的優勢 核酸適配體的親和力決定了其結合性能，從而決定了檢測靶標的高效分離和靈敏檢測，一些核酸適配體的親和力有限，同時復雜的基質通常會對核酸適配體的親和力和穩定性有害，因此提高核酸適配體的親和力是實際應用中亟待解決的問題。為了解決這一問題在生物系統中引入多價核酸適配體，以增強核酸適配體與不同活性細胞的親和力，多價核酸適配體即一個實體上的多個配體與另一個實體上的一個或多個受體同時結合，受此啟發，核酸適配體采用各種策略來設計多價組件作為識別元素來提高親和力，常用的方法有雜交、聚合和基于納米結構的多價組裝［17］。為了提高檢測靶標的特異性，核酸適配體是在嚴格的篩選條件下和適當的消減條件下進行篩選，如在連續流動的微流控中進行孵育有助于產生高度特異性的核酸適配體，與傳統的孵育方法相比，流動的流量可以抑制大約50 倍的非特異性結合的寡核苷酸，因此消減篩選是消除寡核苷酸非特異性結合的關鍵過程。Li 等［18］利用高轉移性MDA-MB-231 細胞進行正向性篩選，利用低轉移性MCF-7 細胞進行反向篩選，實現了特異性靶向轉移細胞的適配體M3 的篩選，此外，基于M3 的捕獲系統成功地從轉移乳腺癌患者得到的轉移性表型細胞捕獲到了CTCs，因此，篩選高特異性識別的適配體有助于檢測靶標的選擇性捕獲和分子分型。

3.2 核酸適配體具有多價組裝的優勢 由于檢測靶標存在于復雜的體液中，所以靈敏的檢測需要檢測靶標的有效分離和富集，體液的復雜成分會影響檢測信號，尤其是血液樣本，一毫升血液中含有大于109個紅細胞、107個白細胞、大于108個血小板，以及幾十毫克的蛋白質和有機小化合物，這種復雜的基質會在電化學檢測時引起電極污染，在光學檢測時引起自熒光、光散射以及吸附，因此檢測靶標的有效分離和富集是提高檢測效率和靈敏度的關鍵。核酸適配體具有許多獨特的特性，首先，由體外SELEX 進化而來的各種核酸適配體可以全面準確地識別液體活檢的檢測靶標；其次，核酸適配體的合成具有較低的批量變異性，可以方便地制備成多價納米組裝體，具有官能團和小分子的位點特異性修飾允許高度定向和高密集的界面功能化，這些優點都有助于高親和力捕獲界面的設計［19］。隨著材料科學和微/納米技術的發展，迄今為止，許多微/納米材料和微/納米工程裝置已經被制造出來，為液體檢測提供了多功能、穩健和高效的分離平臺，將核酸適配體整合到各種平臺中（包括磁性材料、微/納米結構基質和微流控芯片）可以整合核酸適配體和平臺的優點。

3.3 核酸適配體具有信號放大的優勢 檢測靶標的靈敏性分析對于準確和可靠的疾病診斷很重要，但是體液中某些類型的檢測靶標濃度較低，因此檢測靶標的靈敏檢測需要信號放大策略，與其他識別配體相比，核酸適配體具有眾多獨特的組成和結構特征，在信號放大方面有優勢［9］，核酸適配體探針含有不同的信號放大基團，它與靶標結合時提供多種直接放大策略，包括DNA 擴增/組裝和酶催化反應，或者對于與觸發序列雜交的核酸適配體探針，核酸適配體-靶標相互作用競爭性地釋放觸發序列以進行信號放大，基于核酸適配體的信號放大策略有直接放大和競爭放大。

4 展望

核酸適配體用于液體活檢具有的諸多優點和應用潛力，但是目前大多數核酸適配體的特性尚未得到充分研究，只有極少數核酸適配體被批準用于臨床。全面的液體活檢仍需要靶向各種檢測靶標的多種核酸適配體。此外，在復雜的基質中，核酸適配體結合性能的降低使得基于核酸適配體的液體活檢變得困難，迄今為止，已有多種策略來提高核酸適配體的穩定性和親和力，如對核酸酶敏感位置的核酸適配體序列進行化學修飾和多價組裝，然而這兩種方法都使核酸適配體的應用復雜化，并且化學修飾有時會影響核酸適配體的特異性和親和力，因此核酸適配體的多樣性、親和性以及穩定性有望進一步提高，需要更先進的SELEX 技術。其次，CTCs 和外泌體攜帶著豐富的生物信息，這些生物信息是現有基于核酸適配體的液體活檢難以獲得的，由于CTCs 和外泌體高度的異質性，它們不同的亞群與腫瘤的轉移有不同的相關性，但是基于核酸適配體親和力的分離依賴于特定生物標志物的表達，這會導致CTCs 和外泌體的特定亞群檢測不出來，從而無法提供準確和全面的信息，影響了腫瘤液體活檢的臨床價值。再次，標準化的處理程序和集成設備是臨床轉化的重要前提，借助商業儀器和試劑盒以及成熟方案，這些基于核酸適配體的腫瘤液體活檢方法將實現從工作臺到床邊的平穩過渡。最好，具有質量控制和標準化操作程序的商業試劑盒將確?；诤怂徇m配體的液體活檢方法可靠和并具有重復性。

綜上所述，通過核酸適配體特性的改善、檢測靶標的綜合分析策略和相應的商用設備的開發、臨床應用可行性驗證等方面的共同努力，基于核酸適配體的液體活檢有望推動腫瘤診療的發展。