疫苗有效性評價及面臨的科學問題

劉一凡

中國醫學科學院醫學生物學研究所

李國良

中國醫學科學院醫學生物學研究所

王佑春*

中國醫學科學院醫學生物學研究所

確保生物制品的質量、安全性和有效性是生產企業的首要責任，而國家監管機構同樣需要建立相關程序確保生物制品符合質量要求、有足夠的安全性和有效性[1]。作為特殊的生物制品，疫苗接種人體后可刺激免疫系統產生特異性體液免疫和細胞免疫應答，使人體獲得對相應病原微生物的免疫力[2]，對防護個人免除相應病原微生物的感染以及預防和控制傳染病傳播和流行至關重要。安全性和有效性是疫苗評價過程中兩個非常重要的指標，尤其是疫苗的有效性。根據美國《聯邦法規匯編》（Code of Federal Regulations,CFR），有效性是指產品能夠產生其預期目的作用的特定能力或效能。它是通過使用該品種預期的給藥方法，采用合適的實驗室測定方法或者臨床對照研究數據獲得的[3]。

有效的疫苗接種人體后，可以誘導機體產生具有保護作用的免疫反應，達到預防機體感染相應病原體或減輕疾病癥狀的效果。疫苗抗原具有與有效抗體結合或與有效淋巴細胞上的抗原受體密切結合的獨特結構，抗原物質的這種特性為抗原性，即疫苗有效性評價中的有效抗原。有效抗原往往通過體外免疫學方法進行檢測，即通常所說的體外效價（in vitropotency）。作為免疫應答的啟動劑，疫苗抗原可以刺激動物和人體免疫系統產生反應，這種誘導免疫反應的能力就是免疫原性。免疫原性往往通過免疫動物檢測其誘導免疫反應的水平，通常稱為體內效價（in vivopotency）。作為反映有效性的關鍵質量屬性，體外效價和體內效價是疫苗檢測的主要指標。但無論是體外效價還是體內效價，都是檢測疫苗有效性的間接指標；只有檢測其預防動物或人體感染相應病原體的能力或減輕相應癥狀時，才是評價疫苗有效性的直接指標。因此，在開展疫苗臨床試驗前，往往需要選擇合適的動物模型進行動物感染病原體的保護試驗。動物模型顯示明顯的保護作用后方可開展臨床試驗，通過臨床試驗來充分驗證疫苗的有效性。本文將從疫苗抗原性、免疫原性、動物體內保護效果和人體保護效果評價4 個維度來進行討論。

1 疫苗抗原性檢測

疫苗抗原性即體外效價的檢測，是疫苗評價的重要一環。目前，疫苗抗原性檢測主要存在以下3 個瓶頸。首先，不同企業同一類疫苗的抗原性檢測結果缺乏可比性?，F今，對疫苗的抗原性檢測主要以中和抗體為基礎制備相應的免疫方法進行檢測，但不同企業選擇不同中和表位的抗體，無法對檢測結果進行可比性研究。即使選擇相同表位的抗體進行檢測，但由于不同企業的生產工藝存在差異，檢測結果同樣缺乏可比性。其次，隨著多聯、多價疫苗的問世，如多價人乳頭瘤病毒疫苗、多價肺炎疫苗、A 群C 群腦膜炎球菌b 型流感嗜血桿菌聯合疫苗、無細胞百白破b 型流感嗜血桿菌聯合疫苗、無細胞百白破脊髓灰質炎b 型流感嗜血桿菌聯合疫苗、百白破b 型流感嗜血桿菌和脊髓灰質炎、乙型肝炎六聯疫苗等，多價、多種抗原的聯合增加了疫苗抗原性檢測的復雜性。再次，在過去幾十年中，疫苗佐劑尤其是新型復雜佐劑得到了巨大發展。佐劑同疫苗抗原間存在相互作用，一定程度上增加了疫苗抗原性檢測的難度。

突破上述瓶頸，需要對檢測用的中和抗體進行大量篩選，以此獲得針對主要且不易被破壞表位的抗體。這類抗體往往結合特殊或復雜的抗原表位，通過用這類抗體建立抗原的免疫檢測方法，可有效解決上述瓶頸問題。下文將結合人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗和狂犬病疫苗有效抗原的檢測進行具體說明。

1.1 HPV16 疫苗有效抗原檢測

宮頸癌是影響全球女性健康的第四大惡性腫瘤。HPV16 作為宮頸癌最普遍的型別[4]，是引發宮頸癌的主要原因。由于HPV疫苗生產企業采用了不同的表達系統和生產工藝，在檢測過程中需要一種能夠識別優勢中和表位并能與各種病毒樣顆粒產生反應的單克隆抗體。通過大量篩選研究，篩選出5 種針對HPV16 的單克隆抗體（V5、8A9、5C10、4G12 和001），并以此建立HPV16 抗原的檢測方法，對5 種不同抗原分別進行檢測。結果顯示，單克隆抗體001 的檢測值與蛋白定量最為接近，且離散程度最小。而且，不同疫苗產生的中和抗體滴度與單克隆抗體001 的量值相關性最好。中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）團隊進一步針對不同表達系統來源的病毒樣顆?？乖_展了方法適用性檢測，所有檢測值與蛋白定量相近，且各組之間的差異不具有統計學意義。在進一步研究過程中，通過冷凍電子顯微鏡等技術對抗體結構進行解析，發現單克隆抗體001 結合于HPV L1蛋白的DE、FG 和HI 環區，位于五聚體的間隙[5]。單克隆抗體001 獨特的結合特點可以使多個抗體同時結合時不存在空間位阻，減少了檢測差異，使不同表達系統來源的抗原檢測結果更有可比性。綜上，單克隆抗體001可適用于不同表達系統來源的HPV16 疫苗有效抗原的檢測，且結果具有很好的可比性。

1.2 狂犬病疫苗有效抗原檢測

狂犬病病毒抗原含量是關系到狂犬病疫苗有效性的重要因素。糖蛋白是狂犬病病毒唯一能誘導宿主產生中和抗體并與之結合的蛋白。世界衛生組織（WHO）推薦體外方法，即通過對糖蛋白定量進行狂犬病疫苗的效力測定[6-7]。相比需要使用大量小鼠、檢測時間長、對操作人員技術要求高、檢測方法變異性大的NIH 體內方法，體外方法可以有效減少檢測時長和實驗動物的使用量，具有易操作、方法穩定等優點。國內外學者通過選擇不同的、具有中和活性的單克隆抗體，建立了多個檢測方法（表1）[8-14]，而且與NIH 體內方法具有較好的相關性。但由于所使用的狂犬病病毒株、生產工藝、疫苗類型（人用疫苗或獸用疫苗、是否含有佐劑等）、所使用單克隆抗體識別抗原位點存在差異等因素，目前尚未有統一的檢測方法可用于所有毒種生產的狂犬病疫苗抗原性檢測。

表1 已報道的狂犬病疫苗抗原性檢測方法

中檢院團隊制備了大量的中和抗體，通過對狂犬病病毒的疫苗株和90 多個街毒的假病毒進行檢測，篩選出4 個廣譜性好的單抗（06-2A12、07-4D8-1C1、05-2F10、14-4E8-1E3）。這4 個單抗不僅能夠中和各疫苗株，而且中和滴度高。通過方法的系列篩選和優化，選取 07-4D8-1C1 和06-2A12 作為包被單抗，05-2F10-HRP 作為標記單抗，可以高效檢出7 個廠家的疫苗株，且對7 個廠家疫苗的檢測靈敏度高，適用于所有疫苗株制備的疫苗。該方法對其他人用疫苗和輔料成分無交叉反應，具有良好的專屬性。

2 疫苗免疫原性檢測

免疫原性也是疫苗有效性評價的重要指標之一[15]。對疫苗免疫原性的檢測通常是選擇合適的動物模型，待完成疫苗免疫后，檢測動物有效的免疫反應。通常在檢測中和抗體的基礎上，可通過計算誘導免疫反應的半數有效量（ED50）、抗體滴度和抗體陽轉等指標進行判定。傳統的中和抗體檢測方法如空斑減少中和試驗（plague reduction neutralization test，PRNT）和細胞病變法（cytopathic effect，CPE）等都是建立在活病毒的基礎上?；畈《据^難獲得，對于實驗室的生物安全等級要求較高，檢測周期長，對于操作人員的要求也較為嚴格，且實驗結果的判讀存在主觀性。因此，為應對快速檢測的需求，研究人員建立了使用假病毒的中和抗體檢測方法，可以有效突破傳統方法的局限性。

假病毒技術可以模擬病毒的膜結構，可以代替活病毒用于研究和檢測[16]。使用假病毒對中和抗體進行檢測的原理在于：假病毒與活病毒有相同膜蛋白，可以有效模擬病毒感染細胞的過程；假病毒含有報告基因，可以有效檢測、示蹤中和抗體。與傳統檢測方法相比，使用假病毒進行中和抗體檢測具有以下優點：①容易獲?。嚎稍趯嶒炇覂群铣苫?、構建病毒，避免了長途轉運病毒過程中存在的風險。②無需培養：可以通過質粒轉染，制備病毒。③安全性高：單輪感染可以在生物安全二級（BSL-2）條件下進行。④周期短：通?？稍?4～72小時內完成，可實現自動化。⑤定量客觀：因其含有報告基因，可以對中和抗體進行客觀定量[17]。

在建立使用假病毒對中和抗體進行檢測的過程中，中檢院團隊對細胞敏感性、細胞量、病毒加入量、檢測時間等參數進行了標準化研究；對分析檢測方法的專屬性、準確性、耐用性和重復性等技術指標進行了驗證。而且，為進一步確認方法的適用性，與傳統檢測方法進行了對比驗證，結果顯示基于假病毒的中和抗體檢測方法穩定、可行，與傳統的細胞培養方法具有很好的相關性[18]。

在此基礎上，中檢院團隊建立了多型別病毒抗體自動化檢測系統，可實現同時對多種病毒進行檢測。通過機械臂，可進行掃碼、開蓋、樣品稀釋、自動培養和檢測，可有效降低檢測成本、提高通量，進一步提升檢測效率[19]。

體內效價檢測通常需要大量的實驗動物，檢測時間長，且檢測方法的耐用性和重復性差[20]。相比體內檢測，體外檢測方法具有簡便性。近年來，監管機構和疫苗生產企業在疫苗有效性評價指標設置中均傾向于使用體外檢測方法。WHO 發布的非臨床[21]、批放行[22]等技術指導原則中均明確鼓勵使用3R 原則（替換、減少、優化）；歐盟在2010年以立法的形式將3R 原則納入歐盟指令2010/63/EU[23]；美國和歐盟藥品監管機構接受對采用病毒樣顆粒制備的乙肝疫苗和HPV 疫苗開展體外效力試驗[20]；在新冠疫情期間，美國和歐盟對進行體外效力試驗的新冠mRNA 疫苗和病毒載體疫苗進行了批產品放行[20]。我國同樣鼓勵使用體外方法，《中國藥典》（2020年版）規定：“應盡可能采用準確的理化分析方法或體外生物學方法取代動物試驗進行生物制品質量檢定，以減少動物的使用?！钡褂皿w外檢測方法需要進行充分驗證。

3 動物體內保護效果的評價

動物保護性試驗是疫苗研發中的必經階段，只有在動物保護性試驗中證明有效，才能進入后續臨床試驗。在動物體內開展保護效果評價的關鍵在于是否有對病原易感的動物模型，在進行疫苗接種后是否能產生和人體相同或相近的免疫應答。在構建易感動物模型時，通常需要采用基因編輯技術對特定的基因進行改造，耗時長、難度大。除此之外，另一瓶頸在于缺乏動物體內保護效果與免疫反應相關性的數據。本文將從以下3 個方面對開展動物體內保護效果評價的動物模型構建策略進行探討。

3.1 對有明確病毒受體的基因修飾動物的研發

有些病毒通過特定受體對人體進行感染，然而諸如廣泛用于動物研究的小鼠與人的受體存在差異，導致小鼠對于部分病毒并不易感。對于有明確病毒受體，人-鼠受體分子存在差異的病毒，通過基因修飾技術，將人的受體定點插入小鼠體內或進行置換，使得小鼠可以表達人的受體分子，從而變得對病原易感。目前，中檢院團隊已成功構建了表達腸道病毒71 型（EV71）[24]、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）[25]、新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）[26]、脊 髓灰質炎病毒、麻疹病毒等受體分子的小鼠模型。

本文將以EV71 為例進行詳細說明。在EV71 疫苗的研究開發過程中，雖然相關單位建立了EV71 感染的非人靈長類動物模型和乳鼠模型，但使用非人靈長類動物模型成本高、有倫理學限制，乳鼠模型對年齡要求較高，穩定性差[24,27]。鑒于hSCARB2是人類體內體外感染EV71 的關鍵受體[28]，中檢院團隊利用胚胎干細胞靶向技術，構建了表達hSCARB2 受體純C57BL/6 基因背景的敲入小鼠模型（以下簡稱hSCARB2 小鼠）。在完成模型構建后，對hSCARB2 小鼠模型進行了感染驗證。通過Q-PCR檢測小鼠感染后EV71 的分布，在后肢、口、腦、心臟、肺、肌肉等組織或器官中均檢測到病毒分布。借助增強綠色熒光蛋白和生物膜干涉技術，呈現了可視化的小鼠“手足口”模型，并發現拷貝數與熒光值具有明顯相關性，可作為判定是否感染的有效證據。感染后小鼠體重下降，感染后腦、后肢發生病理改變，并通過免疫組化檢測到病毒[24]。

隨后，采用 hSCARB2 小鼠對EV71 中和抗體的體內保護效果進行了檢測，建立了中和抗體和保護效力間的量效關系。接著，用完成Ⅲ期臨床試驗的EV71 疫苗對該系統評價疫苗保護效果的能力進行了驗證，結果證明：hSCARB2 小鼠模型能夠很好地評價EV71 疫苗的有效性，并初步建立有效性與抗體水平之間的關系[24]。

在以上研究的基礎上，采用顱內及尾靜脈攻毒兩種方式，均觀察到EV71 疫苗能抵御致死性病毒攻擊，并且能觀察到接種疫苗后，小鼠腦、肌肉及肺中病毒載量顯著下降，建立了EV71 疫苗體內效力的直接評價方法[28]。

綜上，hSCARB2 小鼠模型對于EV71 病毒株具有良好的易感性，可有效模擬人體感染EV71 后產生的臨床特征。運用hSCARB2 小鼠模型進行疫苗保護效果評價，簡單便捷、重復性強，能有效評估EV71 疫苗的保護效果，可作為有效的疫苗質量評價手段。

3.2 免疫缺陷類基因修飾動物的研發

有些病毒的受體不明確，無法對小鼠等動物進行基因修飾。但通過部分免疫缺陷可以使病毒敏感，如敲除特定基因，使T/B/NK 細胞缺陷，或敲除干擾素（interferon，IFN）或其他信號通路的基因。中檢院團隊構建了Rag1、Rag2、IFNRα/β、IFNRγ、IFNRαβ/γ、STAT1、STAT2、Sting 敲除的大、小鼠模型，可用于針對肺炎病毒、寨卡病毒、人類嗜T 淋巴細胞病毒-1（HTLV-1）和基孔肯亞病毒等病毒的研究。值得一提的是，敲除干擾素信號通路小鼠模型可支持30 多種病毒的感染，幾乎為開展疫苗、抗體評價研究工作中的萬能模型。但這類小鼠畢竟存在免疫缺陷，能否客觀、準確地評價疫苗的有效性還有待進一步的評估。

3.3 假病毒感染動物模型的建立

利用假病毒的技術優勢，選擇使用高滴度的假病毒、采用不同的接種方式（如腹腔注射、胸腔注射、靜脈注射等），先后構建了針對埃博拉病毒、馬爾堡病毒、H7N9 禽流感病毒等系列病毒的小鼠模型。在用該體系對疫苗有效性進行評價時，如果產生保護效果，假病毒會被中和抗體所中和，從而阻止假病毒感染小鼠組織。假病毒采用發光標記，使用活體成像系統可直觀顯示病毒感染的強弱變化，從而能對疫苗效力進行直觀、可定量的評價[16]。通過建立假病毒感染動物模型，不僅可以避免活病毒的使用，降低生物安全風險，還可以更加直觀地檢測，對疫苗候選抗原的篩選提供了很大的便捷性。

4 人體保護效果的評價

雖然可以通過動物體內的保護效果來評價疫苗的有效性，但不可否認的是動物模型有時無法預測疫苗在人體內的免疫原性和有效性[21]。因此，在真實世界中進行臨床試驗，對于評價疫苗的有效性顯得尤為重要。不同疫苗的臨床試驗評價標準不一，通常有預防感染、減少發病和降低重癥等，但無論哪一種評價標準，其最終結果都在于證明疫苗的保護效果，并進一步尋找保護效果與免疫指標間的相互關系。

通常來說，疫苗在上市前需要經過Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗。有效性則是在大規模目標人群的III 期臨床試驗中進行評價。本文將從疫苗保護效力和免疫學替代終點2 個方面進行討論。

4.1 疫苗保護效力

疫苗保護效力（vaccine efficacy，VE）是指與安慰劑組相比，疫苗接種組疾病或感染減少的比例[29]。具體的計算公式為：疫苗保護效力=（一定觀察期內安慰劑組感染率-疫苗組感染率）/安慰劑組感染率。通常在對照臨床試驗中對疫苗保護效力進行衡量，即通過比較疫苗組與安慰劑組的數據，看有多少人出現了“關注的結局（通常為感染或發?。?。如果一種疫苗效力很高，那么疫苗組中患病的人數會比安慰劑組少得多。此外，疫苗保護效力還可以通過相對風險（relative risk，RR）進行計算[30]。

通過臨床試驗對疫苗的有效性進行評價是最理想的狀況，比如創新型疫苗、缺乏免疫原性替代終點或免疫原性替代終點不明確的疫苗。但開展臨床試驗需要對流行病學情況和疾病的發生率進行充分考量。如果發病率太低，樣本量不足，不利于病例收集，臨床試驗將難以開展。例如，宮頸癌發病需要10 多年的時間，短期內基本不可能發生感染后致癌的情況。若從接種HPV 疫苗開始一直觀察到宮頸癌發生，這樣的臨床設計難以滿足疫苗研發的需求。還有一些疫苗，對應疾病的發病率低，很難在有限的時間里收集有效病例，從而限制了對疫苗有效性評估的進程。

4.2 免疫學替代終點

免疫學替代終點（surrogate of protection，SOP）的概念由WHO 提出，其定義為：由疫苗誘導產生的，與接種疫苗后臨床終點事件（感染或發?。┑陌l生相關，可用于預測疫苗保護效果的免疫學反應指標（體液免疫或細胞免疫）。在以免疫學指標為終點的臨床試驗中，可以直接應用已建立的免疫學替代終點，分析比較試驗疫苗組和對照疫苗組的保護率，即計算免疫學反應水平大于或等于免疫學替代終點水平受試者的百分比，以評價2 種疫苗保護效力的差異[31]。

經過多年研究，對于部分疫苗有了深入的了解，明確了保護性免疫指標與臨床終點的關系、免疫原性和臨床保護效力的相關性。這類疫苗含有相同抗原成分，往往不止一個生產廠家，在真實世界中得到了廣泛運用，因此可以采用選擇免疫學替代終點，采用可靠的實驗室檢測方法對疫苗的有效性進行評價[31]。

在臨床研究過程中，達到免疫學替代終點的疫苗可產生最低保護水平，在一定程度上能證明疫苗的有效性。使用免疫學替代終點的臨床試驗可以有效減少試驗所需的樣本量，縮短隨訪時間，降低臨床試驗的費用，在一定程度上可以有效地推動疫苗的研發進程。但對于已建立免疫學替代終點的疫苗，仍需要在真實世界中進行持續觀察，必要時甚至需要做出修正，確保其持續有效。

5 結語

有效性是疫苗很重要的技術指標，貫穿疫苗的全生命周期。無論是早期研發過程中對于抗原含量或體外效價的測定，在動物體內開展的體內效價測定、保護效果評價，臨床試驗，還是上市后的使用，都需要對疫苗有效性給予高度關注。目前，疫苗有效性檢測和評價仍然存在一些瓶頸，在具體開展研究工作的時候需要根據不同疫苗的特性，具體問題具體分析，在開展充分研究的基礎上確定出具體的檢測方法，并對檢測方法進行充分驗證，保障檢測方法客觀、準確。