一株產低溫蛋白酶地衣芽胞桿菌NWMCC0046全基因組測序及分析

周 魏, 余金鳳, Mohd Sobri Takriff , 向 軍, 馬忠仁, 丁功濤, 周雪雁,2*, 張福梅*

(1.西北民族大學 生物醫學研究中心,甘肅 蘭州 730030;2.西北民族大學 生命科學與工程學院,甘肅 蘭州 730124;3.Universiti Kebangsaan Malaysia, Department of Chemical and Process Engineering, Selangor Bangi 43600 MALAYSIA)

地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)是一種使用廣泛的益生菌,具有對環境友好、促進動物體免疫功能和消化功能等優良特點[1-2]。地衣芽胞桿菌能產生多種抗菌物質及生物活性物質,是近年來病原菌的生物防治、動物飼料和廢物處理等相關領域的研究重點[3]。除此之外,其產生的淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶等應用于酶制劑行業[4-7]。其中,蛋白酶對于洗滌劑、食品、制藥、皮革和廢物處理等行業具有重要意義[8]。而低溫活性蛋白酶由于其結構的靈活性和較高的轉化數(Kcat),已成為目前研究熱點[9]。該菌功能基因可通過全基因組測序深入了解,通過克隆表達地衣芽胞桿菌相關酶基因生產重組酶以滿足不同行業的需求備受研究者青睞[10]。此外,利用全基因組測序和比較基因組學分析從地衣芽胞桿菌挖掘次級代謝產物也備受關注。本研究前期從土壤中分離得到一株地衣芽胞桿菌菌株NWMCC0046,該菌株所產的堿性蛋白酶在低溫下具有良好活性。作為一株具有重大潛力的益生菌,傳統的試驗分析和鑒定方式難以全面解析該菌的功能基因[11]。為深入研究菌株NWMCC0046,本研究使用PacBio RS II平臺和Illumina HiSeq 4000平臺對該基因組進行了測序,同時利用數據庫(GO、KEGG、COG和CAZy)挖掘菌株NWMCC0046的功能基因,預測菌株NWMCC0046的次級代謝產物以及菌株NWMCC0046和近緣菌株的差異性比較分析,以期為高效開發利用菌株NWMCC0046提供生物信息學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)NWMCC0046分離自西藏日喀則地區屠宰場廢棄血污放置土壤[12]。

1.1.2 培養基 ①LB培養基;②發酵培養基(g/L)：豆粕50,葡萄糖10,酵母浸膏13.46,CaCl20.5,Na2HPO4·12H2O 4,KH2PO40.3,pH 7.5。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 干酪素(上海阿拉丁公司);福林酚(北京索萊寶科技有限公司)。超凈工作臺(SW-CJ-1F,蘇州安泰空氣技術有限公司);臺式壓力蒸汽滅菌器(MOST-T24,山東新華醫療器械股份有限公司);隔水式培養箱(GNP-9160,上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 去污試驗 取凍存菌株NWMCC0046于LB培養基活化2代得種子液,將種子液按4%(體積分數)接種到發酵培養基中培養48 h。收集發酵液,5 000 r/min離心10 min,上清液經初步分離純化后得到活性較高的蛋白酶(結果未顯示)。采用茶、咖啡、可樂、巧克力和血液染色過的白色紗布(6.0 cm×7.5 cm),研究蛋白酶作為洗滌劑添加酶在低溫下的去污效果。在加入蛋白酶之前,將洗滌劑溶液(Tide, 7 mg/mL)在90 ℃下孵育1 h,使洗滌劑中存在的內源性蛋白酶失活。20 ℃孵育30 min后,將紗布取出,沖洗干凈,然后干燥。觀察酶對不同污漬的去除效果,未經染色處理的紗布作為對照。

1.2.2 全基因測序與組裝 使用PacBio RS II平臺和Illumina HiSeq 4000平臺對菌株NWMCC0046的基因組進行測序。

1.2.3 基因組組分分析 Glimmer軟件(v3.02)用于組裝結果的基因預測[13];rRNA由RNAmmer軟件(v1.2)預測[14];tRNA區域和二級結構通過tRNAscan-SE軟件(v1.3.1)預測[15];sRNA由Infernal軟件與Rfam數據庫(v9.1)獲得[16]。通過TRF軟件(Tandem Repeat Finder, v4.04)預測串聯重復序列[17]。通過PhiSpy軟件(v3.7.8)預測前噬菌體prophage[18];CRISPRCasFinder軟件(v4.2.19)用于識別CRISPRs[19]。

1.2.4 基因功能分析 ①基因功能注釋：使用基因本體論(Gene Ontology,GO)[20]、同源基因族(Clusters of Orthologous Groups,COG)[21]、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)[22]、碳水化合物相關酶(Carbohydrate-Active enZYmes Database,CAZy)[23]四個數據庫進行一般功能注釋。②比較基因組學與系

統發育分析：目標基因組和參考基因組間的共線性關系使用MUMmer軟件(v3.23)進行比對。使用LASTZ(v1.03.54)確定基因組之易位和倒置等區域。采用Treebest(Neighbor-Joining, NJ)軟件(v1.9.2)基于基因家族構建進化樹。③次級代謝產物分析：利用anti-SMASH 3.0 (https：//fungismash.secondarymetabolites.org)對菌株NWMCC0046中次級代謝產物合成基因簇進行預測[24]。

2 結果與分析

2.1 去污效果

堿性蛋白酶能將難溶的蛋白類大分子分解成較小的肽段,而肽段容易溶解在水中或被表面活性劑乳化,從而達到更佳的去污效果。當洗滌劑(Tide)與菌株NWMCC0046堿性蛋白酶在20 ℃下聯合使用時,去污效果比單獨使用洗滌劑更好(圖1)。相比傳統的加酶洗滌劑,低溫蛋白酶的洗滌劑將會更受歡迎,因為它能夠彌補洗滌劑在低溫時去污力的不足。

圖1 地衣芽胞桿菌NWMCC0046堿性蛋白酶的去污效果Fig.1 Stain removal activity of the alkaline protease from B. licheniformis NWMCC0046對照組為未經處理的紗布;洗滌劑組僅用洗滌劑處理;洗滌劑+蛋白酶組為二者聯合去污。洗滌劑(Tide)7 mg/mL,菌株NWMCC0046的蛋白酶活性281.91 U/mLControl group is the gauze without any treatment;Detergent group is treated with detergent only; Detergent plus protease group is the combined decontamination of both. Detergent (Tide) 7 mg/mL, protease activity of NWMCC0046 281.91 U/mL

2.2 菌株NWMCC0046全基因組概況

菌株 NWMCC0046全基因組大小為4 321 565 bp,GC含量為46.78%,含4 504個編碼基因;含有串聯重復序列(Tandem Repeat, TR)71個,總長度為15 438 bp;50個小衛星(Minisatellite) DNA,總長度為6 096 bp;微衛星(Microsatellite) DNA 5個,總長為 10 103 bp。含有 tRNA 81個,5S rRNA、16S rRNA 和 23S rRNA各8個,sRNA 42個。菌株NWMCC0046全基因組圖譜如圖2所示，菌株NWMCC0046的全基因組信息與其近緣芽胞桿菌(Bacillus)比較分析結果見表1。

表1 地衣芽胞桿菌NWMCC0046全基因組特征及其與其他近緣芽胞桿菌比較

圖2 菌株NWMCC0046全基因組圖譜Fig.2 Complete genome mapping of strain NWMCC0046圖A最外圈為基因組序列位置坐標,由外到里,分別為編碼基因、基因功能注釋結果(包含COG、KEGG、GO數據庫的注釋結果信息)、ncRNA、基因組GC含量(向內的紅色部分表示該區域GC含量低于全基因組平均GC含量,向外的綠色部分與之相反,且峰值越高表示與平均GC含量差值越大)、基因組GC skew值(以G-C/G+C表示,向內的粉色部分表示該區域G的含量低于C的含量,向外的淺綠色部分與之相反)。圖B表示NWMCC0046基因組中COG、KEGG和GO基因功能注釋分析以及ncRNA分類,不同顏色代表不同功能,各大功能數據庫的顏色無任何相關性The outermost circle of figure A is the genomic sequence position coordinates. From the outside to the inside, they are coding genes, gene function annotation results (containing annotation result information from COG, KEGG, GO databases), ncRNA, GC content (inward red part indicates that the GC content of the region is lower than the average GC content of the whole genome, outward green part is the opposite, and the higher peak indicates the greater difference with the average GC content), GC skew value (expressed as G-C/G+C, inward pink part indicates that the G content of the region is lower than the C content, the outward light green part is the opposite). Figure B indicates the functional annotation analysis of COG, KEGG and GO genes in NWMCC0046 genome and ncRNA classification, various colors mean that different functions and the colors of major functional databases do not have any correlation

2.3 基因功能注釋

2.3.1 GO注釋結果 通過GO數據庫注釋,得到菌株NWMCC0046功能基因的分布情況如圖3所示。GO數據庫按照生物過程(Biological Process)、細胞組分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function) 三個方面對基因進行注釋。細胞過程(Cellular Process)和代謝過程(Metabolic Process)相關編碼基因各有1 387、1 372個,表明該菌具有高度的代謝活性;在細胞組分中,共955個基因得到注釋,其中有713個與細胞結構實體(Cellular anatomical entity)編碼基因表現出高相關性;分子功能分支共3 036個注釋結果,其中結合(Binding)、催化活性(Catalytic Activity)和轉運活性(Transporter Activity)有關編碼基因分別為1 008、1 498、255個。

圖3 基于GO注釋的功能基因的分布情況Fig.3 Distribution of functional genes based on GO annotationBP：生物過程;CC：細胞組分;MF：分子功能BP：Biological process; CC：Cellular component; MF：Molecular function

2.3.2 COG注釋結果 將菌株NWMCC0046基因組中的編碼基因與COG數據庫進行比對,共有3 132個蛋白編碼基因被注釋到(圖4)。它們大多集中在碳水化合物的運輸和代謝(carbohydrate transport and metabolism)以及氨基酸的運輸和代謝(amino acid metabolism)。此外,α-淀粉酶、三糖磷酸酯異構酶、6-磷酸甘露糖異構酶和6-磷酸葡萄糖異構酶等眾多酶類的編碼基因也存在于NWMCC0046基因組中。α-淀粉酶作為工業上廣泛使用的一種具有廣泛底物偏好和產品特異性的酶,可產生葡萄糖和麥芽糖。此外,我們發現了編碼運輸各種底物,包括氨基酸、肽、糖、鐵、核苷酸和其他小分子的MFS超家族轉運蛋白(major facilitator superfamily, MFS)的44個編碼基因。磷酸轉移酶系統(The phosphotransferase system, PTS)和ABC轉運體系統(ABC transporter system, ABC)在促進宿主能量儲存和代謝方面發揮著關鍵作用[25]。在地衣芽胞桿菌NWMCC0046的全基因組中共發現了65個參與PTS系統的基因,如編碼蔗糖的scrA基因、編碼纖維二糖的celB基因和編碼抗壞血酸的ulaA基因。此外,菌株NWMCC0046的基因組中還有ABC轉運滲透酶、ABC轉運ATP結合蛋白和氨基酸ABC轉運滲透酶。細菌通過碳水化合物磷酸轉移酶系統將許多碳水化合物運送到細胞中,促進了新陳代謝過程。這些結果表明,菌株NWMCC0046具有降解蛋白質和碳水化合物的良好潛力,對于胃腸道具有特殊的適應性。

圖4 基于COG注釋的功能基因的分布情況Fig.4 Distribution of functional genes based on COG annotation

2.3.3 KEGG注釋結果 在 KEGG 數據庫中,對應到 KEGG代謝通路的2 602個基因富集在226條代謝通路中。碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)和膜運輸(membrane transport)是最主要的三種代謝通路,分別有315、234和191個基因注釋結果;此外,輔酶和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、信號轉導(signal transduction)、能量代謝(energy metabolism)、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、脂質代謝(lipid metabolism)通路與菌株也具有較高的相關性(圖5)。地衣芽胞桿菌NWMCC0046含有編碼多種胞外蛋白酶的基因(aprX、apre、epr、vpr、isp)以及多種內肽酶和外肽酶等酶的基因(Glup、degP、htrA、sppA、amps、bpr、dacC)。此外,還發現了多種酶(表2)。菌株NWMCC0046含有多種抗氧化酶的編碼基因,如與完整的硫氧還蛋白有關的基因,包括三個編碼硫氧還蛋白的trxA基因,兩個編碼硫氧還蛋白還原酶的trxB基因,三個編碼硫醇過氧化物酶的tpx基因。結果顯示該菌參與了包含苯丙氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸代謝途徑,表明該菌可為食品提供特定的風味。此外,我們還發現了參與抗生素、生物降解等代謝過程有關基因以及可調控免疫和炎癥的通路(包括IL-17信號通路和NOD-like受體信號通路)的組織系統通路相關基因。該菌還存在著多樣且復雜的調節基因和信號傳遞系統(群體效應),可調控植物的病原菌的致病機制。

表2 地衣芽胞桿菌NWMCC0046基因組中鑒定的部分酶

圖5 基于KEGG注釋的功能基因的分布情況Fig.5 Distribution of functional genes based on KEGG annotation

2.3.4 CAZy功能分析 根據CAZy預測結果,菌株NWMCC0046含79個糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases, GHs)和34個糖苷轉移酶(Glycosyl Transferases, GTs)。GHs和GTs是一組關鍵酶,可以水解碳水化合物的糖苷鍵,并負責維持被宿主免疫系統識別的表面結構[26]。菌株NWMCC0046包含殼聚糖酶(chitosanase, EC 3.2.1.132)、幾丁質酶(chitinase, EC 3.2.1.14)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, EC 3.2.1.21)、乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase, EC 3.1.1.72)、纖維素酶(cellulase, EC 3.2.1.4)、地衣酶(licheninase, EC 3.2.1.73)等酶的編碼基因。地衣酶在動物飼料、釀酒、生物燃料等產業中發揮關鍵作用,可與其他酶協同作用生產生物乙醇,包括通過生物轉化各種植物木質纖維素。地衣芽胞桿菌在土壤中廣泛存在的原因之一在于其能利用這些酶維持自身正常代謝。CAZy數據庫表明菌株NWMCC0046具有優秀的益生菌能力,可用于病原體的防御和工業酶的生產。

2.4 菌株NWMCC0046的進化和比較基因組學分析

利用基因家族構建物種進化樹(圖6),結果表明菌株NWMCC0046與B.licheniformisATCC14580、B.licheniformisDSM30615、B.licheniformisATCC9789、B.licheniformisTCCC11148處于同一分支,其親緣關系特別近,同屬地衣芽胞桿菌。菌株NWMCC0046與B.licheniformisATCC14580的全基因組共線性分析表明,兩株基因組高度相似,但存在翻轉、易位等基因組重排(圖7)。兩者在氨基酸水平上既相似,又有獨特之處。生存環境不同導致兩株菌基因組及功能有差異, 菌株NWMCC0046存在大量環境信息處理相關基因。

圖6 物種間的進化關系圖Fig.6 Map of evolutionary relationships among species海內氏芽胞桿菌NRRLB-41327作為外群,分支長度表示進化距離的大小Bacillus haynesii NRRLB-41327 as an outgroup, and the branch length indicates the evolutionary distance

圖7 地衣芽胞桿菌NWMCC0046與ATCC14580的共線性分析Fig.7 Synteny analysis of B. licheniformis NWMCC0046 and B.licheniformis ATCC14580上行為樣品基因組,下行為對照基因組。褐色代表基因組序列的正向鏈;藍色代表基因組序列的反向鏈;粉色代表共線性區域;青綠色代表易位區域;黃色代表倒置區域;綠色代表易位兼倒置的區域The upper row is the sample genome and the lower row is the reference genome. Brown indicates the forward strand of the genome sequence; blue represents the reverse strand of the genome sequence; pink means the co-linear region; turquoise represents the translocation region; yellow represents the inverted region; green stands for the translocation-cum-inversion region

2.5 次級代謝產物合成基因簇

采用anti-SMASH對菌株NWMCC0046基因組進行次級代謝產物分析，預測得到11個次級代謝產物基因簇，結果見表4。其中包含5類具有抗菌活性的物質：地衣素(lichenysin)、豐原素(fengycin)、桿菌肽(bacitracin)、桿菌素(bacillibactin)和丁酰苷菌素(butirosin)。菌株NWMCC0046基因組中還存在6種功能未知的基因簇，其中嗜鐵素(siderophore)、III型聚酮合成酶(Type Ⅲ polyketide synthase，T3PKS)、萜類(Terpene)、核糖體合成和翻譯后修飾的肽(RiPP)、環二肽合酶(CDPS)和套索肽(lassopeptide)各一種。與其親緣關系較近的芽胞桿菌屬相比，菌株NWMCC0046含有額外的次級代謝產物基因簇，結果見表5。這表明菌株NWMCC0046中可能存在合成新物質的基因簇，再加上其獨特的生物奪氧作用機制，在農業方面具有較大應用潛力。

表4 菌株NWMCC0046次級代謝產物合成基因簇

表5 近緣芽胞桿菌間次級代謝產物基因簇對比表

3 討 論

本文研究了菌株NWMCC0046所產低溫蛋白酶在洗滌行業的應用潛力,使用PacBio RS II平臺和Illumina HiSeq 4000平臺對菌株NWMCC0046基因組進行了測序,得到了菌株NWMCC0046的基因組序列信息。該蛋白酶能作為洗滌劑添加酶有效去除污漬,菌株NWMCC0046基因組中存在眾多蛋白酶編碼基因以及工業酶基因。與眾多數據庫比對結果表明,該菌具有優秀的益生菌潛力,包括抗氧化活性、抗菌活性。菌株NWMCC0046基因組中包含了抗生素和生物降解等代謝過程。此外,其獨特的胃腸道適應性以及優秀的氨基酸代謝能力為其在飼料行業奠定基礎。通過比較基因組分析,菌株NWMCC0046為地衣芽胞桿菌,與地衣芽胞桿菌ATCC14580具有良好共線性。同時發現了幾種重要的次級代謝產物,是具有很大應用潛力的一株益生菌。

地衣芽胞桿菌NWMCC0046堿性蛋白酶在低溫下的去污效果表明其在洗滌行業的巨大潛力。低溫蛋白酶在保證催化效率的前提下可以降低反應溫度和縮短反應時間,在洗滌劑配方、食品行業和其他生物技術實踐中有很大優勢。地衣芽胞桿菌NWMCC0046除了能產蛋白酶外,還預測到幾丁質酶、殼聚糖酶、地衣酶以及α-淀粉酶的編碼基因。此外,菌株NWMCC0046對于胃腸道獨特的適應性表明其在飼料行業的潛力,通過添加地衣芽胞桿菌的飼料可以有效提高粗蛋白的消化率[27],有效替代抗生素[28],調節腸道菌群結構改善腸道健康[29]。通過全基因組序列分析預測到菌株NWMCC0046還具有抗氧化活性和抗菌活性。Qin等[30]研究表明地衣芽胞桿菌可以有效改善草魚抗氧化能力,包括血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性的提高和丙二醛(MDA)水平的降低,以及腸道中抗氧化酶(MnSOD)和過氧化氫酶(CAT)mRNA水平的上調。Zhao等[31]通過添加含地衣芽胞桿菌的日糧飼喂肉雞,結果表明地衣芽胞桿菌可改善回腸、血清和肝臟中抗氧化酶的活性。地衣芽胞桿菌包括其產生的生物活性物質可以有效抑制病原菌的生長[32]。芽胞桿菌屬之間的親緣關系特別近,利用16S rRNA基因序列和脂肪酸譜分類等常規手段無法準確區分;菌株NWMCC0046經16S rRNA基因序列比對,發現其與B.haynesiiNRRLB-41327親緣性高達99.74%,但這樣的結果似乎不太精確。利用基因家族確定菌株NWMCC0046的精準分類,結果表明其與地衣芽胞桿菌同屬一個分支。同時測序結果表明菌株NWMCC0046基因組成分B.licheniformisATCC14580共線性較好。但由于兩株菌來源不同,獨特環境使菌株NWMCC0046編碼許多獨特功能基因,因此基因組出現了重排現象。微生物產生的次級代謝產物具有多種多樣的化學結構和生物活性,有很高的價值。地衣素與豐原素可以通過破壞細胞膜的完整性來抑制真菌的生長[33]。桿菌肽屬多肽類抗生素,通過特異性地抑制細菌細胞壁合成階段的脫磷酸化起到抗菌作用[34]。El-Deep等[35]利用桿菌肽能顯著降低梭菌及大腸埃希菌的數量,并能顯著提升腸道中乳桿菌的數量。本研究中發現的丁酰苷菌素基因簇與BGC0000693來源的最高相似度僅為7%,說明該基因簇可能合成新的抑菌物質。植物可以利用微生物產生的嗜鐵素所螯合的鐵, 改善植物的鐵營養, 以防治堿性缺鐵土壤植物缺鐵失綠癥[36-37],推測菌株NWMCC0046可用于防治植物病害。綜上所述,本研究表明地衣芽胞桿菌NWMCC0046是具有潛在功能的益生菌,實驗結果為地衣芽胞桿菌NWMCC0046益生菌特性提供了新的分子基礎見解。