水稻內生成團泛菌YS19與菠蘿泛菌YJ76共培養提高環境脅迫生存適應性

孫遠浩, 周心怡, 何新宇, 楊逸軒, 馮永君,2*

(1. 北京理工大學 生命學院,北京 100081;2. 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室深圳分中心農業部農業基因數據分析重點實驗室 中國農業科學院農業基因組研究所,廣東 深圳 518120)

植物內生菌是指能定殖在健康植物組織內并與植物建立了和諧聯合關系的一類微生物[1]。它們可以主動侵染定殖在健康植物組織中,大部分菌體的定殖都能使內生菌和植物彼此受益[2-3]。成團泛菌(Pantoeaagglomerans)是一種重要的環境微生物,廣泛分布于植物、動物、空氣、土壤、水等各種環境中[4]。成團泛菌YS19是從水稻“越富”品種中分離出的一種優勢內生菌,其在植株的各個生長階段的各個器官中大量分布[5]。YS19表現出很強的固氮活性,分泌各類植物激素,調節光合產物由莖、葉向穗的轉移,具有促進水稻增產的潛力[6]。前期相關的研究表明,YS19生長到一定階段或感受逆境時會形成菌體聚集的共質體結構[7-8],該結構并非源自細胞分裂產生的單克隆體系,而是由分散的細菌細胞主動聚集形成的[6,9],形成共質體可以減弱環境中逆境因素的侵害[10-12]。 菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)YJ76是從同一水稻品種中分離得到的一種優勢內生菌,其與YS19合計占到在該宿主分離菌總豐度的90%以上,盡管兩個菌株都非常有優勢,但YS19依然占據了統治性的地位。YJ76同樣能分泌多種植物激素,具有很強的固氮活性,與宿主互作時增加水稻苗的生物量[13]。YJ76能大量產生吲哚信號[14],而吲哚是近年來備受關注的一種信號分子,被認為在細菌種內和種間發揮重要調控作用[15]。共質體結構最早由Achouak等[16]報道,細菌聚集形成共質體結構后,在抵抗損傷、增強代謝、適應環境等方面,會產生分散細胞所不具備的一些優勢[17]。當細菌處于逆境,如強酸、強堿、抗生素、紫外線、干燥等環境下,形成共質體的菌體能夠表達特定應激蛋白以及啟動新的代謝模式;另外,大量細菌聚集成團受特定的信號分子調節,具有群體優勢,這種優勢在菌體定殖、環境棲息中具有重要意義[18-21]。本研究探索了微生態菌體棲息環境下YS19與YJ76的相互作用對共質體形成和抗逆作用的影響,相關研究增加了對植物內生菌間互作關系的認識,為開發新型多菌種協同的生物菌劑并應用到水稻生產實踐提供了可借鑒的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 成團泛菌(Pantoeaagglomerans)YS19(NCBI 16S rDNA AB033602)和菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)YJ76(NCBI 全基因組序列號 CP022427)均為北京理工大學生命學院植物與微生物相互作用實驗室(本實驗室)從水稻“越富”品種中分離得到的植物內生菌。YJ76突變株Δzwf采用Tn5插入突變法篩選獲得,突變基因編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,經測定該基因突變后對菌體的生長沒有實質性影響,但吲哚產量相比野生株減少38.59%[22],帶有氨芐青霉素、利福平(Amp,Rp)抗性。大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α,含有pBBR1-MCS-2-GFP質粒,能夠表達綠色熒光蛋白(GFP),具有卡那霉素(Kan)抗性,由中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所魏海雷研究員友好提供。

1.1.2 培養基 LB培養基(g/L)：NaCl 10,胰蛋白胨 10,酵母浸提物 5,121 ℃滅菌20 min,配制固體培養基時,瓊脂加入量為1.5%(質量分數)。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 磷酸緩沖液(PBS,g/L)：NaCl 8.0,KCl 0.2,Na2HPO4·12H2O 2.9,KH2PO40.2;ZnSO4、NaCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、抗生素、番紅等均購自北京索萊寶科技有限公司;質粒小提試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。電子天平(JY1002,上海良平儀器儀表有限公司);恒溫震蕩搖床(TH2-C,蘇州培英實驗設備有限公司);小型臺式高速離心機(I-14,德國Sigma公司);光學顯微鏡(SK-FL,重慶奧特光學儀器有限公司);激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(CLSM,ZEISS LSM510 META,蔡司集團)。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 將甘油保存的兩種菌株分別于LB固體培養基上劃線,30 ℃倒置培養24 h后,挑取單菌落接種至20 mL LB液體培養基中,培養12 h制備種子液,然后將細胞轉接到裝有150 mL LB液體培養基的500 mL搖瓶中,培養16 h后備用[12]。本研究中有關細菌的實驗,如無特殊說明均以1%(體積分數)接種至培養基中,30 ℃、180 r/min培養。

1.2.2 YJ76-GFP菌株的構建 將含有pBBR1-MCS-2-GFP質粒的E.coliDH5α接種至LB液體培養基中,37 ℃、220 r/min培養12 h,然后使用質粒小提試劑盒提取質粒pBBR1-MCS-2-GFP。制備YJ76感受態細胞并以質粒pBBR1-MCS-2-GFP為材料電擊轉化[23],轉化完成后涂布于LB平板培養至出現單菌落,挑取單菌落接種至LB液體培養基中擴大培養獲得能夠表達綠色熒光蛋白(GFP)的YJ76-GFP菌株。

1.2.3 YJ76與YS19的共培養及共質體形成 YS19和YJ76共培養時,將培養至指數期的YS19與YJ76均調整到A600=0.6,分別按(10∶0)～(10∶10)的接種量比例轉接至LB液體培養基中,但接種時總接種量保持一致(1%,體積分數),培養48 h后,取樣測定A600。同時,將菌液滴加于血細胞計數板(1 mm×1 mm),番紅染色后在光學顯微鏡下觀察共質體成團平均尺寸,并通過顯微計數法測定共質體的成團率(參與成團的菌體細胞占總細胞數的比例)[24]。此外,將YS19和YJ76-GFP按10∶3接種量比例接種培養48 h后,取樣用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察共質體結構的形成。

1.2.4 抗逆性檢測 將YS19、YJ76以及共培養(YS19和YJ76菌株的接種量比例為10∶3)分別獨立接種到LB液體培養基中,培養48 h后,取樣分別進行重金屬、抗生素、紫外線和干燥處理。檢測菌體對重金屬、抗生素的抗性時,培養基中分別加入化學品(終濃度為1.5 mmol/L ZnSO4;終濃度為40 μg/mL 四環素),培養4 h。將A600調節至0.6的菌液用PBS稀釋100倍,轉移到培養皿中,在距離15 W紫外燈(波長254 nm)45 cm處,均勻照射30、60、90 s,檢測菌體對抗紫外照射能力,在10 mm×10 mm無菌濾紙片上分別滴加50 μL菌液,無菌環境下干燥處理1、2、3 h,干燥結束后用PBS收集菌體,檢測菌體抗干燥能力。將處理完成的菌液用PBS稀釋并在LB平板上涂布培養,培養完成后進行菌落計數,存活率定義為處理后的菌落形成單位(CFU)數量除以處理前的CFU數量[6],所有實驗三個平行。

2 結果與分析

2.1 YS19和YJ76不同接種量比例對協同生長特征的影響

首先觀察了YS19單獨培養時(YS19∶YJ76=10∶0)共質體形成的狀況,發現在LB培養基中培養48 h后,YS19形成了大量共質體結構(圖1,YS19),成團率為67.2%,成團的平均尺寸為2.6 μm,菌液A600為1.87。相比之下,培養體系中存在一定量的YJ76可以顯著促進共質體的形成(圖1,(10∶1)～(10∶3))。顯微觀察發現,當YS19和YJ76兩個菌株接種量比例為10∶3時,對共質體形成促進效果最顯著(圖1),統計學分析表明,在該接種量比例下共質體成團平均尺寸、成團率均達到最高(圖2),與其他接種比例之間存在顯著性差異(P<0.05)。此時成團率最大為79.2%,相較YS19單獨培養時增幅17.8%;成團平均尺寸為4.7 μm,增幅80.7%;A600為2.38時,增幅27.3%。隨著YJ76添加比例的增加,對共質體形成的促進作用逐步弱化(圖1,(10∶4)～(10∶6),圖2),最后表現為抑制作用(圖1,(10∶7)～(10∶10),圖2)。當兩個菌株接種量比例達到10∶9時,成團率為42.6%,相較YS19單獨培養時降低36.6%;成團平均尺寸為1.6 μm,降低38.4%;A600為1.7,降低9.0%。

圖1 顯微觀察YS19與YJ76不同接種量比例共培養對共質體形成的影響Fig.1 Micrographic observation on the effect of co-cultivation with different inoculation ratios between YS19 and YJ76 on symplasmata formationYS19∶Δzwf=10∶3表示YS19與YJ76突變株Δzwf的接種量比例為10∶3YS19∶Δzwf=10∶3 indicates that the inoculation ratio of YS19 and YJ76 mutant Δzwf is 10∶3

圖2 YS19與YJ76不同接種量比例對共質體成團率、平均尺寸和A600的影響Fig.2 The effects of different inoculation ratio of YS19 and YJ76 on the symplasmata formation ratio, average size and A600 標準差用圖中的誤差線表示(n=3, P<0.05),下圖同The standard deviation is represented by the error bars in the figure (n=3,P<0.05), the same as in the figure below

2.2 吲哚產量減少的YJ76突變體Δzwf對共培養促進作用的影響

考慮到前期研究中發現吲哚對于YS19共質體形成有顯著促進作用[25-26],本研究利用吲哚產量顯著下降的YJ76突變株Δzwf進行了相同的分析(圖1,YS19∶Δzwf=10∶3;表1),以探究吲哚的產生在兩個菌株共培養時對共質體形成發揮的作用。將YS19與YJ76突變株Δzwf以10∶3的接種量比例共培養48 h后,發現YS19的成團率為63.7%,相較于YJ76野生株共培養時減幅19.6%;成團平均尺寸為3.2 μm,減幅31.9%;A600為1.93,減幅17.9%,表明由Δzwf基因突變造成吲哚產量下降,相比YJ76野生株兩個菌株共培養時促進YS19共質體形成的效果,受到了顯著抑制。

表1 YS19與YJ76突變株Δzwf共培養對共質體成團率、平均尺寸和細菌生長的影響Table 1 Effect of co-cultivation of YS19 and YJ76 mutant Δzwf on symplasmata formation rate, average size and bacterial growth

2.3 YJ76參與YS19共質體的形成

將YS19和YJ76-GFP兩個菌株共培養后,使用LSCM明場觀察發現菌體形成了大量的共質體結構(圖3A),而在暗場觀察發現許多GFP熒光標記的YJ76菌體細胞(圖3B)。明場和熒光暗場重疊的結果顯示,共質體并非僅由單一菌株形成,而是YJ76顯著參與到YS19的共質體中,兩個菌株的菌體細胞相互交織在一起(圖3C),表明這兩種植物內生菌在共同的棲息環境中,產生了實質性相互作用,從而形成了雜合共質體。

圖3 CLSM觀察YS19與YJ76-GFP形成的雜合共質體Fig.3 CLSM observation of hybrid symplasmata formed by YS19 and YJ76-GFP明場(A)、暗場(B)與兩場重疊(C)下的共質體進行比較;YJ76-GFP顯綠色熒光Hybrid symplasmata in the bright field channel (A) and fluorescent field channel (B) were compared with that in overlapping of the two field (C);YJ76-GFP showed green fluorescence

2.4 YS19和YJ76共培養對菌體抗逆能力影響

為了探究YS19和YJ76共培養促進共質體形成對菌體抗逆境生存能力的影響,本研究選用了四種逆境處理方式：重金屬、四環素、紫外線和干燥。研究發現,共培養相較YS19單獨培養抵抗重金屬Zn2+、四環素逆境脅迫的能力分別提高了63.9%、56.0%;相較YJ76單獨培養抵抗重金屬Zn2+、四環素逆境脅迫的能力分別提高了147.9%、172.7%(圖4A)。相同的促進效果同樣發現在紫外線照射研究中,處理90 s時檢測,兩個菌株共培養存活率較YS19單獨培養提高了57.4%,而兩個菌株共培養較YJ76單獨培養提高了266.3%(圖4B)。同樣,對于干燥處理,兩個菌株共培養也能顯著促進菌體的存活率,處理3 h后檢測,兩個菌株共培養存活率較YS19單獨培養提高了72.0%,而兩個菌株共培養較YJ76單獨培養提高348.6%(圖4C)。

圖4 YS19、YJ76和共培養菌經過化學物質(A)、紫外線(B)和干燥(C)處理后的存活率Fig.4 Survival rate of YS19, YJ76 and co-culture solution after chemical (A),ultraviolet (B) and drying (C) treatments

3 討 論

在自然生長環境或培養基中,成團泛菌能夠主動聚集成團形成獨特的共質體結構[6],這一結構的形成能顯著提高菌體在逆境中的生存能力,本實驗室以及其他學者的研究都發現成團泛菌在植物體內定殖時,幾乎全部以共質體形式存在[11-12,27-28]。本研究從菌體共培養(模擬棲息)和共質體結構形成兩個角度探究了兩菌互作對抗逆的影響。

首先證實了P.ananatisYJ76參與P.agglomeransYS19共質體的形成,正如前期本實驗室研究發現,YS19在形成共質體時并非由單個細胞發育而來(即所謂單克隆體系),而是多個單細胞主動聚集的結果,本研究觀察到的現象進一步印證了上述結果,因為如果共質體的形成起源于單克隆體系,則在YS19共質體中不可能觀察到YJ76細胞。另外,適量的YJ76能夠促進YS19共質體的形成,本研究又通過YJ76吲哚產量大幅減少的突變株Δzwf與YS19共培養,發現共質體的成團率以及尺寸有不同幅度的縮減。相關研究表明,吲哚信號能夠促進YS19釋放eDNA和胞外多糖,而這兩種物質存在于共質體內并在促進共質體穩定性中發揮了重要作用[29-30],結合本研究的結果,可以推定YJ76對YS19共質體形成的促進作用是由于YJ76產生的吲哚信號造成的。而在較高的YJ76接種量比例下,共質體的形成受到了抑制,這是由于過多的YJ76接種量使YS19的絕對量減少造成的。

本研究還發現YS19、YJ76共培養能顯著提高兩個菌株對逆境(重金屬Zn2+、四環素、紫外線以及干燥)的抵抗能力。在宿主水稻體內復雜的微生態系統中,YS19與YJ76兩個菌株占有菌體數量上的絕對優勢,本研究結果表明在合適的共培養條件下兩個菌株能夠產生協同作用,提升了菌體抵御逆境的能力。這種協同效應很可能是源自于兩個菌株具有的互補效應[31]以及吲哚這一能夠發揮重要作用的種間信號分子的調控作用。也就是說,面對復雜多變的自然環境,兩個菌株甚至多個菌株的微生態體系具有更強的適應性。從本研究結果來看,對同一植物分離的內生菌的微生態體系開展多菌的聯合培養研究對于探索內生菌的相互作用乃至菌肥開發和利用具有科學意義。