遼寧省首株柯薩奇病毒B組5型全基因組序列分析

雷 露, 于 偉, 張 倩, 王 博, 孫英偉, 毛玲玲

(遼寧省疾病預防控制中心,遼寧 沈陽 110005)

引起手足口病的腸道病毒主要為新型腸道病毒(Enterovirous)71型、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)A組和B組、?？刹《?ECHO)等,早期對手足口的病原學檢測以EV71和CVA16為主,隨著對手足口病病原的深入了解及檢測技術的發展,人們把目光轉向了非EV71、非CVA16腸道病毒基因型的研究?？滤_奇病毒B組5型(CV-B5)是柯薩奇病毒B組的一員,原型株為Faulkner,于1952年在瑞典首次分離[1]。由其引起的手足口病、心肌炎、病毒性腦炎、急性弛緩性麻痹等多種疾病在國內外均有流行：1999年至2011年韓國第三大常見腸道病毒[2];2000年至2004年法國第四高發腸道病毒[3];2009年山東省臨沂市手足口病暴發疫情[4];2013年至2014年江蘇省邳州市皰疹性咽頰炎病例中檢測到CV-B5[5];2018年至2019年云南省昆明市手足口病和皰疹性咽頰炎病例中也檢測到[6]。遼寧省歷年監測數據顯示[7-10],非EV71、非CVA16腸道病毒在我省手足口病發病病原譜中所占比例逐年增加,2015年首次超過50%,達到62.04%;2017年占比51.05%;2018年高達86.80%。這與北京[11]、安徽[12]、深圳[13]、武漢[14]等地手足口病的病原變化特征相似。鑒于國內外流行趨勢,應加強對非EV71、非CVA16腸道病毒的監測,掌握遼寧省手足口病病原的構成變化及其他腸道病毒病原的遺傳進化情況。CV-B5血清型的流行病學數據在全世界有限,國內還沒有被納入疾病監測系統,很難評估疾病負擔。腸道病毒普遍存在重組現象,近年來引起手足口病的病原體也在不斷變化,因此本研究對遼寧省首株CV-B5 分離株進行了全基因組測序,并對測序結果進行進化與重組分析,從分子水平解釋病毒遺傳變異及流行規律,希望能對遼寧省CV-B5 的分子流行病學研究和相關疾病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 2018年遼寧省14個地級市疾控中心報告手足口病例的咽拭子及糞便標本。各市完成腸道病毒通用核酸檢測后,陽性標本(糞便1 880份,咽拭子1 916份)一個月內送至遼寧省疾控手足口設備實驗室。

1.1.2 主要試劑與儀器設備 人橫紋肌瘤細胞(RD)為本單位凍存;DMEM、小牛血清為美國Gibco公司生產;Pen-Strep solution(青霉素、鏈霉素)為Biological Industries生產;提取試劑為碩世生物病毒核酸提取試劑盒(磁珠法)提取試劑盒。全自動核酸提取儀(SSNP-9600A,江蘇碩世生物科技公司);PCR擴增儀(EDC-810,北京東勝);熒光定量擴增儀(Viia7,美國ABI);水平電泳儀(Bio-rad Mini-Sub Cell 1704469,美國伯樂);凝膠成像儀(Bio-rad GelDoc XR+,美國伯樂);使用HiScript II One Step RT-PCR Kit(諾唯贊)對CV-B5進行全基因組富集擴增。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 糞便和咽拭子核酸陽性標本經處理后接種RD細胞,在36 ℃和5%的CO2條件下培養5～7 d,每天在顯微鏡下觀察,當75%的培養物出現細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE)時,收獲病毒培養物上清液進行腸道病毒分型的核酸檢測,若連續兩代均沒有發生病變,則判斷為陰性。樣品處理和病毒分離培養具體操作參照《手足口實驗室手冊(2010第4版)》。

1.2.2 核酸提取腸道病毒檢測與分型 病毒RNA使用碩世生物病毒核酸提取試劑盒(磁珠法)進行核酸提取。腸道病毒所有型別鑒定使用碩世生物熒光定量試劑盒進行核酸檢測。

1.2.3 CV-B5全基因組RT-PCR擴增 使用HiScript II One Step RT-PCR Kit對CV-B5的全基因組進行富集擴增。參照文獻[15]設計引物序列上游引物：TTAAAACAGCCTGTGGGTTGT;下游引物：ATTCTCCGCATTCGGTGCGG。反應體系：RNase Free Water 13 μL,5*QIAGEN One Step RT-PCR Buffer 5 μL,QIAGEN One Step RT-PCR Enyzme Mix 1 μL,Ribonuclease inhibitor(50 U/μL) 0.1 μL,上下游引物(20 μmmol/L)各0.5 μL,模板5 μL。反應條件：50 ℃ 30 min;95 ℃ 15 min; 95 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min,40個循環;72 ℃ 10 min。凝膠電泳檢測擴增產物。

1.2.4 序列測定和分析 用Qubit進行定量分析后送至上海伯杰醫療科技有限公司進行高通量測序,測定后返還拼接序列。拼接序列通過NCBI網站進行在線BLAST比對,在GenBank上下載CV-B5流行株、原型株和主要血清型的全基因組序列(參考株GenBank登錄號見圖1)進行同源性分析和進化分析,基因進化樹利用MEGA 5.2軟件構建,采用鄰接法,自展值設置為1 000。

圖1 柯薩奇病毒B組5型分離株全基因組序列系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on complete genome sequences among Lianing and other coxsackievirus B5 strains

1.2.5 重組分析 重組分析采用RDP4和SimPlot 3.5.1軟件,選擇默認參數。

2 結果與分析

2.1 全基因組測序及核酸序列同源性分析

將分離到的CV-B5毒株(LN2018-23-21/CHN/2018)進行全基因序列擴增,測序拼接后得到的CV-B5基因組全長7 357 bp,GC含量47.66%,包括5′非編碼區(5′-untranslated region,5′-UTR),3′-UTR和一個編碼2 307個氨基酸的開放讀碼框。5′端非編碼區(5′-UTR)長720 bp,與病毒的復制和翻譯有關;3′端非編碼區(3′-UTR)長100 bp,與病毒RNA的合成有關。編碼區為6 558 bp,由P1、P2、P3三個部分組成,P1區負責編碼結構蛋白,P2、P3區負責編碼非結構蛋白。P1區可分為 VP4、VP2、VP3 和 VP1,VP1區蛋白包含多個抗原結合位點,是腸道病毒分子分型的主要標志。P2 區 分 為 2A、2B 和 2C,P3 區 分 為 3A、3B、3C 和3D,它們負責編碼各種酶和功能蛋白。測序結果在美國生物技術信息中心網站進行BLAST分析,顯示序列與CV-B5同源性最高。

2.2 預測蛋白序列及同源性分析

將遼寧分離株與原型株、國內流行株進行核苷酸和氨基酸同源性分析。該流行株與國內流行株的全基因組核苷酸序列同源性為78.5%～98.8%,氨基酸序列同源性為75.3%～96.7%,與山東分離株MN541028/SD/CHN/2018同源性最高,與原型株全基因組核苷酸序列同源性為78.9%,氨基酸序列同源性為76%,與CV-B5原型株VP1區序列對比發現,該分離株在第7、19、91、125、132、156、180、268、273、276和279共11處位點發生了替換(表1)。

表1 遼寧柯薩奇病毒B組5型(CV-B5)分離株VP1變異位點Table 1 VP1 mutation of coxsackievirus B5 (CV-B5)strains isolated in Liaoning

2.3 進化分析

通過MEGA5.2軟件(neighbor-joining)對遼寧分離株和不同國家、地區在不同年份的流行株進行系統進化分析。從GenBank上下載36株CV-B5基因組全長序列作為參考株,將LN2018-23-21/CHN/2018與參考株序列基于全基因組核苷酸序列構建種系進化樹(圖1)。

進化樹分析結果表明,可將CV-B5流行株劃分為A～D四個基因型?；蛐偷膭澐煮w現了CV-B5在地理和時間上的分布差異。A基因型只包含原型株Faulkner;B基因型包含2000年韓國分離株;C基因型則是中國大陸2008年至2015年的主要優勢流行基因型,此外還包括兩株日本流行株(2011年、2015年)和1株2015年美國流行株;D基因型主要為國外流行株及國內2015年以后的流行株,包括2株2015年瑞士分離株,3株2013年至2017年美國分離株,3株2008年至2019年日本分離株,3株2008年至2017年澳大利亞分離株,3株2018年山東分離株及本次遼寧分離株。

2.4 重組分析

為了確定LN2018-23-21/CHN/2018在其進化過程中是否與其他腸道病毒B群發生重組,在GenBank上選取了同源性最高的基因序列,通過RDP軟件,運用4MaxChi、RDP、BootscanChimaera、SiScan和3Seq方法分析,發現LN2018-23-21/CHN/2018有三處重組。第一處開始斷裂點在697,結束斷裂點為832(MaxChi法,P=2.148×10-2),親本序列為KP289438/BEIJING/CHN/2013和AF114383/Faulkner;第二處開始斷裂點在1 164,結束斷裂點為3 326,(RDP法,P=1.400×10-15),親本序列為M16572/CV-B3和JX017382/Henan/CHN/2011;第三處開始斷裂點在5 916,結束斷裂點為7 380(3Seq法,P=1.831×10-14),親本序列為AF114383/Faulkner和AF081485/CV-B2。

為進一步驗證重組分析結果的可靠性,運用SimPlot 3.5.1軟件以LN2018-23-21/CHN/2018為質詢序列,對遼寧分離株、親本序列及其他EV-B原型株序列進行相似性分析(圖2)。結果顯示,在P3區的3D區段,與AY875692顯示出約70%以上的相似性,在6 400左右相似度迅速下降,最低時僅為50%。

圖2 遼寧分離株(LN2018-23-21/CHN/2018)與柯薩奇病毒B組腸道病毒主要血清型原型株序列重組分析Fig.2 Recombination analysis based on complete genome of LN2018-23-21/CHN/2018 and enterovirus B strainsA：LN2018-23-21/CHN/2018 Similarity plot分析;B：LN2018-23-21/CHN/2018 bootscanning分析A：LN2018-23-21/CHN/2018 Similarity plot analysis;B：LN2018-23-21/CHN/2018 bootscanning analysis

3 討 論

CV-B5作為柯薩奇病毒B組的成員,屬單股正鏈RNA病毒,RNA病毒會因為缺乏聚合酶修正功能而易引起基因突變,具有高進化率特點[16]。在編碼結構蛋白的P1區域,尤其是編碼主要中和抗原位點的VP1區,氨基酸序列較為保守,進化方式主要是點突變[17]。從進化分析結果看,與CV-B5原型株Faulkner的全基因組核苷酸序列同源性為78.9%,氨基酸序列同源性為76%;與CV-B5原型株Faulkner的VP1氨基酸序列相比,遼寧分離株共有11處發生替換。與VP1區相比,全基因組的同源性相對較低,這可能與腸道病毒的重組事件通常發生在非結構性編碼區有關。與原型株相比,遼寧分離株在VP1區發生的替換中,7、91、125、132、268和273這六處和天津市2014年至2016年流行株的替換位置和替換序列一致[18]。VP1區因其與抗原性密切相關,這段區域發生氨基酸替換極有可能影響蛋白質空間構象,導致毒力變化[19],這也是造成病毒暴發和流行的主要原因。據報道,19、156、180、276四處氨基酸變異位點還是區分基因型C型和D型的特征性位點[20],本次分離株在這四個位點均發生了變異,這與本研究基因分型結果相互吻合、相互印證。

依據腸道病毒和CV-B5的分型標準,本研究將CV-B5流行株劃分為A～D四個基因型。C 基因型是我國主要優勢基因型[19],以中國大陸2008年至2015年的主要優勢流行基因型為主,此外還包括兩株日本流行株(2011年、2015年)和一株2015年美國流行株。D基因型國內以2015年以后的流行株為主,本次遼寧分離株屬于D基因型,與2018年山東一分離株同源性最高,推測是由于人口流動造成的毒株跨地區傳播事件。而與我國其他地區分離的CV-B5毒株核苷酸和氨基酸序列存在一定差異,提示隨著時間的推移,CV-B5毒株已經發生一定程度的變異。

病毒進化有多種進化方式,基因重組是一個重要途徑,基因重組所形成的病毒的遺傳變異,遠比單純由突變造成的變異所引起的變化更大[21]?；蛑亟M事件頻繁發生于腸道病毒的非結構蛋白編碼區,如云南分離株 A210在 3D區與CV-B3發生重組,河南分離株19CSF與吉林分離株CC10在2C區與CV-B3發生重組,河南分離株在P3區與CV-B4發生重組[21-25]。本研究通過RDP4重組分析,獲得可能產生的重組信息,再采用SimPlot3.5.1軟件進行相似性分析,對潛在重組信號的可靠性檢驗加以驗證。結果表明,遼寧分離株在6 157～6 719 bp位點與AY875692 CV-B5/CSF/KOR/2000發生重組?；贑V-B5基因組結構分析,此段重組位于P3的3D區,屬于非結構編碼區,與以往報道的引發HFMD的CV-B5毒株重組位置一致[25-26]。結合國內關于CV-B5重組的研究[27-30]可以看出,重組事件的發生在國內CV-B5分離株中是一種常見現象。病毒的進化會導致毒力改變、傳播力增強、組織親嗜性改變,重組毒株可能會使原來一些非致病或低致病病原體變為高致病性病原體,造成疾病的傳播,增加疾病負擔。

遼寧省歷年手足口病病原監測情況結果表明,非EV-71、非CA-16的其他腸道病毒的檢出持續上升。加大CV-B5的監測力度,開展全基因組測序和分析,有助于了解腸道病毒的基因特征和進化規律,為手足口相關疾病的防控提供參考。