蝦醬中益生菌的篩選及蝦肉蛋白發酵飲品的制備與優化

楊小涵，秦濟昆，操俊，李月嬋，羅學剛*

1(天津科技大學 生物工程學院 生物工程國家級實驗教學示范中心，天津，300457) 2(工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室，天津，300457)

蛋白質是組成人體的基本物質，動物蛋白質的氨基酸(特別是必需氨基酸)組成完整性更高、構成比例與人體更為接近、更容易吸收，同時動物蛋白質原料富含更多的維生素B12、DHA等人體重要的營養素，而凝集素、皂苷等抗營養素的含量則比植物蛋白質原料少。因此，動物蛋白質飲品的需求與發展空間越來越大。目前，市場上的蛋白質飲品依然以核桃仁、花生等植物蛋白質類居多，動物蛋白質飲品基本上局限于乳類產品，新型產品亟待開發[1]。

蝦中蛋白質含量較高，同時磷脂等營養成分也十分豐富，具有較高的開發價值。近年來，中國產區蝦產量連續呈增長趨勢，2021年已達到200萬t左右，在世界六大蝦主產國中位居首位。蝦產品以直接食用為主，精深加工研發力度不夠，產品品種少，并且受市場波動、季節等因素影響明顯，特別是近年來餐飲業受新冠疫情沖擊，致使蝦產業過?，F象加重。

蝦醬作為一種傳統發酵食品，是我國沿海以及東南亞地區常用的調味料之一，但是在其他地域至今難以推廣，應用人群比較有限，而且鹽含量較高，在健康方面并不理想。研究發現，蝦醬中存在芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、片球菌屬、酵母菌屬等多種天然的共生微生物[2]。

益生菌食品具有改善腸道微生態平衡、調節營養代謝、增強免疫效力及防治各類疾病的功效，具有巨大的商業價值[3-5]。本文從傳統蝦醬中篩選出能夠較好地代謝蝦肉的益生菌，然后通過系統性的優化與分析，對適于現代化工藝生產的益生菌蝦肉蛋白發酵飲品進行了研發探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬，山東省濱州經濟開發區某蝦醬專賣店；鮮蝦，天津市北塘海鮮市場；檸檬，天津市某水果專賣店；甜菊糖苷，曲阜香州甜菊制品有限責任公司；食品級木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；食品級活性炭，鞏義市海星供水材料有限公司；無水乙醇，天津市北聯精細化學品有限公司；伯樂蛋白定量試劑盒，伯樂(Bio-Rad)公司；黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

HG35型厭氧培養箱，天津普瑞斯儀器有限公司；TG16B型高速臺式離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；LRH-150型生化培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-6100分光光度計，上海元析儀器有限公司；SPECTRAMAX190型酶標儀，美谷分子儀器有限公司；PSSJ-4V型精密pH計，上海精密科學儀器公司；HN-E905奧爾貝斯榨汁機，奧爾貝斯電器廠；4R2204CN型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；1200高效液相色譜儀，安捷倫公司。

1.3 蝦醬中益生菌的篩選

1.3.1 菌株的篩選

無菌條件下取1 g發酵蝦醬于1 mL無菌水中混勻，梯度稀釋后分別取各梯度下的樣品100 μL均勻涂布至添加CaCO3的MRS固體培養基平板上，37 ℃厭氧培養48 h。依次挑選出現溶鈣圈的白色圓形菌落于MRS固體平板上進行劃線純化，37 ℃厭氧箱中培養48 h。

1.3.2 菌株的鑒定

1.3.2.1 形態學鑒定

取純化后的單菌落進行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察其形態。

1.3.2.2 基因序列比對

通過PCR擴增菌株16S rDNA并進行測序，BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析后使用MEGA-7軟件的鄰近法進行系統進化樹構建[6]，然后使用iTOL(https://itol.embl.de/)對進化樹進行美化[7]。

1.3.3 生長曲線的繪制

取40 μL活化菌株于MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，每隔2 h測定OD600值，繪制生長曲線。

1.3.4 嘌呤代謝能力的測定

以鳥嘌呤和次黃嘌呤作為標準品，通過HPLC分析菌株發酵對樣品的鳥嘌呤與次黃嘌呤代謝能力的影響[8-9]。

1.4 蝦肉蛋白飲品的制備

1.4.1 工藝流程及操作要點

原料前處理→脫脂→酶解→煮沸滅酶→離心，合并上清液→加活性炭脫色脫苦脫腥→離心取上清液→巴氏滅菌→冷卻得蛋白液→復配→接菌→培養→調配→成品[10-11]

原材料前處理：將新鮮的蝦清洗干凈后去殼，于65 ℃水浸泡30 min，烘干過夜，粉碎，過100目篩，保存待用。

脫脂：將原料與無水乙醇按質量比1∶6混合，在50 ℃下靜置1 h，并每隔20 min攪拌1次，重復2次。

酶解：用木瓜蛋白酶在pH 7.2、60 ℃條件下，底物質量分數4%、酶用量6 000 U/g，反應6 h。

活性炭處理：添加15 g/L的活性炭，在55 ℃下處理30 min。

復配：將新鮮的巴氏滅菌后的檸檬汁與蝦蛋白液按體積比7∶3混合[12]。

1.4.2 蝦肉蛋白飲品工藝參數的優化

1.4.2.1 單因素試驗

以感官評價為指標，進行單因素試驗。

(1)發酵時間的確定：控制接種量為3%、甜菊糖苷添加量為1.25 g/L，對復配飲品分別發酵8、10、12、14、16 h。

(2)接種量的確定：控制發酵時間為12 h、甜菊糖苷添加量為1.25 g/L，分別按接種量1%、2%、3%、4%、5%，對復配飲品進行發酵。

(3)甜菊糖苷添加量的確定：控制接種量3%、發酵時間為12 h，分別添加0.75、1、1.25、1.5、1.75 g/L甜菊糖苷，對復配飲品進行發酵[13]。

1.4.2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，取得分最高的2個水平，設計L4(23)正交試驗，以感官評價為指標，優化最佳的工藝參數。

1.4.2.3 飲品感官評價標準

由固定的10人對綜合樣品的組織狀態、氣味、口感等指標作出評分，去掉最低分和最高分后的平均值為該產品的最終得分。評分標準見表1。

表1 感官評分標準表Table 1 Sensory evaluation criteria

1.5 飲品參數的測定

1.5.1 飲品中蛋白質含量的測定

利用蛋白質定量試劑盒檢測：避光條件下精密吸取4 μL試劑以及200 μL樣品于孔板中，避光反應15 min，利用酶標儀測定其OD595值，與標準曲線進行對比。

1.5.2 抗氧化能力的測定

分別取1 mL蒸餾水、DPPH、樣品于5 mL離心管中，搖勻，避光靜置30 min，然后在517 nm處測量其吸光值，按公式(1)計算其清除率并與維生素C標準曲線進行對照[14]：

(1)

式中：AX，1.0 mL樣品+1.0 mL DPPH+1.0 mL蒸餾水的吸光值；A0，1.0 mL DPPH+2.0 mL蒸餾水的吸光值；AX0，3.0 mL無水乙醇的吸光值。

1.5.3 抑制XOD能力的測定

利用XOD測定試劑盒中的5個試劑分別加入蒸餾水、發酵前以及發酵后的樣品于水浴37 ℃反應20 min，測定其OD530，XOD抑制率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：R，XOD的抑制率，%；ODC，對照組OD530值；ODS，實驗組OD530值。

2 結果與分析

2.1 蝦醬中益生菌的篩選、鑒定與檢測

2.1.1 益生菌的篩選與鑒定

以傳統蝦醬為原料，最終篩選獲得一株具有顯著產酸能力、強嘌呤代謝能力的桿狀菌，鏡檢結果如圖1所示，革蘭氏染色為紫色，菌株呈現明顯的桿狀且可觀察到芽孢。測序比對結果顯示其16S rDNA與凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulansstrain) wy01相似度高達97.71%(圖2)，再結合菌株的形態學特征和生理生化特征，最終鑒定為凝結芽孢桿菌，并命名為B.coagulansGH1-1，將其保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.24236。

圖1 B.coagulans GH1-1鏡檢照片Fig.1 Microscopic photos of B.coagulans GH1-1

圖2 B.coagulans GH1-1的進化樹Fig.2 Evolutionary tree of B.coagulans GH1-1

2.1.2B.coagulansGH1-1生長曲線及嘌呤代謝能力的檢測

如圖3所示，B.coagulansGH1-1于0～4 h處于潛伏期，4～16 h處于對數生長期，16 h時到達穩定期，最大OD600在1.8左右。由于對數生長中后期的菌株具有生長速度快，各個體間均勻一致等優點，用做發酵的種子繁殖后代時可接近同步生長，使發酵代謝正常，周期縮短，因此種子發酵時間定為12 h。

圖3 B.coagulans GH1-1生長曲線Fig.3 Growth curve of B.coagulans GH1-1

由圖4可知，B.coagulansGH1-1可很好地代謝鳥嘌呤和次黃嘌呤，嘌呤總量減少了86.75%。因此，用該菌株發酵飲品可有效減少蝦蛋白的嘌呤含量，且該菌株進入腸道后，具有代謝腸道中嘌呤的能力，對于防治高尿酸血癥具有潛在的功效。

a-標準品液相圖;b-GH1-1代謝后液相圖圖4 B.coagulans GH1-1的嘌呤代謝能力HPLC檢測圖Fig.4 B.coagulans GH1-1 purine metabolism ability HPLC detection chart注：黃嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤的停留時間分別為4.7、5.2和8.8 min

2.2 B.coagulans GH1-1發酵蝦肉蛋白飲品的工藝優化

由于使用單純的蝦肉蛋白液發酵口味難以被大眾接受，且堿性過強(經測定pH>12)，不利于菌株的生長和代謝，因此，為提高其口感，調節其pH，同時增加飲品的營養成分，使用檸檬汁與其進行復配發酵，并在發酵后添加適量甜菊糖苷進一步調節口味。

2.2.1 單因素試驗結果

如圖5所示，隨著發酵時間的增加，感官評分呈先上升后降低的趨勢。當發酵時間為14 h時，發酵飲品綜合得分最高，果味、酸味、甜味交融，口感最佳。但隨著發酵時間的增加，乳酸產量不斷增加，當發酵時間超過14 h后，發酵酸味過重，飲品的新鮮感、檸檬特征香氣伴隨發酵逐漸消失，評分下降。

圖5 發酵時間對感官評價的影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory evaluation

隨著接種量的增加，感官評分呈先上升后降低的趨勢。當接種量過低時，乳酸風味不足，感官評分較低，隨著接種量的增加，乳酸產量增加，酸味稍微加重，但飲品發酵更加充分的同時，飲品的新鮮感漸弱，檸檬特征香氣漸弱，當接種量為3%時，酸度適中，果香味明顯，飲品綜合得分最高(圖6)。

圖6 B.coagulans GH1-1接種量對感官評價的影響Fig.6 Effect of B.coagulans GH1-1 inoculum on sensory evaluation

隨著甜菊糖苷添加量的增加，感官評分呈先上升后降低的趨勢。適量的甜菊糖苷與飲品的酸味復合可增加口感，但隨著添加量的增加，甜菊糖苷特殊甜味加重，會影響了檸檬的果香以及發酵口感，感官評分大幅度下降。當甜菊糖苷添加量為1 g/L時，飲品酸甜適度，符合多數人的口味，綜合得分最高(圖7)。

圖7 甜菊糖苷添加量對口感的影響Fig.7 Effect of stevioside addition on taste

2.2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，選擇得分最高的2個水平進行正交，正交因素與水平見表2。

表2 正交因素水平表Table 2 Orthogonal factor level table

正交試驗結果及極差如表3所示，極差RA>RB=RC，即3種因素對飲品感官評價的重要程度最大的為發酵時間。3個因素最佳配比為A1B1C1，即發酵時間為12 h、接種量為3%、甜菊糖苷添加量為1 g/L。

2.3 發酵飲品的特性分析

如表4所示，飲品中蛋白質的含量為2.44 g/100 mL。未發酵的飲品DPPH清除率為66.61%，與維生素C標準曲線對比，相當于859.13 μmol/L的維生素C；發酵后的DPPH清除率為80.03%，與維生素C標準曲線對比，相當于914.47 μmol/L的維生素C，可以看出發酵后，飲品的抗氧化能力可提高22.14%。經計算，未發酵的飲品可抑制53.11%的XOD活性，發酵后XOD活性抑制率可達66.67%，抑制XOD活性的能力提高25.53%。

表3 正交實驗結果及極差分析Table 3 Results and range analysis of orthogonal experiment

表4 發酵蝦肉飲品的特性分析Table 4 Beverage parameter measurement results

3 結論

凝結芽孢桿菌是一種可食用益生菌，它既有乳酸菌和雙歧桿菌的益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性強、易貯藏等優點，研究發現，大約有85%凝結芽孢桿菌能順利到達小腸，通過調節微生物群組成、宿主免疫和代謝，對腸道疾病具有治療作用。此外，毒理學實驗和大量臨床觀察表明，凝結芽孢桿菌屬于一類安全的可食用微生物[15]。早在1989年，凝結芽孢桿菌就被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)評為“普遍認為安全(Generally Recognized as Safe, GRAS)”的一類桿菌，目前已被FDA列入GRAS名單，并獲得了歐盟食品安全局的安全資格認定。2005年，我國國家食品和藥品監督管理局批準了凝結芽孢桿菌活菌藥物上市，2016年我國衛生部也批準凝結芽孢桿菌作為新資源食品[16]。目前，凝結芽孢桿菌在食品、醫藥、飼料等方面的應用依然在不斷發展[17]。

蝦營養成分豐富，具有巨大的開發潛力[18-19]。然而，我國對蝦資源的開發起步較晚，目前也還處在不斷探索階段，例如：一些研究將蝦制成蝦粉，再進一步用于提取油脂、蝦青素、蛋白質等[20]。近年來，不少人也針對其易于微生物生長繁殖的特點，從其相關制品中篩選出益生菌，如2021年田亮金等[2]從蝦醬中篩選出了6株益生芽孢桿菌并對其益生效果進行了分析。與其不同的是，本研究中所篩選獲得凝結芽孢桿菌不僅具有較強抗氧化作用，而且有著明顯的嘌呤代謝能力，為蝦肉這一高嘌呤食材的深加工提供了新的優良發酵菌株。

蝦肉相關飲品，目前市面上還極為罕見。謝偉斌等[11]曾對蝦蛋白進行酶解，再與蜂蜜等調配制備了一款低分子多肽保健飲品；章雪琴等[21]將蝦肉攪碎酶解，用3種益生菌聯合發酵制備了一款發酵飲品。與前人研究有所不同，本文首先從蝦醬中分離獲得了具有生長性能良好、嘌呤代謝能力強的益生菌新菌株，經過較為系統的優化，研究制備了一款蛋白質等營養成分豐富且更符合大眾口味的蝦蛋白飲品。而且，該發酵飲品具有很強的抗氧化能力，有助于延緩組織器官功能減退以及細胞組織的老化，同時，所用菌株具有較強的代謝嘌呤的能力，且輔料檸檬汁具有降低尿酸的功效[22]，所制得的飲品還可顯著增強XOD抑制活性，因此，該飲品在預防高尿酸血癥方面具有潛在的價值。