Tiam1蛋白表達介導PI3K/Akt/mTOR信號通路對老年胰腺癌細胞轉移、侵襲的影響

尚娜娜 董雪茹 劉 志

胰腺癌是一類病因多且復雜、發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，據報道該類患者5年生存率小于5%[1]。有學者通過研究發現，T淋巴瘤侵襲轉移誘導基因(T Lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1,Tiam1)蛋白作為一類高保守、高敏感基因，可通過HCG/c-MET信號通路而特異性調節乳腺癌細胞侵襲和轉移[2]。而Tiam1在非小細胞肺癌、腎癌等多種惡性腫瘤中均有表達[3-4]，考慮Tiam1蛋白可能介導PI3K/Akt/mTOR信號通路調控胰腺癌細胞轉移、侵襲等生物學行為。但參閱國內外研究文獻，發現關于 Tiam1蛋白、PI3K/Akt/mTOR信號通路在胰腺癌中作用機制的報道較少，因此本研究就此展開報道，以期深入分析胰腺癌轉移、浸潤相關機制及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織及細胞 收集2017年1月至2019年12月本院手術切除的胰腺癌組織及癌旁組織各106例，術中將組織置于液氨冷凍后放入-80 ℃保存。人胰腺癌細胞株SW1990購自上海通派生物科技有限公司。

1.1.2 慢病毒轉染 收集處于生長對數期的人胰腺癌SW1990細胞接種于6孔板，每孔5×104個；培養液用含10% FBS的DMEM，培養箱條件：37 ℃ 5% CO2。待細胞爬滿孔板80%左右，吸出培養液并采用PBS清洗，加入無血清DMEM培養24 h，采用LipofectAMINE 2000轉染試劑盒將攜帶慢病毒的質粒轉染入細胞體內，培養72 h，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光細胞占比超過80%為轉染成功。

1.1.3 HGF溶液制備 粉末狀HGF用二甲亞颯(DMSO)溶解配置成含HGF 50 mg/mL的溶液，倒入EP管，置于-80 ℃保存，使用時按需用DMEM進行稀釋。

1.1.4 試劑與儀器 試劑：RIPA蛋白裂解液(北京雷根生物技術有限公司)，FBS、DMEM(北京沃比森科技有限公司)，BCA試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)，ECL發光試劑盒(上海喬羽生物科技有限公司)，LipofectAMINE 2000轉染說明書(美國賽默飛)，空白Tiam1質粒pGenesill-shRNA、Tiam1質粒pMag-3x-iRFP(武漢巴菲爾生物技術服務有限公司)，DMSO(美國Promega公司)，PBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)，CCK-8試劑盒(上海酶聯免疫生物有限公司)，Transwell小室(廣州維德昕生物科技有限公司)，4% HCHO(山東淄博齊星化學科技有限公司)。儀器：倒置熒光顯微鏡(德國徠卡DMi8型)、CO2培養箱(上海航佩儀器有限公司WJ-Ⅱ型)、PCR儀(廣州鼎國生物技術有限公司)、MR-100酶標儀(山東博冠生物技術有限公司BK-EL10C)。

1.2 方法

1.2.1 Western Blot法檢測Tiam1、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達量 取細胞用PBS溶液沖洗，加蛋白裂解液處理30 min，在4 ℃條件下以12000 rpm離心15 min，取上清液測定蛋白質濃度，合格后取總蛋白上樣進行電泳，以β-actin為內參，獲取的蛋白條采用軟件計算待測蛋白的相對表達量。

1.2.2 CCK8法檢測細胞增殖 取生長對數期SW1990細胞制成懸液后接種于96孔板，每孔約2×103個，采用濃度為50 ng/mL的HGF溶液和生理鹽水處理并作為HGF組和空白組，轉染Tiam1 minic作為Tiam1組；在顯微鏡下觀察到貼壁生長后分別加入10 μL CCK8，并在5% CO2、37 ℃條件下培養；分別在0、12、24、48、60 h時采用酶標儀測定兩組溶液在450 nm處的光密度(optical density, OD)值，計算HGF對胰腺癌增殖作用，細胞增殖率=(研究組細胞OD/空白組細胞OD)×100%。分別于0 h,12 h,24 h,48 h,60 h時計算Tiam1蛋白對過表達HGF胰腺癌細胞增殖作用。

1.2.3 Transwell小室實驗 取單細胞懸液接種于96孔板中，每孔約2×103個，分為空白組、HGF組、Tiam1組。于Transwell小室上、下室中分別加入60 μL基質膠、含10% FBS的DMEM培養液，培養24 h后棄上室液體，4% HCHO固定15 min，然后進行HE染色，觀察并計算穿過小室膜的細胞數，重復測定3次。

1.2.4 劃痕實驗 取上述實驗中3組細胞用胰酶消化，吹打成2×108個/L懸液并接種于48孔板，待細胞爬滿孔板80%左右，用移液槍頭垂直方向劃痕，繼續培養24 h，觀察并計算細胞遷移距離。

1.3 統計學處理

應用SPSS 18.0軟件進行統計分析，符合正態分布的連續變量以均數±標準差，兩組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用Snk-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 胰腺癌組和癌旁正常組細胞Tiam1表達情況分析

Tiam1在胰腺癌組織中呈高表達，在癌旁正常組織中呈低表達(圖1)。胰腺癌組和癌旁正常組細胞Tiam1表達量分別為(4.11±0.40)、(1.98±0.29)，胰腺癌組織中Tiam1表達量高于癌旁正常組織中Tiam1表達量(P<0.05)。

圖1 胰腺癌組和癌旁正常組細胞Tiam1表達圖(Western Blot法)

2.2 三組胰腺癌細胞增殖率分析

各組在轉染0 h、12 h時細胞增殖率比較無明顯差異(P>0.05)。轉染24 h、48 h、60 h時，與空白組比較，Tiam1組和HGF組細胞增殖率升高，且Tiam1組高于HGF組(P<0.05)(圖2)。

注：*為與空白組比較，P<0.05；#為與HGF組比較，P<0.05。

2.3 三組細胞侵襲能力

Tiam1組穿過小室細胞數較多，經過HE染色后染色細胞較其他兩組更明顯；空白組、HGF組穿膜細胞數更少，且HGF組低于空白組(P<0.05)，見圖3。

注：*為與空白組比較，P<0.05；#為與HGF組比較，P<0.05。

2.4 三組細胞轉移能力分析

與空白組比較，Tiam1組和HGF組轉移能力增強，且Tiam1組高于HGF組(P<0.05)(圖4)。

圖4 空白組、HGF組和Tiam1組細胞轉移能力(×100)

2.5 Tiam1蛋白介導HGF激活PI3K-Akt-mTOR信號通路

與空白組比較，Tiam1組和HGF組Tiam1、PI3K、Akt、HGF表達均增強，且Tiam1組Tiam1、PI3K、Akt、HGF表達量高于HGF組(P<0.05)(圖5)。

圖5 3組細胞PI3K-Akt-mTOR相關蛋白表達圖

3 討論

通過靶向免疫系統、腫瘤微環境及腫瘤基質等抑制相關細胞受體，調節胰腺癌發生細胞數為目前胰腺癌治療新領域。Tiam1蛋白在大多數正常組織中呈低表達或不表達狀態，目前已經發現其在多種惡性腫瘤細胞中表達上調：有研究顯示Tiam1在宮頸癌組織中表達上調，細胞實驗也發現高表達Tiam1組癌細胞侵襲能力更高、生存率低；翁丹丹等[5]指出高表達Tiam1可抑制肝癌細胞增殖、遷移過程；張瑤等[6]的報道顯示，Tiam1在非小細胞肺癌細胞中表達上調，且與腫瘤惡性程度密切相關，可調節腫瘤細胞與腫瘤微環境的相互作用。本文胰腺癌組織中Tiam1表達量高于癌旁正常組織，說明Tiam1表達可促進胰腺上皮腫瘤發生。既往研究報道顯示，隨著肺癌TNM分期及分級提高，Tiam1表達量逐漸增高，說明Tiam1表達可能促進癌癥進展[7]。本研究中Tiam1蛋白主要定位于細胞質和細胞膜，呈片狀或彌漫不均一分布,參考Liu等[8]的文獻結果，考慮Tiam1定位可能與腫瘤細胞侵襲、轉移有關。Tiam1調控胰腺癌疾病進展途徑不容忽視，可就此探討miRNAs干擾技術對腫瘤進行治療的可能。本次結果顯示，轉染組穿過小室膜的細胞數、細胞遷移水平更高，提示Tiam1可促進胰腺癌細胞侵襲、轉移能力提高。

Tiam1蛋白可特異性結合激素和神經遞質而激發一系列生理反應，參考Feng等[9]發現Tiam1蛋白通過相關信號通路增強人骨肉瘤組織增殖、侵襲能力。研究顯示PI3K/Akt/mTOR信號通路在細胞多種生物學行為中發揮著重要作用，主要機制為與包膜上HGF因子及其受體結合而發揮促進細胞黏附和癌細胞增殖[10]。當病原體感染機體后，Tiam1蛋白可被大量激活而促進HGF分泌，大量HGF進入細胞核參與激活HGF/c-MET轉錄過程，從而提高多種促細胞增殖、轉移及周期調控蛋白表達進而增強癌細胞進展[11]。綜合考慮，Tiam1蛋白是否為參與HGF/c-MET信號通路活化關鍵蛋白，進而調控PI3K/Akt/mTOR信號通路，影響胰腺癌細胞增殖、轉移、侵襲行為。本文胰腺癌細胞經HGF誘導后，生長曲線圖顯示出過表達HGF可有效增強癌細胞生長增殖，且該作用機制存在時間-劑量依賴性[12]，HGF特異性結合活化c-MET參與促進血管瘤發生發展，繼而激活下游多種信號通路。進一步探討HGF激活PI3K/Akt/mTOR信號通路機制發現，Tiam1蛋白過表達時，HGF誘導的PI3K/Akt/mTOR信號通路被阻斷，提示Tiam1蛋白在胰腺癌細胞中參與介導HGF誘導胰腺癌細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路活化。

綜上所述，Tiam1蛋白在胰腺癌中呈高表達，主要通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路而增強癌細胞增殖、侵襲、轉移能力，有望成為胰腺癌治療的新靶點。