circ_0000285對過氧化氫誘導的心肌細胞氧化損傷的影響和機制研究

楊少君，周乃珍，王曉霞

（1.廈門大學附屬中山醫院心內科，福建廈門 361004；2.廈門大學附屬中山醫院保健病房，福建廈門 361004）

心肌梗死等缺血性心臟病是導致心臟功能障礙的重要原因之一，活性氧自由基生產量增多可加重心肌細胞損傷，氧化應激反應可破壞心血管結構及功能，還可引起心肌細胞凋亡進而加重心肌細胞損傷，因而抑制氧化應激反應可降低心肌梗死等缺血性心臟病的發生率［1-2］。過氧化氫（H2O2）可促進心肌細胞凋亡從而誘導心肌細胞氧化損傷，并可用于建立體外心肌損傷模型［3］。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是由共價鍵結合形成的閉合環狀RNA 分子，其不易被核酸外切酶降解且穩定存在于真核生物中，并可充當微小RNA（micro RNA，miR）的海綿分子而發揮功能作用，研究表明，circRNA在心肌細胞損傷中表達異常，并可能參與心血管疾病發生及發展過程［4］。circ_0000285在高糖誘導的足細胞損傷中表達上調，下調其表達可抑制氧化應激而減輕高糖誘導的足細胞損傷［5］。但circ_0000285 在H2O2誘導的心肌細胞中的表達及其可能作用機制尚未可知。通過靶基因預測顯示circ_0000285 與miR-625 存在結合位點，研究表明，miR-625在帕金森病細胞模型中表達下調，上調其表達可抑制神經細胞凋亡從而減輕神經細胞損傷［6］。但miR-625在心肌細胞損傷中的表達及其可能作用機制尚未可知。因此，本研究主要探討circ_0000285 是否可通過靶向調控miR-625 的表達從而參與H2O2誘導的心肌細胞氧化損傷過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H2O2購自美國Sigma；大鼠心肌細胞H9C2 購自北京協和細胞資源中心；丙二醛（malondialed?hyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧化物歧化酶3（cysteinyl aspartate-specific protease-3，superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；噻唑蘭（Methylthiazolyldiphe?nyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑、凋亡檢測試劑盒、胰蛋白酶購自北京索萊寶；DMEM 培養基、胎牛血清購自美國Hyclone；兔抗鼠活化半胱氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate-specific protease-3，cleaved caspase-3）、微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-asso?ciated protein 1 light chain 3，LC3）-Ⅱ、LC3-Ⅰ抗體與二抗購自美國Abcam；細胞裂解液、BCA 檢測試劑盒購自北京康為世紀生物；反轉錄試劑與SYBR Primix Ex Taq檢測試劑購自美國Thermo Fisher；Lipo?fectamine2000 購自美國Invitrogen；Trizol 試劑購自北京全式金生物；circ_0000285小分子干擾RNA（sicirc_0000285）及其陰性對照（si-NC）、miR-625寡核苷酸模擬物（miR-625 mimics）及陰性對照mimic NC 序列（miR-NC）、miR-625 特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-625）及其陰性對照（anti-miR-NC）購自廣州銳博生物；circ_0000285 過表達載體（pcDNAcirc_0000285）及其空載體（pcDNA）購自上海吉滿生物。

1.2 方 法

1.2.1 構建心肌細胞氧化損傷模型 參考文獻［7］的方法，取對數生長期H9C2 細胞接種于96 孔板（3×103個/孔），加入含有200 μmol/L H2O2培養基處理48 h，記為H2O2組。同時將正常培養的H9C2 細胞記為Con 組。

1.2.2 實驗分組 根據Lipofectamine2000 試劑盒說明書操作，采用脂質體轉染法將si-NC、si-cic_0000285、si-circ_0000285 與anti-miR-NC、si-circ_0000285 與anti-miR-625 分別轉染至H9C2 細胞，轉染成功后加入含有200 μmol/L H2O2培養基處理48 h，分別記為H2O2+si-NC 組、H2O2+si-circ_0000285 組、H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC組、H2O2+si-circ_000028 5+anti-miR-625 組。

1.2.3 細胞中circ_0000285、miR-625 的表達水平檢測 采用實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）進行檢測，用Trizol 試劑提取各組H9C2 細胞總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書將總RNA 合成cDNA，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 補足體系至20 μL；反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 次循環。circ_0000285 以GAP?DH為內參，miR-625以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算circ_0000285、miR-625 相對表達量。circ_0000285正向引物5'-TACCTCTGCAGGCAGGAACT-3'，反向引物5'-TCACATGAATTTAGGTGGGACTT-3'；GAPDH 正向引物5'-GCCATCACAGCAACACAG?AA-3'，反向引物5'-GCCATACCAGTAAGCTTGC?C-3'；miR-625 正向引物5'-GGCTAGTTCACTCCT?CTCCTCG-3'，反向引物5'-GTGCAGGGTCCAGGT-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGC?AGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATT?TGCGT-3'。

1.2.4 氧化應激指標MDA、NO 的濃度與SOD 的活性檢測 將各組H9C2 細胞裂解后按照試劑盒說明書檢測MDA、NO 的濃度與SOD 的活性，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 細胞增殖檢測 各組H9C2 細胞（2×104個/mL）接種于96 孔板（100 μL/孔），于培養箱內培養24 h 后每孔加入MTT 溶液20 μL，于培養箱內繼續培養4 h，1 300 r/min轉速離心5 min后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光孵育5 min，應用酶標儀檢測各孔光密度值（OD）并計算細胞存活率［實驗組OD 值/對照組OD 值×100%］。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組H9C2 細胞后加入預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞后棄上清，收集細胞沉淀后加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC后室溫避光孵育5 min，加入5 μL PI 后室溫避光孵育10 min，應用FACS Calibur 流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測circ_0000285 與miR-625 的靶向關系 Circ RNA Interactome 預測顯示circ_0000285 與miR-625 存在結合位點，利用基因突變技術將結合位點進行突變，結合位點與突變位點的片段分別克隆至pmirGLO 載體得到野生型載體WT-circ_0000285、突變型載體MUTcirc_0000285，用脂質體轉染法將miR-NC、miR-625 mimics 分 別 與WT-circ_0000285、MUT-circ_0000285共轉染至H9C2細胞，于培養箱內培養24 h后收集細胞，并檢測細胞熒光素酶活性。用脂質體轉染法分別將pcDNA、pcDNA-circ_0000285、si-NC、si-circ_0000285 轉染至H9C2 細胞后，采用qRT-PCR 法檢測miR-625 的表達量。

1.2.8 Western blot 檢測 Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ組H9C2 細胞裂解后提取細胞總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度后加入5×SDS 上樣緩沖液，于100℃水浴10 min，每孔上樣量40 μg 進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），275 mA 恒流下轉膜90 min，5%脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜2 h，Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶1 000）一抗與內參GAPDH抗體（1∶3 000）稀釋液分別孵育PVDF 膜，4℃孵育過夜，TBST 洗膜，二抗稀釋液（1∶5 000）孵育PVDF 膜1 h（37℃），滴加ECL 顯影，應用Image J 軟件分析各條帶灰度值并計算LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ條帶灰度值的比值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，符合正態分布計量資料以（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2誘導的心肌細胞中circ_0000285 與miR-625 的表達量比較

與Con 組比較，H2O2組circ_0000285 的表達量升高（P＜0.05），miR-625 的表達量降低（P＜0.05），見表1。

表1 H2O2誘導的心肌細胞中circ_0000285 與miR-625 的表達量比較 ［±s，n=9］

表1 H2O2誘導的心肌細胞中circ_0000285 與miR-625 的表達量比較 ［±s，n=9］

注：與Con 組比較，*P＜0.05

2.2 干擾circ_0000285 表達對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激的影響

與Con 組比較，H2O2組MDA、NO 的濃度升高（P＜0.05），SOD 的活性降低（P＜0.05）；與H2O2+si-NC 組比較，H2O2+si-circ_0000285 組MDA、NO 的濃度降低（P＜0.05），SOD的活性升高（P＜0.05），見表2。

表2 干擾circ_0000285 表達對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激的影響 ［±s，n=9］

表2 干擾circ_0000285 表達對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激的影響 ［±s，n=9］

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與H2O2+si-NC 組比較，1）*P＜0.05

2.3 干擾circ_0000285 表達對H2O2 誘導的心肌細胞活力、凋亡及自噬的影響

與Con 組比較，H2O2組細胞存活率降低（P＜0.05），細胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白濃度升高（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05）；與H2O2+si-NC 組 比 較，H2O2+si-circ_0000285 組細胞存活率升高（P＜0.05），細胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白濃度降低（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（P＜0.05），見圖1、表3。

表3 干擾circ_0000285 表達對H2O2誘導的心肌細胞活力、凋亡及自噬的影響 ［±s，n=9］

表3 干擾circ_0000285 表達對H2O2誘導的心肌細胞活力、凋亡及自噬的影響 ［±s，n=9］

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與H2O2+si-NC 組比較，1）*P＜0.05

圖1 干擾circ_0000285 表達后流式細胞術檢測細胞凋亡率以及Western blot 法檢測Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達量比較

2.4 circ_0000285與miR-625靶向調控作用的驗證

Circ RNA Interactome 預測顯示circ_0000285 與miR-625 存在結合位點（圖2A）。共轉染野生型載體WT-circ_0000285 的細胞實驗中，與miR-NC 組比較，miR-625 組熒光素酶活性降低（P＜0.05）（見圖2B）。轉染pcDNA-circ_0000285可抑制miR-625表達，轉染si-circ_0000285 可促進miR-625 表達（圖2C）。

圖2 circ_0000285 與miR-625 靶向調控作用的驗證（A：Circ RNA Interactome 預測顯示circ_0000285 與miR-625 存在結合位點；B：雙熒光素酶報告實驗；C：qRT-PCR 法檢測miR-625 的表達量）

2.5 抑制miR-625 表達可逆轉干擾circ_0000285表達對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激、細胞活力、凋亡及自噬的作用

與H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC 組比較，H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-625 組MDA、NO 濃度升高（P＜0.05），SOD 的活性降低（P＜0.05），細胞存活率降低（P＜0.05），細胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白濃度升高（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05）（圖3、表4）。

表4 抑制miR-625 表達可逆轉干擾circ_0000285 表達對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激、細胞活力、凋亡及自噬的作用 ［±s，n=9］

表4 抑制miR-625 表達可逆轉干擾circ_0000285 表達對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激、細胞活力、凋亡及自噬的作用 ［±s，n=9］

注：與H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC 組比較，*P＜0.05

圖3 抑制miR-625 表達后流式細胞術檢測細胞凋亡率以及Western blot 法檢測cleaved caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達量比較

3 討論

CircRNA 可參與心臟肥大、心肌梗死等多種心血管疾病發生及發展過程，研究表明，circRNA可能作為心血管疾病診斷及治療的潛在靶點如，circ-HIPK2 通 過調 節miR-485-5p/ATG101 的 表 達而促進心肌細胞凋亡和自噬［8］。circRNA ncx1 通過靶向miR-133a-3p 介導缺血性心肌損傷［9］。circRNA_101237 通過靶向let-7a-5p/IGF2BP3 介導心肌細胞損傷［10］。circRNA Hipk3、circMACF1 等均可參與心肌細胞損傷過程，并可能作為心血管疾病治療的潛在靶標［11-12］。

circ_0000285通過誘導Wnt/β-catenin信號傳導途徑在喉癌中發揮癌基因的作用［13］。circ_0000285通過調節miR-409-3p/IGFBP3 表達從而促進骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲［14］。但circ_0000285在H2O2誘導的心肌細胞中的表達尚未可知。本研究結果顯示，H2O2誘導的心肌細胞中MDA、NO 濃度升高，SOD 的活性降低，與既往研究報道結果相似［15］，提示成功建立心肌細胞氧化損傷模型。本研究發現，H2O2誘導的心肌細胞中circ_0000285 的表達量升高，干擾circ_0000285 表達后MDA、NO 濃度降低，SOD 的活性升高，提示干擾circ_0000285 表達可抑制H2O2誘導的心肌細胞氧化應激反應。LC3屬于自噬相關基因8 的同源物，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬體數量與自噬水平高低，caspase-3是調控細胞凋亡的關鍵蛋白酶，caspase-3 被激活后可促進細胞凋亡，抑制其表達可抑制細胞凋亡［16-17］。本研究結果顯示，H2O2誘導的心肌細胞存活率降低，細胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白濃度升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，而干擾circ_0000285 表達后細胞存活率升高，細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 蛋白濃度降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，提示干擾circ_0000285 表達可促進H2O2誘導的心肌細胞增殖而抑制心肌細胞凋亡及自噬。

本研究通過雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證實circ_0000285 可靶向結合miR-625，并可負向調控miR-625 的表達。研究表明，miR-625-5p 通過靶向AKT2 抑制人支氣管上皮細胞炎癥反應［18］。MiR-625-5p 通過靶向STAT3 和CaMKII 抑制心臟肥大［19］。本研究結果顯示，H2O2誘導的心肌細胞中miR-625 的表達量降低，抑制其表達可逆轉干擾circ_0000285 表達對H2O2誘導的心肌細胞增殖、氧化應激、凋亡及自噬的作用，提示circ_0000285 可通過靶向調控miR-625 而抑制H2O2誘導的心肌細胞增殖及抑制細胞氧化應激、凋亡及自噬。

綜上所述，H2O2誘導的心肌細胞中circ_0000285的表達量升高，而miR-625 的表達量降低，干擾circ_0000285 表達可通過上調miR-625 的表達而促進H2O2誘導的心肌細胞增殖并可抑制心肌細胞氧化應激反應、凋亡及自噬，circ_0000285/miR-625 在缺血性心臟病發生、發展過程中可發揮重要調控作用，并可能作為缺血性心臟病診斷及治療的潛在靶點。但關于其具體作用機制仍需進一步探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。