miR-499基因家族進化分析及其對雞骨骼肌肌纖維類型調控的研究

石詩影，巨曉軍，屠云潔，單艷菊，姬改革，劉一帆,2，章 明，束婧婷*

(1. 江蘇省家禽科學研究所/江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇 揚州 225125；2. 江蘇省家禽科學研究所 科技創新有限公司，江蘇 揚州 211412)

肌肉中的氧化型肌纖維(慢肌)含量越高、酵解型肌纖維(快肌)含量越低時，肌肉的主要品質指標趨好，如pH、肉色、系水力、肌內脂肪和風味物質含量等[1-3]。而肌纖維的類型在動物生長過程中并不是固定的，不同類型肌纖維之間的轉化十分常見。因此，骨骼肌肌纖維類型轉化規律是肉質研究的關鍵切入點。解析骨骼肌肌纖維類型轉化機理并應用于育種生產，對于加速優質肉雞品種培育、加快優質肉雞行業產業化發展有著重要的理論和實踐意義。

microRNA(miRNA)是一類內源性的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們能夠在動植物中廣泛參與基因表達調控，從而參與機體的細胞增殖、分化、凋亡、能量代謝和信號轉導等過程[4]。已經證實許多miRNA在肌肉功能的調控中發揮關鍵作用，其中大部分miRNA在各個組織中廣泛表達，少部分在肌肉中特異性表達，即myomiRs(muscle-specific miRNAs)[5]。miR-499是最新報道的myomiRs成員，在骨骼肌和心肌中特異性表達[6]。越來越多的研究表明，miR-499在骨骼肌肌纖維類型轉化過程發揮著重要的調控作用。Van Rooij等[7]報道miR-499-5p敲除后小鼠比目魚肌的I型肌纖維數目明顯減少。Nachtigall等[8]在羅非魚的研究發現miR-499在骨骼肌慢肌纖維中的表達量遠高于快肌。SOX6已經被證實是miR-499的關鍵靶基因。在心肌中，miR-499能通過抑制SOX6的表達促進心肌細胞的分化[9]。

在前期的高通量測序表明，miR-499在雞快肌和慢肌組織中差異表達顯著，推測miR-499在雞骨骼肌肌纖維類型轉化也具有重要的作用[10]。為了進一步研究miR-499在雞骨骼肌肌纖維類型調控的功能，本研究通過對miR-499進行序列進化分析、靶基因預測、鑒定和表達量分析，旨在為進一步揭示miR-499在骨骼肌肌纖維類型轉化的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 試驗采用的清遠麻雞來自廣東天農食品集團股份有限公司。種蛋孵化后，在同樣的環境和飼養條件下進行飼養，全程自由采食和飲水。

1.1.2 主要試劑和儀器 TRNzol總RNA提取試劑(DP405)、熒光定量預混試劑 (SYBR Green) (FP215)，FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒( KR116)購自TIANGEN公司；DNA Marker DL2000為TaKaRa公司產品。9700PCR儀和Max3000P熒光定量PCR儀(愛普拜斯)；凝膠成像系統(Tanon 2500)；紫外分光光度計(Nano Drop One，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 獲取miR-499序列和基因組位置信息 從miRBase數據庫22.1(http://www.mirbase.org/)中下載所有脊椎動物的miR-499前體序列和成熟序列。利用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，以10種典型脊椎動物的miRNA-499基因家族前體序列作為查詢序列(Query sequence)，在基因組中進行比對，以確定miR-499的基因組位置以及來源基因。

1.2.2 多序列比對和系統發育樹構建 利用ClustalX 1.83軟件對所有的miR-499成熟序列進行多序列比對(Multiple sequences alignment)。以前體序列為輸入序列，通過MEGA7.0軟件構建系統進化樹，選擇基于距離參數的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)，并自舉檢驗1000次。

1.2.3 靶基因預測 選擇在線軟件targetscan(http://www.targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/)分別預測雞miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因，取兩種工具輸出結果的交集作為候選靶基因。

1.2.4 靶基因功能分析 利用DAVID在線工具(https://david.ncifcrf.gov/)對預測到的靶基因進行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，采用超幾何分布檢驗方法計算各個條目或通路中差異基因富集的顯著性。

1.2.5 miR-499-5p和SOX6在雞骨骼肌中的表達檢測 選擇體重接近的20周齡清遠麻雞母雞6只，放血屠宰后采集胸大肌(pectoralis major)和腿縫匠肌(sartorius)組織。肌肉總RNA提取用Trizol法，RNA樣品檢測合格后，取2 μg總RNA進行反轉錄合成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR),使用的引物見表1。反應體系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL( 10 μmol/L)， cDNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加dd H2O補足20 μL。反應條件為： 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 20 s， 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 60 s， 共 40 個循環。 每次反應均設空白樣品為陰性對照，每個樣品設置3個平行。

表1 試驗使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.2.6 miR-499-5p和SOX6靶向調控關系驗證 通過PCR擴增獲得具有miR-499-5p結合位點的SOX6 3'UTR序列，并通過重疊PCR獲得結合位點突變后的3'UTR序列。經測序驗證后將兩段序列分別克隆至pMIR-RB-ReporterTM雙熒光素酶報告載體。將野生型和突變型載體分別與miR-499-5p mimic或mimic NC共轉染DF-1細胞。轉染24 h后，參照Dual Luciferase Reporter Assay System試劑盒的說明書步驟進行操作，并使用酶標儀進行熒光素酶活性的測定。

1.2.7 統計分析 表達量結果采用2-△△Ct法進行處理。采用 SPSS 20.0軟件進行分析，組間差異顯著性用獨立樣本t檢驗(Independent-samplesttest)進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 miR-499基因家族及其在基因組中的定位

在miRBase22.1數據庫中共查詢到43種脊椎動物的49條miRNA-499基因家族前體序列，其中大部分脊椎動物例如小鼠、山羊、雞等具有miR-499基因家族的1個成員；棉耳狨猴、人、斑點叉尾鮰具有miR-499基因家族的 2 個成員(miR-499a、miR-499b)；大西洋鮭具有miR-499基因家族的 4 個成員(miR-499a、miR-499b-1、miR-499b-2、miR-499b-3)。

在數據庫中共查詢到43種脊椎動物75條miRNA-499基因家族成熟序列，其中大部分脊椎動物例如小鼠、山羊、雞等具有miR-499基因家族的兩個成熟序列(miR-499-5p，miR-499-3p)；慈綢魚、牛、鯉魚、犬、大猩猩、斑點叉尾鮰、大斑馬、鯛魚、青鳉、尼羅羅非魚、奈里樸麗魚、黑猩猩、樹鼩、熱帶爪蟾、大棕蝠只有miR-499基因家族的一個成熟序列；人、大西洋鮭具有miR-499基因家族的4個成熟序列。

10種典型脊椎動物的miRNA-499在基因組的位置見表2。miR-499均定位在內含子區域，關聯基因為MYH7B。

表2 miR-499基因家族成員在基因組的分布特征Table 2 Genomic location of miR-499 gene family

2.2 miR-499基因家族序列同源性分析

利用ClustalX軟件對miR-499基因家族43種物種的成熟序列進行多序列比對分析(圖1) ,結果顯示，miR-499基因成熟序列具有較高的同源性。miR-499-5p保守堿基數為19個，miR-499-3p保守堿基數為14個，說明保守性較高。miRNA的seed序列(5'端第 2-8 個核苷酸)負責在與基因3'UTR特異性結合，對于miRNA功能的行使十分重要，因此這段序列通常十分保守，本研究亦證實了這一點。miR-499的部分位點在不同物種發生了核苷酸突變和缺失，導致miR-499基因家族成員間的成熟序列長度產生變化。

圖1 miR-499基因家族的成熟序列多重比對Fig. 1 Multiple sequences alignment of mature sequence among the miR-499 family

目前，部分miR-499成熟序列并未區分其來源于前體序列的5p或3p端。經過序列比對，其中大棕蝠、斑點叉尾鮰、犬、牛、鯛魚、奈里樸麗魚、大斑馬、慈綢魚、尼羅羅非魚、鯉魚、熱帶爪蟾的miR-499成熟序列與miR-499-5p同源性較高，提示其來源于成熟序列的5p端；黑猩猩、青鳉的miR-499的成熟序列來源于3p端。

2.3 miR-499基因家族成員系統進化分析

利用MEGA7.0軟件對43種脊椎動物的49條miRNA-499基因家族前體序列構建NJ系統發育進化樹。由圖2可知，進化樹首先被分割為2大支：第1大支是人和普通狨miR-499b，其余前體序列為第2支；第2大支又繼續分為3支：第1分支主要聚集的是哺乳類動物；第2分支主要聚集的是魚類；第3分支主要是爬行類動物和鳥類，爬行類聚集在一起，鳥類聚集在一起。進化樹分支劃分符合物種分類規律，由此可以猜測，各物種的miRNA-499基因家族在進化過程中符合物種進化演變的規律。

圖2 利用NJ法構建脊椎動物miR-499前體序列系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of the miR-499 family constructed based on Neighbor-joining method

2.4 雞miR-499靶基因預測及功能分析

利用targetscan和miRDB在線工具對雞miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因進行預測，取兩者預測結果的交集，分別獲得78個和245個靶基因。利用DAVID在線工具對靶基因進行GO和KEGG富集分析(表3&表4)。結果發現，miR-499-5p的靶基因顯著富集于細胞應對轉化生長因子刺激，絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調控，轉錄因子活性和細胞內吞信號通路等(P<0.05)。miR-499-3p的靶基因顯著富集于組織發育，cAMP信號，ARF蛋白信號轉導，MAPK信號，泛素介導的蛋白水解作用和細胞內吞信號通路等(P<0.05)。

表3 雞miR-499-5p靶基因顯著富集的GO條目和信號通路Table 3 GO and pathway enrichment of target genes for chicken miR-499-5p

表4 雞miR-499-3p靶基因顯著富集的GO條目和信號通路Table 4 GO and pathway enrichment of target genes for chicken miR-499-3p

2.5 miR-499和SOX6表達分析

為驗證雞miR-499-5p與預測靶基因SOX6的表達關系，本研究選擇快肌為主的胸大肌和慢肌為主的腿縫匠肌，檢測了miR-499-5p和SOX6在兩種肌肉中的表達水平。結果發現，miR-499-5p的表達量在縫匠肌中極顯著高于胸大肌(P<0.01)，SOX6在縫匠肌中表達水平極顯著低于胸大肌(P<0.01)，且兩者的表達呈強的負相關(r=-0.92)。

圖3 不同雞骨骼肌組織中miR-499-5p和SOX6的表達量**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同Fig.3 miR-499-5p and SOX6 expression level from different skeletal muscle tissues** shows highly significant difference (P<0.01). The same below

2.6 miR-499和SOX6靶向結合關系分析

為進一步鑒定miR-499的靶基因，將SOX6野生型、突變型3'UTR與miR-499-5p mimic和mimic NC共轉染后，檢測雙熒光素酶活性。如圖4所示，當共轉染野生型SOX6時，與mimic NC組相比，miR-499-5p mimic組熒光素酶活性受到極顯著抑制(P<0.01)；而共轉染突變型SOX6時，mimic NC組和miR-499-5p mimic組差異不顯著(P>0.05)。結果表明，SOX6是miR-499-5p的靶基因。

圖4 雙熒光素酶活性檢測結果Fig.4 Dual luciferase activity detection

3 討 論

miRNA作為調控基因表達的重要內源性非編碼小分子RNA，幾乎參與調節所有的生物學過程，包括細胞生長和分化、肌肉發育和脂肪代謝等。miRNA主要通過與靶基因mRNA 3'UTR不完全互補配對，在轉錄后水平抑制靶基因的作用。早期報道的一些miRNA基因家族，如miR-23[11]、miR-223[12]，在物種間具有高度的保守性，與非保守的miRNA相比具有更為明確的生物學功能，因此更值得進行深入研究。

miR-499屬于肌肉特異性表達miRNA，在小鼠等物種研究中表明其在肌肉發育和分化中發揮著廣泛的功能，但在雞上缺少相關研究。本研究發現miR-499廣泛存在于大多數脊椎動物之中，且在各個物種中序列高度保守。這種保守性尤其是種子區的保守性，預示其在不同物種間將具有類似的功能，這為借鑒相關研究理解雞miR-499的生物學功能提供了便利。目前發現人miR-499由肌球蛋白重鏈7B(MYH7B)的內含子編碼，主要在心肌和骨骼肌組織表達，并且與MYH7B基因呈現協同表達的趨勢[6]。本研究也發現在10種脊椎動物中miR-499均由MYH7B內含子編碼。同時，進化樹結果顯示miR-499序列進化特征符合物種進化演變規律，提示miR-499在生物遷移和進化過程中具有重要作用。

靶基因預測是探索miRNA功能的有效手段。本研究通過對雞miR-499的兩種成熟體進行靶基因預測，并進行GO和KEGG分析。結果顯示miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因顯著富集于肌纖維類型相關的GO條目和信號通路，包括絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調控[13]、cAMP信號[14]和MAPK通路[15]。Van Rooij等[7]報道敲除miR-499-5p后，小鼠肌纖維出現明顯的慢肌向快肌的轉變。李志雄等[16]報道了在肉雞腓腸肌注射miR-499-5p后，肌肉差異基因主要參與絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調控和MAPK通路。本研究的表達試驗發現，miR-499在慢肌中的表達量顯著高于快肌。綜合以上結果，推測miR-499可能促進雞骨骼肌慢肌纖維的形成，抑制快肌纖維的形成。

SOX6是miR-499最重要的靶基因之一。在心肌中，miR-499能夠靶向SOX6抑制其表達，從而參與細胞損傷修復和凋亡調節[17-18]。骨骼肌方面，研究人員已經在豬和斑馬魚上證實了miR-499能夠通過調控SOX6表達，進而參與調控肌纖維類型的轉化[8,19]。張梓豪等[20]通過表達試驗初步證實了SOX6基因具有促進雞骨骼肌快肌纖維形成的作用。本研究發現miR-499-5p和SOX6在雞肌肉組織中呈現相反的表達模式。進一步通過雙熒光素酶試驗驗證了miR-499-5p和SOX6的靶向關系，提示SOX6在雞上也能夠被miR-499抑制。

4 結 論

通過對miR-499基因家族分子進化特征進行研究，發現miR-499序列保守性高，來源基本一致，提示雞miR-499與其他動物具有類似的功能。通過靶基因預測驗證和表達分析發現，miR-499可能在雞骨骼肌肌纖維類型轉化中發揮關鍵作用，SOX6是其重要靶基因之一。