山西省不同地區柴胡根部可培養內生真菌的多樣性分析

申小營, 姜 丹, 李 萌, 劉心雨, 任廣喜, 劉春生

(北京中醫藥大學 中藥學院,北京 102488)

內生真菌是指某一生命階段或整個生命周期內,生活在植物體內,但不引起植物表現出疾病癥狀的一類真菌[1]。植物體內蘊含著豐富的內生真菌資源,不同植物體內的優勢菌群差異較大。西洋參根部內生真菌優勢菌屬為一種柔膜菌(Unclassifiedhelotiales)和假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)微生物等[2];云南重樓內生真菌以頭孢霉屬(Cephalosporium)為優勢種群,占總數的24.69%[3];黃芩葉和莖的內生真菌優勢屬為鏈格孢屬(Alternaria),根的內生真菌優勢屬為鐮刀菌屬(Fusarium)[4];可以看出不同植物體內及相同植物不同器官的優勢內生真菌種群存在顯著差異。同時,不同地理-氣候環境對植物的內生真菌菌落結構也有明顯影響,取樣地點和取樣組織類型在決定藥西瓜中內生真菌的組成起到了重要的作用[5];不同產地杜仲樹皮內生真菌的生物多樣性不同[6]。環境強烈影響了沙漠中鎖陽內生真菌種類的數量和多樣性[7]。內生真菌不僅在生態系統發揮著重要作用,還可以產生多種有生理活性的藥效成分[8]。馬錢內生真菌Exserohilumrostratum次生代謝產物中的化合物(+)-monocerin具有潛在的抗炎活性[9]。狹葉柴胡內生真菌CHS4菌株發酵液的乙醇粗提物對肝癌細胞有抑制作用,內生真菌CHS3可以產生柴胡皂苷[10-11]。近年來植物內生真菌與植物之間的互作關系受到廣泛關注,植物內生真菌對植物具有促生、提高抗病害能力等多種有益影響。有學者在金線蓮內生真菌中發現兩株可以促進金線蓮生長發育的促生菌和兩株可以拮抗金線蓮莖腐病的拮抗菌[12],蘋果內生真菌PG06、LG12、LG06、LY09對蘋果組培苗均具有顯著促生作用[13];野生大豆內生真菌ZX-WD-S4、WDS-6、Z1L-5對大豆苗期生長起到顯著的促生作用[14];深色有隔內生真菌OchroconisguangxiensisX22及其多糖和寡聚糖提取物對香蕉苗具有促生與抗枯萎病作用[15]。有關研究表明,野生甘草的質量穩定優于栽培型甘草[16],而野生型甘草中的內生真菌多樣性也明顯多于栽培甘草[17];由不同內生真菌合成的人工群落可以促進丹參的生長,提升丹參的產量與品質[18]。因此可以得出,內生真菌不但自身可以合成生物活性物質,也能夠對藥用植物的質量產生一定影響。柴胡(BupleurumchinenseDC.)是一種多年生藥用植物,根部入藥,其含有的皂苷類、黃酮類、揮發油類、甾醇類等多種活性成分具有廣泛的藥理活性;2020版《中華人民共和國藥典》規定,柴胡皂苷a+d 的含量不得低于0.30%[19]?，F代藥理研究證明柴胡中的揮發油具有解熱作用[20],柴胡中的皂苷類成分具有鎮痛和保護肝臟等作用[21-23]。臨床上柴胡可用于治療感冒發熱、肝郁氣滯、胸肋脹痛、脫肛、子宮脫垂、月經不調等癥。柴胡分布地區較廣,黑龍江、甘肅、陜西、山西、河北、河南、四川等地均有栽培種植[24],研究發現不同產區的柴胡皂苷含量差異較大[25-27],有學者在測定甘肅、山西、河北、赤城四個產地柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量時,發現赤城產地柴胡的柴胡皂苷含量最高,甘肅產地柴胡的柴胡皂苷含量最低[28]。研究表明,海拔、溫度、光照等生態因子影響藥用植物體內次生代謝產物的積累[29],晉東北大同市渾源縣、廣靈縣與晉中部呂梁市汾陽縣顯著高于晉南臨汾市、長治市、晉城市、運城市的柴胡皂苷 a+d含量,主成分分析表明柴胡皂苷含量與經緯度、海拔呈正相關[30]。北京中醫藥大學藥用植物與分子生藥課題組(本課題組)前期研究發現晉南的柴胡揮發性氣味比晉北豐富,晉南與晉北柴胡中羧酸、酯類、烯烴、醇類的相對質量分數接近,但晉北醛類相對質量分數高于晉南,晉北酮類、芳香類、烷烴的相對質量分數遠遠低于晉南[31]。山西省是我國柴胡種植面積和市場影響最大的省份之一[32],山西省的地勢狹長,地形多樣,海拔落差大,南北的氣候具有明顯差異,通過對山西省內不同地區的經度、緯度、海拔、年均溫、年降水量等地理-氣候數據分析發現,山西省北部區、中部區與南部區三個自然地理區的地理-氣候因子存在顯著性差異[33]。綜上所述,地理-氣候因子對植物中活性成分和植物中內生真菌的多樣性都有不同程度的相關性,植物中內生真菌也是直接或間接影響植物中活性成分的因素之一。那么不同產地柴胡根部內生真菌多樣性是否與內生真菌多樣性相關?哪些類群的內生真菌可能對柴胡質量產生影響?要想對以上問題進行研究,就需建立豐富的柴胡內生真菌庫。因此,本研究通過對不同產地柴胡內生真菌進行分離和鑒定,建立柴胡中內生真菌菌庫,研究柴胡根部可培養內生真菌的微生物群落結構,為開發促進柴胡皂苷 a+d 含量積累的內生真菌或產生柴胡皂苷 a+d 的內生真菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 綜合考慮山西省的地理-氣候特性與山西省柴胡栽培基地分布,于2020年10～11月分別從山西省北部與南部地區各采集35批樣品,共采集70批次健康柴胡(BupleurumchinenseDC.),樣品編號見表1,采集點分布圖見圖1。

圖1 樣品采集地分布圖(山西省)Fig.1 Distribution of sampling sites (Shanxi Province)

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：取馬鈴薯200 g,切成1 cm3小方塊,加入適量去離子水煮沸30 min,紗布過濾,向濾液中加入瓊脂17～20 g、葡萄糖20 g,加蒸餾水定容至1 L。放入錐形瓶中,121 ℃滅菌30min,倒板備用。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 真菌基因組 DNA 提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);2×TaqMaster Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司);ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′);ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)(北京全式金生物技術股份有限公司)。梯度聚合酶鏈式反應(PCR)儀(Veriti96,美國 ABI 公司);潔凈工作臺(SW-CJ-1D,蘇州蘇潔凈化設備有限公司);臺式小型離心機(1-14,德國 Sigma 公司);凝膠成像系統(GelDoc,美國 Bio-Rad 公司);水平電泳槽(JY-SP3,北京君意東方電泳設備有限公司);冷凍混合球磨儀(MM400,德國 Retsch 公司);立式壓力蒸汽滅菌器(LSB35,江陰濱江醫療設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離 新鮮柴胡洗凈后,用流動水沖洗30 min,將根切成2 cm小段,在超凈臺中進行根部表面消毒,步驟為75%乙醇消毒3 min,用無菌水沖洗1次,5%次氯酸鈉消毒5 min,用無菌水沖洗1次,75%乙醇消毒30 s,無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸干柴胡小段表面水分,無菌手術刀將其分割為5 mm組織塊,放入PDA平板,每個平板放入4個組織塊,每個批次設置10個重復,設置兩個空白對照組：一組為組織印記法,將吸干水分的柴胡小段在PDA培養基上來回滾動,印記1 min;另一組為漂洗液檢驗法,取最后一次漂洗液200 μL涂布于平板上。以上平板均在28 ℃培養箱中避光培養7 d,若空白對照組無真菌菌落生長,則將所得菌落轉移至新的PDA平板中進行純化,否則重復上述步驟。純化的菌落放入15%的甘油中,-80 ℃保存備用。

1.2.2 內生真菌DNA的提取 在超凈臺中用無菌竹簽將培養皿中的菌絲收集在2 mL離心管中,放入兩個無菌小鋼珠,液氮速凍離心管,用球磨儀磨碎菌絲,隨后使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取真菌的基因組DNA。

1.2.3 內生真菌ITS序列的PCR擴增與測序 采用真菌通用引物ITS1與ITS4擴增真菌的ITS序列,聚合酶鏈式反應(PCR)體系為30 μL(1 μL DNA模板、1 μL ITS1、1 μL ITS4、15 μL 2×TaqMaster Mix、12 μL ddH2O),PCR反應參數：94 ℃預變性 5 min,94 ℃變性 1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30～35次循環;72 ℃ 10 min,4 ℃停止。取5 μL PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測,得到明亮、單一的條帶,送Songon Biotech (中國上海)公司測序。

1.2.4 內生真菌ITS序列BLAST比對和分析 將樣品測序結果的序列在CongtingExpress軟件拼接,在NCBI官網(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進行同源序列比對,下載相似

度最高序列建立系統發育樹,用 MEGA 5.0 應用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構建系統進化樹,兩個或兩個以上菌株序列與同一個參考菌株序列在系統發育樹中聚為一支且與參考序列相似度大于等于97%,則該菌株被鑒定到種水平,其余菌株為屬水平[34]。

1.2.5 數據分析 分離率(%)=(分離得到的菌株數/組織塊總數)×100%。分離率(Isolation Rate,IR)可以反映出樣本中可培養內生真菌的豐富度。RStudio計算各地區的Chao1指數、ACE指數、香農(Shannon)指數、辛普森(Simpson)指數等α多樣性指數,GraphPad Prism 9進行地區的多樣性指數的差異性分析與繪圖。

2 結果與分析

2.1 柴胡根部可培養內生真菌的分子鑒定

將ITS測序結果進行拼接后,在 NCBI 官網(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 上進行同源序列比對,下載相似度最高的菌株序列,同等條件下選擇已有相關文獻報道的菌株序列,構建系統發育進化樹分析親緣和進化關系。部分菌株鑒定結果見表2、圖2,如菌株1P 14-3與Fusariumoxysporum的同源相似性為99.82%,且在系統發育樹中聚為一支,則1P 14-3被鑒定為Fusariumoxysporum。菌株1P 12-3與Phomasp.的同源相似性為99.27%,且在系統發育樹中聚為一支,則1P 12-3被鑒定為Phomasp.。

圖2 柴胡根部可培養內生真菌中部分菌株與同源菌株的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic evolution tree of some strains and homologous strains of endophytic fungi that can be cultivated in the root of Bupleurum chinenseAuricularia auricula為外源菌株Auricularia auricula is exogenous strain

表2 柴胡根部可培養內生真菌中部分菌株BLAST比對結果

2.2 柴胡根部可培養內生真菌菌群的組成分析

全部樣品中共分離得到705株內生真菌,根據ITS分子測序結果分析,其中695株真菌歸屬為4門14綱23目32科55屬119種(表3),其余10株為Uncultured fungus,無具體鑒定結果。在對柴胡根部可培養內生真菌菌群進行不同分類水平分析時,相對豐度小于1%的菌群歸為others,相對豐度大于5%的菌群歸為優勢菌群。在門水平,主要由半知菌門、子囊菌門、擔子菌門、接合菌門等菌株組成,其中半知菌門(51.06%)、子囊菌門(29.50%)的相對豐度超過25%,為優勢菌門。在綱水平主要由絲孢綱、腔孢綱、不整囊菌綱、擔子菌綱、座囊菌綱、層菌綱、糞殼菌綱等菌株組成,其中絲孢綱(35.89%)、腔孢綱(14.18%)、不整囊菌綱(13.76%)、擔子菌綱(12.20%)、座囊菌綱(11.21%)相對豐度均超過10%,為優勢菌綱。在目水平主要由瘤唑孢目、球殼孢目、散囊菌目、假球殼目、格孢腔目、絲孢目、多孔菌目、假球殼目、傘菌目等菌株組成,其中瘤唑孢目(31.49%)、球殼孢目(14.04%)、散囊菌目(13.76%)、假球殼目(12.20%)相對豐度均超過10%,為優勢菌目。在科水平主要由瘤唑孢科、球殼孢科、隔孢假殼科、散囊菌科、孢腔菌科、暗叢梗孢科、多孔菌科、葡萄座科、絲裂孢科、發菌科等菌株組成,其中瘤唑孢科(31.49%)、球殼孢科(13.90%)、隔孢假殼科(12.20%)、散囊菌科(11.35%)相對豐度均超過10%,為優勢菌科。在屬水平上主要由Fusarium、Didymella、Aspergillus、Paraphoma、Alternaria、Phoma、Cladosporium、Ascomycota、Phaeosphaeria、Pleosporales、Penicillium、Talaromyces、Earliella、Botryosphaeria等菌株組成,通過統計各菌屬的相對豐度發現Fusarium(31.94%)、Didymella(12.37%)、Aspergillus(11.51%)、Paraphoma(7.19%)、Alternaria(6.91%)的相對豐度均超過5%,故柴胡根部可培養內生真菌的優勢菌屬為Fusarium、Didymella、Aspergillus、Paraphoma、Alternaria。在種水平主要由Fusariumacuminatum、Didymellabellidis、Fusariumtricinctum、Aspergillusfumigatus、Fusariumsolani、Paraphomachrysanthemicola、Alternariaalternata、Fusariumoxysporum、Cladosporiumcladosporioides、Didymellaglomerata等菌株組成,Fusariumacuminatum(9.50%)、Didymellabellidis(8.65%)、Fusariumtricinctum(8.51%)、Aspergillusfumigatus(8.51%)、Fusariumsolani(5.96%)、Paraphomachrysanthemicola(5.11%)的相對豐度均超過5%,為柴胡根部可培養內生真菌的優勢菌種。

表3 柴胡根部可培養內生真菌的分類結果

2.3 不同地區的柴胡根部可培養內生真菌的分離率分析

本研究從70批樣品2 800個組織塊中,共分離出705株內生真菌,柴胡根部可培養內生真菌的總體分離率為25.18%。從圖1可知,樣品采集地主要分布在山西省的南部區與北部區,分別簡稱為晉南與晉北。晉南區域的分離率(29.07%)高于晉北區域(20.49%),晉南區域內生真菌豐富度要高于晉北區域,對晉南與晉北兩個地區總的分離率進行差異分析(圖3)結果表明,晉南區域與晉北區域的可培養內生真菌的分離率沒有顯著差異,表明兩個區域的柴胡根部可培養內生真菌豐富度沒有顯著差異,從這兩個區域的柴胡根部可分離出的真菌總量沒有顯著差異。

圖3 晉南與晉北區域分離率差異分析Fig.3 Difference analysis of regional isolation rate difference between southern and northern Shanxi

晉南與晉北各地區分離率如圖4所示,晉南地區中LC(65.00%)、HT(64.17%)、WX(53.75%)、HM(40.00%)、YC(31.88%)的分離率高于晉南地區的平均分離率(29.07%)。晉北地區中GL(65.00%)、LQ(40.00%)、SY(23.33%)、HY(22.50%)、PL-1(22.50%)的分離率高于晉北地區的平均分離率(20.49%)。將晉南與晉北各地區分離率分別進行anova分析(表4),HT(64.17%)地區的分離率顯著(P<0.05)高于HY(22.50%)、ZY(17.08%)、NW(9.17%)、PG(5.00%)、BD(5.00%)五個地區;表明HT地區的內生真菌豐富度高于HY、ZY、NW、PG和BD地區。GL(65%)地區的分離率極顯著(P<0.01)高于XF(17.00%)、JS(9.17%)地區,顯著(P<0.05)高于 J(22.00%)、X(15.00%)和PL-2(3.75%)地區,表明GL地區的內生真菌豐富度高于XF、JS、J、X和PL-2地區。以上數據顯示不同地區的分離率各有不同,且差異較大,表明各地的柴胡根部可培養內生真菌豐富度差異較大。

圖4 各地區分離率Fig.4 Isolation rate in different regions

表4 晉南與晉北各地區分離率anova分析

2.4 不同地區的柴胡根部可培養內生真菌的優勢菌群分析

分析不同地區的柴胡根部可培養內生真菌的物種組成(圖5),晉南地區的優勢菌屬為鐮刀菌屬(Fusarium, 32.18%)、亞隔孢殼屬(Didymella, 15.96%)、曲霉屬(Aspergillus, 8.24%)、異莖點霉屬(Paraphoma, 6.91%)、莖點球屬(Phoma, 5.32%)、鏈格孢屬(Alternaria, 5.05%),在晉南地區柴胡根部可培養內生真菌中的相對豐度均高于5%。晉北地區的優勢菌屬為Fusarium(31.66%)、Aspergillus(15.36%)、Alternaria(9.09%)、Didymella(8.15%)、Paraphoma(7.52%),在晉北地區柴胡根部可培養內生真菌中的相對豐度均高于5%。

圖5 各地區不同分類水平下物種相對豐度Fig.5 Relative abundance of species in different regionsa：屬水平物種相對豐度;b：種水平物種相對豐度;GL～FZ：晉北;LC～HM：晉南a： genus-level relative abundance; b： species-level relative abundance; GL-FZ： The northern part of Shanxi Province; LC-HM： The southern part of Shanxi Province

晉南地區的優勢物種為Didymellabellidis(11.44%)、三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum, 7.98%)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani, 7.45%)、銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum, 5.85%)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus, 5.85%),在晉南地區柴胡根部可培養內生真菌的相對豐度均高于5%。晉北地區的優勢物種為Fusariumacuminatum(14.11%)、Aspergillusfumigatus(11.91%)、Fusariumtricinctum(9.40%)、菊異莖點霉(Paraphomachrysanthemicola, 5.64%)、Didymellabellidis(5.64%)、鏈格孢菌(Alternariaalternata, 5.64%),在晉北地區柴胡根部可培養內生真菌中相對豐度均高于5%。

2.5 不同地區柴胡根部可培養內生真菌的α多樣性分析

α多樣性也被稱為生境內多樣性(within-habitat diversity),是指一個特定地區或生態系統內的多樣性。α多樣性指數包括Chao1指數、ACE指數、香農指數、辛普森指數等。Chao1指數和ACE指數越大,表明某群落物種數目越多;香農指數越大,表明生物多樣性越好;辛普森指數越大,說明群落中種數越多,各種個體分配越均勻,物種多樣性程度越好。

對晉南地區與晉北地區進行共有屬種分析(圖6)發現,晉南地區和晉北地區共有菌屬25個,包括Fusarium、Aspergillus、Alternaria、Didymella、Paraphoma、Phoma、Cladosporium、Phaeosphaeria、Pleosporales、Ascomycota、Earliella、Penicillium等;晉南地區特有菌屬23個,包括Sarocladium、Macrophomina、Irpex等;晉北地區特有菌屬8個,包括Peroneutypa、Ascochyta、Ophiobolus等。晉南地區和晉北地區共有菌種33個,包括Fusariumacuminatum、Aspergillusfumigatus、Fusariumtricinctum、Paraphomachrysanthemicola、Didymellabellidis、Alternariaalternata、Fusariumsolani、Cladosporiumcladosporioides、Didymellaglomerata等;晉南地區特有菌種57個,包括Phomabellidis、Fusariumproliferatum、Fusariumfalciforme、Macrophominaphaseolina、Torulaligniperda等;晉北地區特有菌種32個,包括Alternariaphotistica、Cladosporiumramotenellum、Penicilliumflavigenum、Alternariacarotiincultae、Aspergillusaculeatus等。

圖6 不同地區柴胡根部可培養內生真菌的Venn圖Fig.6 Venn diagram of cultivable endophytic fungal species from roots of Bupleurum chinense in different regions a：屬水平;b：種水平a： genus level; b： species level

對晉南地區與晉北地區進行α多樣性指數差異性分析(圖7)發現,在屬水平上,晉南地區的各α多樣性指數均高于晉北地區,且晉南的Simpson指數顯著高于晉北地區。在種水平上,晉南地區的各α多樣性指數均高于晉北地區,且晉南的Shannon指數與Simpson指數均顯著高于晉北地區。表明晉南地區柴胡根部可培養內生真菌的生物多樣性要高于晉北地區,物種分配的均勻度也好于晉北地區。

圖7 晉南區域與晉北區域柴胡根部可培養內生真菌α多樣性指數差異分析Fig.7 Endophytic fungi can be cultivated in the root of Bupleurum chinense in southern and northern Shanxi α Diversity index difference analysisa：屬水平;b：種水平;*P<0.05a： genus level; b： the species level;*P<0.05

對不同地區的柴胡根部可培養內生真菌進行α多樣性分析。①屬水平：J(2.340)、ZY(2.269)、XF(2.222)3個地區的Shannon指數最高,且J>ZY>XF;Y(0.637)、PL-2(0.637)、KL(0.562)、LQ(0.377) 四個地區的Shannon指數最低,且Y=PL-2>KL>LQ。J(0.871)、XF(0.869)、ZY(0.868)三個地區的Simpson指數最高,且J>XF>ZY;Y(0.444)、PL-2(0.444)、KL(0.375)、LQ(0.219)四個地區的Simpson指數最低,且Y=PL-2>KL>LQ。表明J、XF、ZY 三個地區的生物多樣性最好,且物種分配的均勻度高;Y、PL-2、KL、LQ 四個地區的生物多樣性最差,且物種分配的均勻度較低。ZY(42.000)、WX(33.000)、HY(33.000)三個地區的Chao1指數最高,且ZY>WX=HY;Y(2.000)、PL-2(2.000)、KL(2.000)、LQ(2.000)四個地區的Chao1指數最低,且Y=PL-2=KL=LQ。HY(32.517)、X(30.529)、SY(29.667)三個地區的Ace指數最高,且HY>X>SY;Y(3.000)、PL-2(3.000)、LQ(2.000)三個地區的Ace指數最低,且Y=PL-2>LQ。表明ZY、WX、HY、X、SY 五個地區的群落物種數目最多;Y、PL-2、KL、LQ 四個地區的群落物種數目最少(表5)。②種水平：J(3.048)、HT(2.912)、XF(2.838)三個地區的Shannon指數最高,且J>HT>XF;PL-1(1.003)、Y(0.637)、PL-2(0.637)三個地區的Shannon指數最低,且PL-1>Y=PL-2。J(0.946)、HT(0.928)、XF(0.926)三個地區的Simpson指數最高,且J>HT>XF;PL-1(0.519)、Y(0.444)、PL-2(0.444)三個地區的Simpson指數最低,且PL-1>Y=PL-2。表明J、HT、XF 三個地區的生物多樣性最好,且物種分配的均勻度高;PL-1、PL-2、Y 三個地區的生物多樣性最差,且物種分配的均勻度較低。WX(81.000)、HY(74.167)、XF(56.000)三個地區的Chao1指數最高,且 WX>HY>XF;PG(3.500)、BD(3.500)、KL(3.500)、Y(2.000)、PL-2(2.000)五個地區的Chao1指數最低,且PG=BD=KL>Y=PL-2。HY(95.804)、WX(81.258)、XF(57.486)三個地區的Ace指數最高,且HY>WX>XF;PG(6.000)、BD(6.000)、KL(6.000)、Y(3.000)、PL-2(3.000)五個地區的Ace指數最低,且PG=BD=KL>Y=PL-2。WX、HY、XF 三個地區的群落物種數目最多;PG、BD、KL、 PL-2、Y 五個地區的群落物種數目最少(表6)。

表5 各地區柴胡根部可培養內生真菌α多樣性指數(屬水平)

表6 各地區柴胡根部可培養內生真菌α多樣性指數(種水平)

3 討 論

本研究發現柴胡根部可培養內生真菌的優勢菌屬為Fusarium、Didymella、Aspergillus、Paraphoma、Alternaria。但不同地區的優勢菌屬有所不同,晉南地區的優勢菌屬為Fusarium、Didymella、Aspergillus、Paraphoma、Phoma、Alternaria;晉北地區的優勢菌屬為Fusarium、Aspergillus、Alternaria、Didymella、Paraphoma。結合已有報道及本研究分析發現,Fusarium、Alternaria中部分菌種常為柴胡中的病原菌[35-37],而實驗過程中所用實驗樣品植株并未表現出病態,說明此時柴胡根部微生物菌群還處于動態平衡狀態,隨著柴胡生長年限的延長,生活力的衰退,植物體內菌群失衡,病原菌可能逐漸占據優勢,使植株出現病態[38-39],這可能是柴胡隨著栽培年限變長,病害逐步加重的主要原因。

本研究通過對不同地區的柴胡根部可培養內生真菌的分離率和α多樣性進行差異分析,發現晉南地區與晉北地區的柴胡根部可培養內生真菌豐富度與物種多樣性存在一定的差異。晉南地區柴胡根部可培養內生真菌豐富度要高于晉北地區,晉南地區柴胡根部可培養內生真菌多樣性要顯著高于晉北地區,物種分配的均勻度也好于晉北地區。這與相關學者對杜仲及鎖陽等藥用植物內生菌多樣性的研究結果類似。同時有研究發現不同地理-氣候環境和土壤類型是造成植物內生真菌物種豐度和群落組成差異的主要因素[40-41],而晉南與晉北在地理-氣候環境和土壤類型等方面的差異可能也是造成晉南與晉北地區柴胡根部可培養內生真菌的生物多樣性存在差異的主要原因。

本課題組前期通過測定山西省北部與南部產地的柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷e、柴胡皂苷f、總柴胡皂苷的含量和揮發性物質,發現山西省北部產地的柴胡中柴胡皂苷含量高于山西省南部產地的柴胡[42],而山西省南部產區的柴胡中揮發性物質種類多于山西省北部產區的柴胡[31]。研究發現黃芩中黃酮類物質的含量與黃芩中鏈格孢菌的相對豐度有顯著性關系[4],提示不同產地柴胡中內生真菌的種類與數量可能也是影響柴胡中活性成分產生差異的原因。還有研究發現植物揮發性物質有抑菌效果[43]。而本研究發現,晉南地區柴胡根部可培養內生真菌的優勢物種中有Fusariumsolani(7.45%),因此推斷Fusariumsolani感染柴胡后,有可能刺激柴胡產生揮發性物質進行抗菌實現自我防御。故Fusariumsolani的存在可能是導致柴胡質量下降,揮發性物質增加的主要原因之一。

本研究分析評價了柴胡根部可培養內生真菌的群落結構和物種多樣性,建立了柴胡根部內生真菌庫,為后期研究內生真菌與柴胡的互作,篩選促生菌株、生防菌和可以產生特定次級代謝產物的菌株提供了資源。