Necroptosis 抑制劑及相關病癥的研究進展

易宏婷，曾宣銘，張玉珂，顏蓉，雷彬，陳鐘文，劉華

（江西中醫藥大學藥學院，江西南昌，330004）

0 引言

Necroptosis 稱為程序性細胞壞死或壞死性凋亡，是先由受體相互作用蛋白激酶1/3（Receptor-Interacting Protein Kinase 1/3，RIPK1/3）發動，再由下游的混合譜系激酶結構域樣蛋白（Mixed Lineage Kinase Domain-Like Protein，MLKL）來執行的一種細胞死亡方式［1］。其中，RIPK1/3 是necroptosis 的關鍵酶，受caspase 通路和泛素化調控［2］。RIPK1 是促生存的NF-κB 信號通路與腫瘤壞死因子TNF 信號通路響應的細胞死亡之間的細胞決策關鍵調節因子。RIPK3通過其獨特的C 端段與RIPK1 的結合，抑制RIPK1 和TNFR1 介導的NF-kB 激活；MLKL 被鑒定為RIPK3的下游靶點和necroptosis 的最終執行器［3］。RIPK3 和MLKL 的表達都是誘導necroptosis 的必要條件。該文主要從與necroptosis 相關的疾病和necroptosis 兩類主要的抑制劑進行綜述，期望為中醫藥類necroptosis 抑制劑的科學研究和臨床提供參考。

1 necroptosis 與疾病

1.1 腫瘤

研究表明，necroptosis 相關激酶 RIPK1、RIPK3和 MLKL 與放射治療（放療）后的腫瘤再增殖息息相關［4］。

RIPK1 能通過NF-κB 依賴途徑促進黑色素瘤細胞增殖，并且能夠延緩黑色素瘤異種移植在體內的生長，抑制黑色素瘤細胞在體外增殖［10］。RIPK3 與MLKL 的表達在癌癥中發揮抗炎和抗腫瘤的作用。乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、 慢性淋巴細胞白血病、急性髓系白血病、肺癌和黑素瘤、膠質瘤、鼻咽癌、骨髓瘤和淋巴瘤等癌癥患者的樣本中RIPK3 表達降低［6，7］。在攜帶突變急性髓系白血病驅動基因的骨髓細胞移植的小鼠中，敲除RIPK3 后，白血病發生明顯加快，RIPK3敲除小鼠的存活率也低于野生型小鼠。并且，RIPK3敲除小鼠發生結腸炎相關結直腸癌的風險更高，并產生了更多的促炎或促腫瘤因子［8］。同樣，RIPK3 低表達提示乳腺癌患者預后較差［6］。而敲除MLKL 可防止腫瘤細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等多種細胞類型的壞死［5］。MLKL 的不正常表達亦會對諸多癌癥造成影響，其若表達偏低會導致胃癌、食管癌、卵巢癌和結腸癌的預后不良，其若表達偏高則會影響宮頸鱗癌的總體存活率的改善［6］。

1.2 炎癥性疾病

細胞發生necroptosis 會導致細胞膜破裂，細胞質內容物流出，引發炎癥反應，炎癥反應又會導致necroptosis。關節炎、敗血癥、急性胰腺炎、腸炎和肺炎等都是與necroptosis 相關的炎癥性疾?。?0］。研究表明，促炎癥細胞因子的合成和釋放使得程序性細胞壞死的細胞可以調控炎癥反應的發生［16］，這為治療炎癥性疾病提供了新的思路。

類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以累及周圍關節為主的慢性、系統性和炎癥性自身免疫性疾病。慢性增生性滑膜炎是導致RA 的基本病理改變以及關節破壞的罪魁禍首。文獻報道［9］，膠原誘導性關節炎鼠關節滑膜中程序性細胞壞死的標志性蛋白p-MLKL 的表達水平明顯升高。此外，RA 關節滑膜中p-MLKL 和MLKL 的表達水平顯著增高［9］，p-MLKL 在誘導壞死中顯著增加14-3-3η 蛋白的釋放［11］。此外，p-MLKL 的表達水平與紅細胞沉降率、Krenn 總分及襯里下層炎性細胞浸潤亞分呈正相關。RA 患者關節中的中性粒細胞在跨膜黏附糖蛋白CD44 和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的影響下激活RIPK1、RIPK3 和MLKL，引起程序性細胞壞死，此時可通過應用成纖維細胞激活蛋白-α（FAP-α）來阻止壞死［12］，這突出了FAP-α 作為治療RA 有效藥物的重要性。

RIPK3 依賴型necroptosis 亦能促成慢性炎性疾病。例如在Ripk3-/-、ApoE-/-和Ldl-/-的動脈粥樣硬化動物模型的斑塊中的壞死巨噬細胞數量顯著減少［9］。敲除 RIPK3 基因的小鼠能有效阻止腸炎的發生。RIPK1 與心臟缺血再灌注損傷有關［13］，而RIPK3 與心肌梗死誘導的心肌壞死和重塑有關。在RIPK1 缺失的情況下，RIP3 會誘導心肌細胞發生壞死［14］。此外，由RIPK3 引起的心肌壞死是通過CaMKII 的激活介導的，因此心肌細胞中RIPK3 依賴性的壞死與許多其他細胞類型的壞死明顯不同，在其他細胞類型中它需要RIPK1 和MLKL［13］。這些發現揭示了一種以前未被重視的壞死模式，并為缺血和氧化應激誘導的心臟損傷、適應不良重構和心力衰竭提供了新的治療靶點。

1.3 神經退行性疾病

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）、多發性硬化（Multiple Scalerosis，MS）、肌萎縮側束硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）和阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）等神經退行性疾病的病理進程都受到 necroptosis 的影響［16］。

最新研究［13］表明TNF-α 可以通過RIPK1-FADD-Caspase-8 軸誘導星形膠質細胞凋亡，并通過RIPK3-MLKL 信號通路誘導神經元發生necroptosis，進而引起PD。PD 的病理性細胞死亡過程與RIPK1 磷酸化激活有關。在MS 發生發展過程中，促炎細胞因子——TNF- α，在caspase-8 缺乏的情況下，會激活 RIPK1 和RIPK3 介導的necroptosis 通路，引起神經元的退行性病變，誘導少突膠質細胞的變性死亡。此外，研究表明，在MS 病理的發生發展過程中，抑制RIPK1 可防止TNF-α 誘導的少突膠質細胞死亡，故而MS 可以采取靶向RIPK1 抑制劑的治療。在 ALS病理發展過程中，RIPK1、RIPK3 和 MLKL 信號通路在脊髓神經組織內被激活，進而影響進行性運動神經元死亡和神經軸突的退化［16］。此外，隨著腦內 RIPK/MLKL 信號通路活性的降低，AD 轉基因動物腦內神經元死亡和認知功能也會降低［17］。

1.4 其他疾病

創傷性腦損傷（TBI）致殘及死亡的元兇之一是大量細胞壞死。腦組織的損傷及功能障礙與necroptosis密切相關。研究表明，通過誘導致死性氧化應激來活化Akt/mTOR 會導致神經元necroptosis，抑制necroptosis 有可能為TBI 提供一種新的治療策略。此外，necroptosis 還是腦血管疾病，例如腦缺血、再灌注損傷的重要死亡途徑；缺血性腦損傷與細胞內凋亡信號缺乏導致necroptosis 誘導產生有關［18］。

除此之外，necroptosis 還參與到病毒、細菌和寄生蟲等病原微生物感染，以及腎臟、肝臟和免疫性等疾病的病程中，會加重細胞或組織損傷［10］。

2 necroptosis 的抑制劑

necroptosis 既能促進某些疾病的發生，又能成為治療腫瘤的潛在方式。因此，necroptosis 的誘導劑和抑制劑的研究是一場具有重大意義的持久戰。necroptosis 抑制劑針對作用靶點的不同，分為RIPK1 抑制劑、RIPK3 抑制劑和 MLKL 抑制劑。PIPK1 抑制劑有Nec-1、Nec-1s、Nec-3、Nec-4、Nec-5、 GSK963、TAK-632、B31j；RIPK3 抑制劑有Dabrafenib、GSK840、GSK843、GSK872、HS-1371、KongensinA、TAK-632、B31j、C1m；MLKL抑制劑有Necrosulfonamide（NSA）、Thioredoxin-1、TC13172、GW806742X［7，33］。 其中，Nec-1 和NSA是研究較為深入的兩種。

2.1 特異性抑制劑Nec-1

Nec-1 是一種小分子生物堿，是首個被發現的necroptosis 特異性小分子抑制劑。Nec-1 不僅能阻止程序性細胞壞死，也能抑制細胞凋亡［19］。

Nec-1 能顯著縮小心肌梗死的梗死面積，并通過抑制 RIPK1 的表達減少心肌細胞丟失，來保護心肌、改善心肌重構和心臟功能［21，24］；還能改善腦水腫、減少顱內損傷以及提高腦神經功能［22］；也能緩解急性肝衰竭、急性腎衰竭和缺血再灌注等的疾病進展，提高生存期和疾病預后［7］。

此外，研究表明，Nec-1 能顯著抑制 ROS 的生成［23］；還能提高因缺氧引起的細胞損傷的細胞活性，也能緩解急性肝衰竭小鼠模型線粒體功能障礙，并抑制 ROS 生成及其對細胞的損傷［24，25］。盡管Nec-1對諸多疾病具有抑制作用，但因其半衰期很短 （t1/2<5 min），造成其成藥性較差。研究繼而發現Nec-1s 具有較好的活性，且其半衰期也有明顯提升［26］，這便為RIPK1 抑制劑的進一步研究提供了新思路。

2.2 necroptosis 抑制劑NSA

NSA 是由美國科學院院士王曉東教授的團隊通過建模抑制人結腸癌細胞HT-29 死亡，篩選20 萬個化合物得到的一種MLKL 小分子抑制劑，證明NSA 可以有效防止HT-29 的necroptosis［27］。

NSA 具有物種特異性。Sun L 等人［28］研究發現，人類MLKL 中被NSA 共價修飾的半胱氨殘基cys86 在小鼠MLKL 中被色氨酸殘基所取代，導致NSA 具有物種特異性，其能有效阻斷人類細胞的壞死，但不能阻斷小鼠細胞的壞死。

單獨處理的NSA 雖然能顯著增強Caspase 抑制劑（z-VAD.fmk）對小分子Smac 模擬物（BV6）或去甲基化劑（5AC）誘導的細胞死亡的保護作用，但不能阻止細胞死亡。此外，NSA 與 MLKL 基因在誘導necroptosis 的情況下被敲減，也均能使管狀線粒體保持正常形態［29］。 當存在NSA 時，僅能觀察到離散的RIPK3，故而NSA 可以通過作用于壞死的特定途徑，來阻止necroptosis［30］。另外，NSA 可以抑制髓核（NP）細胞凋亡和necroptosis 來預防NP 降解［31］，還可以抑制NCM460 細胞磷酸化MLKL 的表達和necroptosis，最終緩解腸道炎癥等［31］。

最新研究發現，NSA 在嚙齒動物神經系統疾病模型中具有治療窗口期，除了抑制MLKL 活性外，還能通過提高脊髓損傷小鼠模型的抗氧化能力來改善神經功能損傷，減輕AD 大鼠模型中的淀粉樣變性和牛頭病變［32］。此外，NSA 通過誘導MLKL 泛素化和降解，在小鼠缺血性腦損傷后表現出神經保護作用并通過抑制炎癥和壞死來減輕小鼠腦出血模型的急性腦損傷［33］，對在帕金森?。≒D）亞急性MPTP 小鼠模型中類似PD 的行為缺陷和病理生理，如壞死、神經炎癥和α-突觸核蛋白寡聚化有治療作用［34］。這些研究結果均為necroptosis 在疾病發病機制中發揮作用增加了證據。

靶向MLKL 的NSA 雖然在對necroptosis 的特異性上非常具有優勢，但是對其構效關系的研究并沒有得到活性提升的衍生化合物，因此難以作為藥物開發的前提［35］。

綜上，最具代表性的nec-1 和NSA 抑制劑均存在各自的不足，并未能上市成為necroptosis 抑制劑，而天然產物具有多種生理活性，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎等，同時還具有副作用小、安全性高等優勢，在藥品、食品及日化等領域存在著巨大的開發潛力。最新研究表明，紫草中的紫草素不僅能誘導卵巢癌［36］、鼻咽癌［37］細胞與三陰性乳腺癌細胞［38］產生大量的活性氧、上調RIPK1 和RIPK3 蛋白的表達，以激活necroptosis 進程，明顯抑制卵巢癌SKOV3 和A2780 細胞、鼻咽癌CNE2 和HNE2 細胞與三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 的增殖，還能抑制炎癥并通過提高抗氧化能力發揮防治血熱證的藥理作用［39］，也能通過增加抗氧化酶基因表達及抑制ERK1/2-NFκB 信號通路改善T2DM 肝損傷［40］等。

3 總結與展望

2022 年9 月，世界衛生組織發布的報告顯示，心臟病、癌癥、糖尿病等非傳染性疾病 （NCDs）已超過傳染病，成為“全球頭號殺手”，每兩秒鐘就有一名70 歲以下的人死于非傳染性疾病，每年約占全球死亡人數的四分之三死于該類疾病。necroptosis 與非傳染性疾病息息相關，近年來，與necroptosis 相關的研究成了一個廣泛和迅速發展的領域。但從上市藥物中篩選得到的抗necroptosis 抑制劑靶點不僅選擇性較差，而且可能會引起大量不良反應。此外，迄今為止發現的各種抑制劑均存在成藥性較差、分子量或毒性較大等問題，因此很難成藥。天然產物正好能彌補現有抑制劑的不足，這不僅是對于成為necroptosis 抑制劑，還是對于中醫藥的發展都具有很深遠的價值與意義。該綜述查閱了近幾年的相關文獻，以necroptosis的主要通路—TNF-α-RIP1/3-MLKL 展開，將蛋白與疾病、抑制劑聯系起來，旨在從已知突破未知，能夠克服necroptosis 抑制劑的種種缺陷，為研發高效、高選擇性、代謝穩定性好和低毒性的necroptosis 抑制劑提供參考。