腫瘤干細胞療法在三陰性乳腺癌分子分型及靶向治療中的應用研究進展

宋緯巍 孫金麗綜述 牟 為審校

乳腺癌已經成為全世界發病率最高的癌癥，是全世界女性因癌癥死亡首要原因[1]。目前乳腺癌發展出不同分類亞型，三陰性乳腺癌(TNBC)雖僅占乳腺癌發病種類的10%～20%，卻導致了近70%的因患乳腺癌而發生的死亡。TNBC是一種癌組織中雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)均為陰性，人表皮生長激素受體-2(HER-2)不存在過表達的乳腺癌亞型，由于缺乏治療性靶向激素受體以及不存在HER2 蛋白過度表達，難以進行分子靶向治療和內分泌治療。此外，TNBC的細胞分型發現其具有較高的腫瘤干細胞亞型，可能調控TNBC早期轉移、復發耐藥并最終導致患者總體預后不佳[2]。腫瘤干細胞(CSC)是一種分化水平較低，且具有類似干細胞自我更新能力和更高的分化潛能的腫瘤細胞類型。腫瘤干細胞可以通過分裂產生腫瘤組織中其他分化程度更高的腫瘤細胞，增強腫瘤的異質性，為腫瘤治療帶來更大的挑戰。研究表明，從腫瘤組織中分離出來的腫瘤干細胞在被移植到患嚴重聯合免疫缺陷病(SCID)小鼠中后，仍可形成新的腫瘤，而其他腫瘤細胞不具有這種異種移植的能力[3]，這也提示我們腫瘤干細胞可能作為腫瘤轉移的種子，促進腫瘤轉移后新的腫瘤的形成[4]。

干細胞特定的生物標志物可作為腫瘤轉移及耐藥相關信號通路的組成部分，在腫瘤的進展中起到關鍵作用。在乳腺癌中，少量具有CD44+/CD24-表型的細胞，高醛脫氫酶(ALDH)活性細胞的亞群即可在體外形成乳腺癌組織，并使免疫缺陷的小鼠發生乳腺癌[5]。因此，CD44+/CD24-表型和高醛脫氫酶(ALDH)活性被認為是TNBC腫瘤干細胞的經典特征。后續深入的體內體外研究均證實，CD44作為TNBC腫瘤干細胞經典的生物標志物，可以通過與配體透明質酸(HA)的結合導致TNBC的靶向轉移，其特異性抗體可以降低乳腺癌細胞的侵入性[5]。高醛脫氫酶(ALDH)活性可以通過激活缺氧誘導因子(HIF-2)，降低細胞內的ROS水平，防止在化療和放療中腫瘤細胞氧化應激產生大量ROS從而導致的細胞死亡，使腫瘤干細胞有高度耐藥性[6]。而干細胞中活化的信號通路也促進了腫瘤發展，Wnt通路在干細胞中的活化抑制了β-catenin磷酸化的高表達，導致了上皮-間質轉化基因的轉錄增加，促進了腫瘤轉移[7]。

然而隨著新技術的發展以及對于腫瘤微環境等理論認識的深入，對于TNBC腫瘤干細胞的認識不再限于CD44和ALDH。TNBC腫瘤干細胞對于乳腺癌進展的影響研究以及藥物的研發得到了一定的突破，但關于TNBC腫瘤干細胞對宿主腫瘤微環境的整體影響，對特異器官的惡性靶向轉移和復發耐藥的影響仍需進一步研究。

1 腫瘤干細胞調控TNBC的發生發展

1.1 腫瘤干細胞促進TNBC惡性轉移

TNBC具有高度轉移傾向，其遠端轉移與預后不佳有關[8]。經典的腫瘤轉移“種子-土壤”理論認為，腫瘤細胞通過血液或淋巴系統隨機轉移，但僅在第二靶器官微環境(土壤)適合腫瘤細胞(種子)時，腫瘤才會定殖并形成轉移灶[9]。傳統的乳腺癌轉移模式中，原發性乳腺癌的腫瘤細胞經歷了上皮-間質過渡(EMT)，從而進入淋巴循環，并在形成合適的腫瘤轉移前微環境的器官形成轉移灶[1]。在對于發生轉移的乳腺癌患者淋巴循環中的腫瘤細胞測序發現，這些乳腺癌細胞與原發性乳腺癌腫瘤干細胞在轉錄水平上高度一致[10]。這表明，乳腺癌腫瘤干細胞可以通過EMT進入淋巴結，在腫瘤原發及靶器官部位通過間質-上皮轉換定植，同時逃避免疫細胞的殺傷，與“土壤”即腫瘤轉移微環境相互作用，從而形成新的腫瘤轉移灶[9]。TNBC腫瘤干細胞還可能通過與腫瘤微環境的相互作用增強其在轉移后定植的能力。研究發現，腫瘤干細胞有更強的適應和重塑微環境的能力[11]。TNBC腫瘤干細胞具有CXCR4高表達的特點，CXCR4高表達的TNBC腫瘤干細胞向CXCR12高表達的組織進行轉移，再通過CXCR12的高表達招募其他CXCR4高表達的免疫細胞，血管內皮細胞等，重塑腫瘤微環境，通過這些細胞分泌IL-1β，TGF-β等細胞因子，支持轉移腫瘤的生長[12]。TNBC腦轉移后，腫瘤微環境中高水平的IL-1β會促進鄰近星形膠質細胞高表達Jagged1，激活腫瘤干細胞的Notch信號，IL-1β與Notch相互作用能誘導腫瘤干細胞自我更新[13]；Jagged1激活的細胞釋放ICN1與ICN3，作用于腫瘤干細胞Notch基因轉錄起始位點上游2,085bp的RBP-Jκ序列，促進IL-1β分泌，間接提高CCL2水平，募集腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophage,TAM)與單核細胞于腫瘤病灶，形成免疫浸潤，導致TNBC不良預后[14]。除此之外，TNBC腫瘤干細胞具有CD44陽性的特點，CD44在受到磷酸化信號后，可以激活下游轉錄信號造成TGF-β的高表達[15]，TGFβ通過作用于宿主腫瘤微環境促進腫瘤生長，特別是通過促進腫瘤微環境中的內皮細胞發生上皮-間質轉換，再誘導間質細胞進一步分化為腫瘤相關成纖維細胞(CAF)，成纖維細胞通過分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)或細胞因子進一步促進上皮-間質過渡。此外，成纖維細胞通過 PAR1 依賴Ca2+信號和MMP表達水平上升增強原始非侵入性腫瘤細胞的侵入性[16]，MMP促進ECM的降解，解離細胞粘附分子，從而增強腫瘤細胞的侵襲性[17]；TGFβ通過抑制CD8陽性T細胞中的孔隙形成蛋白(PFP)表達，抑制T細胞活化誘導的細胞死亡(activation-induced cell death)，抑制抗腫瘤免疫[18]；TGFβ觸發腫瘤血管生成，以自分泌/旁分泌方式，以及與其他信號級聯的合作作用，包括血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、Notch、結締組織生長因子(CTGF)和血管生成素，通過促進內皮細胞遷移和增殖刺激血管生成[15]。

1.2 腫瘤干細胞調控TNBC耐藥和復發

腫瘤在化療后產生的耐藥現象與腫瘤異質性有關，腫瘤組織中不同類型的腫瘤細胞對化療的敏感性不同。在常規化療后TNBC組織的活檢中，腫瘤干細胞相關基因表達水平發生上調，殘余腫瘤中腫瘤干細胞的存在比例顯著增加[19]。這一發現表明TNBC腫瘤干細胞是對于化療藥物不敏感的細胞的主要類型，其高度耐藥性導致化療后的殘余腫瘤中腫瘤干細胞得到富集，并導致TNBC的復發。與分化程度較高的腫瘤細胞相比，腫瘤干細胞相對平靜，可以在分裂時停止在細胞周期G0期[20]。而細胞毒性藥物通常對快速分裂細胞最有效[21]，腫瘤干細胞的這種休眠行為為他們提供了對細胞毒性藥物的天然保護。其次，在以吉西他濱或紫杉醇作為化療藥物進行治療的TNBC組織中，腫瘤干細胞相關缺氧誘導因子出現高表達，從而導致腫瘤細胞多耐藥蛋白基因1(ABCB1)表達的上調。腫瘤干細胞高度表達了多種多耐藥蛋白，如Bcrp1蛋白，ABCB1蛋白等[22-23]，通過利用ATP將多種化療藥物排出細胞外，使腫瘤干細胞具有高度耐藥性，或是通過TNF-α與CD44的結合，激活Ras/MAPK通路，增加抗凋亡蛋白的表達，提高腫瘤干細胞的抗凋亡能力。第三，TNBC腫瘤干細胞高度耐藥性受其腫瘤微環境以及NF-kB通路的激活調控。腫瘤相關成纖維細胞(CAF)和免疫細胞之間相互作用，通過激活腫瘤干細胞中的NF-κB信號來誘導自我更新特性增強進一步的治療耐藥性[17]。CAF能夠通過與受體RIG-1結合，激活TNBC腫瘤干細胞中的STAT1；反過來，STAT1的激活進一步激活NOTCH3，導致CSCs的耐藥性增加。間質細胞MSCs和TNBC之間的相互作用通過激活非受體酪氨酸激酶及其下游PI3K/Akt途徑，增加了腫瘤干細胞對曲妥珠單抗的耐藥性。除此之外，內皮細胞(ECs)分泌TNFα，激活CSCs中的NF-κB信號通路，并誘導TNBC中CXCL1/2，吸引免疫細胞在腫瘤微環境的富集和趨化因子的產生，包括S100A8/9等，從而降低腫瘤干細胞對于環磷酰胺的敏感性[24]。同時，通過腫瘤微環境中各種生長因子、細胞因子和趨化因子與腫瘤細胞的相互作用也可能提升腫瘤干細胞的耐藥性[25]。例如，IL6和STAT3通路與BCSCs中的曲妥珠單抗耐藥性有關[26]。

2 基于腫瘤干細胞的TNBC治療策略

2.1 基于TNBC腫瘤干細胞表面特異性抗原的臨床應用

TNBC腫瘤干細胞表面存在許多干細胞相關生物標志物，其中CD44不僅被認為是在識別TNBC腫瘤干細胞中的重要生物標志物，在通過清除乳腺癌干細胞治療TNBC這一治療策略中也受到了廣泛的關注[27]。CD44與其在腫瘤微環境中大量存在的配體透明質酸(HA)的特異性結合在腫瘤轉移和耐藥中起到了關鍵性作用[5]，CD44-HA在接受TNF-α信號后，可以通過磷酸化S133和促進CREB相關基因轉錄，激活TGF-β信號轉導通路，促進乳腺癌腫瘤細胞發生上皮-間質轉化[28]，離開原發腫瘤組織，從而促進轉移；而CD44-HA在接受受體酪氨酸酶(RTK)激活信號發生磷酸化后，可以通過磷酸化級聯反應激活RAS-MAPK通路，增加抗凋亡蛋白的表達，從而增強腫瘤細胞的抗凋亡能力[29](圖1)。因此，通過特異性結合CD44，競爭性抑制腫瘤相關HA與CD44結合形成CD44-HA分子，從而實現化療藥物在特定的腫瘤干細胞部位釋放，同時阻斷CD44下游信號通路抑制腫瘤的轉移，降低腫瘤抗凋亡水平，可能成為TNBC未來的重要治療策略。

圖1 CD44相關信號通路在腫瘤細胞耐藥和轉移中的作用模式圖

研究顯示，通過運用靶向CD44的小分子結合化療藥物，到達TNBC癌組織部位，通過與CD44陽性細胞結合，特異性殺傷乳腺癌腫瘤干細胞的方法在動物實驗中是可行的[30]。Marangoni E等的研究發現，使用人CD44單克隆抗體p245攜帶環磷酰胺對攜帶異種移植TNBC的小鼠進行治療可以顯著抑制腫瘤生長，在化療后4～6周，與對照組相比，CD44單克隆抗體的運用有效地預防了由殘留CD44陽性乳腺癌腫瘤干細胞介導的腫瘤復發[31]。隨著新技術的發展，納米材料的輔助應用為靶向CD44的TNBC治療新思路。Cuixia Yang等通過開發以與CD44特異性結合分子HA作為涂層的納米材料攜帶紫杉醇，嘗試靶向結合CD44治療乳腺癌。在體外試驗中證實，這種以經典CD44配體HA為涂層的新材料克服了傳統CD44抗體的缺點，可以區別正常細胞表達的CD44分子與乳腺癌腫瘤干細胞表達的CD44分子。而在異種移植了CD44高表達的乳腺癌細胞的小鼠模型中進行的實驗則發現，在運用此種納米材料的化療中，乳腺癌組織體積明顯減小，細胞壞死增加，且未觀察到其他組織發生細胞毒性反應[32]。因此，通過尋找可區分正常組織與癌組織中CD44不同的良好的藥物載體靶向CD44可能成為TNBC腫瘤干細胞清除的重要策略之一。

2.2 TNBC腫瘤干細胞增殖信號通路抑制劑的臨床應用

區別于其他亞型的乳腺癌，TNBC腫瘤干細胞中更多與干細胞命運相關的信號轉導路徑被激活[19]。Wnt/β-catenin通路不僅在干細胞的增殖以及腫瘤形成中發揮重要的作用，在TNBC中也已被證明是其發生和進展的主要驅動力[32]，并在維持腫瘤干細胞的活性，促進腫瘤的轉移中起到了重要的作用。在經典的Wnt/β-catenin通路中，Wnt蛋白通過增加細胞內β-catenin水平，從而發揮調節腫瘤干細胞命運的作用[19]。在Wnt信號通路作用下，Axin對β-catenin正常的磷酸化被抑制，導致β-catenin難以被泛素-蛋白酶體途徑所識別發生降解，在細胞內大量聚積。作為一種轉錄因子，β-catenin通過進入細胞核，提高例如vimentin,Twist等與腫瘤干細胞發生上皮-間質轉換相關的基因的表達水平，進而促進腫瘤的轉移(圖2)[25]。同時，β-catenin還活化了腫瘤干細胞中耐藥基因的表達，可能與TNBC腫瘤干細胞的耐藥有密切關聯。

圖2 Wnt/β-catenin對于上皮間質轉換，耐藥相關基因表達的調控，以及Axin相關酶抑制劑的使用對下游信號通路影響的模式圖

TNBC是β-catenin在核內水平最高的乳腺癌亞型，β-catenin的表達水平升高與乳腺癌患者的預后較差有關[33]。因此，通過降低細胞內β-catenin水平進而降低Wnt通路下游基因的表達水平，從而降低TNBC腫瘤干細胞的轉移能力，提高其化療敏感度可能成為治療策略之一。然而，區別于其他更多基于磷酸化級聯反應激活的信號通路，Wnt通路的激活從而導致β-catenin在細胞內聚集，更多的依賴于蛋白質-蛋白質相互作用，前者可以通過尋找小分子抑制劑，通過抑制磷酸化阻斷信號轉導，而通過影響蛋白質-蛋白質相互作用調節Wnt通路就更具挑戰性[31]。通過抑制二磷酸腺苷核糖多聚合酶(Tankyrase)的活性而阻止Axin蛋白的降解，從而促進Axin高效的磷酸化β-catenin，下調β-catenin在癌細胞內的水平的策略在近些年引起了大量關注，并在體內和體外試驗中被證明是可行的[34]。而在乳腺癌腫瘤干細胞中，之前的一項研究驗證了一種Tankyrase的小分子抑制劑：XAV939，可以通過上述方法下調β-catenin在乳腺癌細胞內的水平，有效地阻斷了Wnt信號通路[35]。

除此之外，由于β-catenin是一種轉錄因子，其調控癌癥干細胞命運的方式基于調節相關基因的轉錄，而目前的研究也發現，幾種miRNA在Wnt通路活化的乳腺癌腫瘤干細胞中干擾了相關基因的表達[36]。有研究表明，加載miR-200c的納米粒子可以顯著提高乳腺癌組織中的miR-200c水平，納米粒子可能作為將微RNA或小干擾RNA傳遞到乳腺癌干細胞靶點的有效載體[37]。因此，通過開發相關的miRNA藥物，以納米粒子為載體，進入乳腺癌腫瘤干細胞相應靶點，進而拮抗β-catenin作為轉錄因子的作用也是TNBC治療的策略之一。需要注意的是，Wnt/β-catenin通路在發育以及正常干細胞的更新中起到了不可忽視的作用，Wnt基因敲除的小鼠在胚胎時期死亡[38]。因此，區別正常干細胞以及腫瘤干細胞中的Wnt/β-catenin相關基因轉錄或蛋白表達是設計靶向藥物需要考慮的問題。

2.3 單細胞測序技術鑒定TNBC干細胞群

腫瘤干細胞的鑒定和特征對于個體化和有效的TNBC治療的發展至關重要。運用傳統的CD44+/CD24-表型和高ALDH活性鑒定腫瘤干細胞存在一定的局限性，而對于腫瘤干細胞轉錄組的測序則使其特征的識別更加準確。由于與TNBC腫瘤總細胞數相比，腫瘤干細胞的數量非常低，因此當腫瘤作為一個整體測序時，腫瘤干細胞的基因改變可能難以被準確測出。這個問題可以通過使用單細胞測序克服。單細胞測序是一種研究腫瘤進化和異質性的技術，有助于我們了解包括腫瘤干細胞在內的稀有腫瘤細胞在TNBC的啟動、進展、入侵、轉移、耐藥和復發中起到的作用[39]，從而指導臨床TNBC治療中更準確地早期發現和更有效的靶向藥物的使用。目前對于TNBC的單細胞測序中主要發現了3個細胞群。這個由單細胞測序建立的模型對TNBC的腫瘤進化、診斷和治療有重要的意義。此外，單細胞測序也被用于追蹤TNBC中轉移腫瘤細胞的起源。對來自6名非轉移性乳腺癌患者的63個單細胞的基因組進行了測序，53%的細胞被定義為彌散性腫瘤細胞(DTCs)，DTCs起源于主要腫瘤克隆、原發性腫瘤亞群或淋巴結轉移亞群，與腫瘤干細胞轉錄水平上類似，揭示了DTCs的起源進一步證明了TNBC的轉移與腫瘤干細胞的關系是密不可分的。除此之外，也有研究利用MDA-MB-231的scRNA-seq研究化療藥物治療后TNBC轉錄異質性，解釋了腫瘤耐藥基因型由此進化而來，受到輔助化療的選擇而產生耐藥性，但其轉錄水平由腫瘤微環境決定，可能在化療藥物的作用下去分化形成腫瘤干細胞，進而增強耐藥性[40]?；趩渭毎M學技術的相關科學研究也為解決臨床中存在的TNBC的耐藥及復發轉移等問題提供潛在的治療靶點[41]。雖然單細胞組學的應用中單細胞制備、全基因組擴增、庫結構、測序或數據分析等過程仍存在一些問題，如覆蓋面低、偏差、誤差取決于不同的工作平臺或方法；更好的WGA方法、更好的測序平臺、更好的數據分析工具或算法，在未來仍需要開發。但單細胞平臺不僅闡明了TNBC細胞譜系，而且為分析細胞異質性(包括腫瘤個體變異、CSC、腫瘤微環境的細胞成分)提供了一個強大而有效的手段。

3 未來與展望

TNBC是最具侵襲性的乳腺癌亞型，其特點是生存期低，遠處轉移發生率高。有限的治療選擇是導致TNBC預后不良的主要因素，雖然標準化療仍是TNBC全身治療的核心方案，然而，這些腫瘤往往對細胞毒性藥物產生耐藥性。迫切需要闡明TNBC耐藥背后的分子驅動因素。當前的干細胞療法極大地促進了對TNBC對化療耐藥的復雜機制的理解。本文綜述了基于干細胞療法對TNBC分子分型和轉移復發耐藥的復雜性，它是由多種因素和信號通路的相互作用和協作引起的。徹底解開這一網絡仍然是一項重大挑戰，但對確定新的治療靶點至關重要。TNBC的未來臨床研究顯然需要關注生物標志物整合、患者精確分層和針對不同患者亞組量身定制有效的新組合方案。傳統的腫瘤干細胞標志物仍是重要靶點，但單獨靶向腫瘤干細胞的藥物在異質性很高的腫瘤中可能不能起到良好的效果，所以，在TNBC的治療中，腫瘤干細胞靶向藥物與常規化療藥物的聯合使用可能成為未來的方向。除此之外，利用新興單細胞組學技術對TNBC腫瘤干細胞進行單細胞測序也為更好的了解TNBC異質性以及腫瘤干細胞特點，為選擇更合適藥物靶點提供了參考。綜上，本文對TNBC腫瘤干細胞對于腫瘤轉移、耐藥、復發的機制進行了概述，并綜述了基于干細胞分子機制和組學技術在腫瘤治療的前景。