人乳頭瘤病毒疫苗的概況及重組三價人乳頭瘤病毒疫苗的研發

劉玉瑩

北京康樂衛士生物技術股份有限公司

陳曉

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伍樹明

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銀飛

北京康樂衛士生物技術股份有限公司

劉永江*

北京康樂衛士生物技術股份有限公司

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是女性生殖道及皮膚黏膜常見病原體，其感染比較常見，80%以上女性一生中至少感染過1 次HPV[1]。一項由世界衛生組織國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）主導的研究表明，世界范圍內22 個國家的1000 例組織學確認的浸潤性宮頸癌病例的HPV檢測結果顯示，99.7%的宮頸癌呈現HPV-DNA 陽性，表明HPV是誘發宮頸癌的主要因素[2-4]。HPV 感染宿主上皮細胞后，會使宿主基因組發生不穩定和不可逆的改變。研究證明，高危型HPV的E6 和E7 分別通過降解抑癌基因p53和pRb來誘發宮頸癌[5-6]。病原生物學、流行病學等證據充分表明，宮頸癌是由高危型HPV的持續感染引起的[7]。目前已經確認，HPV 可以引起宮頸癌、陰莖癌、外陰癌、陰道癌、肛門癌和口咽癌（食管癌）等惡性腫瘤[8-16]。

1 HPV 分型

根據國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的報告，HPV 屬于乳頭瘤病毒科（Papillomaviridae）。乳頭瘤病毒科已知有至少53 個屬，HPV主要分布在Alphapapillomavirus（共14 個種，其中13 個種含HPV）、Betapapillomavirus（共6個種，其中5個種含HPV）、Gammapapillomavirus（共27 個種，均含HPV）、Mupapillomavirus（共3 個種，均含HPV）和Nupapillomavirus（共1 個種，含HPV）這5 個屬中[7]。目前已知的HPV 有200 多個型別，分屬上述5 個屬中的40 多個種。不同型別HPV 的L1基因序列差異大于10%，而同一型別HPV 的序列差異小于2%[17]。國際癌癥研究機構專題工作組依據HPV致癌性的不同將其分為三類，即高危型、低危型和可疑高危型[18-19]。我國HPV 檢測的型別范圍依據2015年11月26日原國家食品藥品監督管理總局發布的《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則》明確為：①高危型HPV：包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，共13 種基因型，具有確定的致癌性。高危型HPV 主要屬于HPV 系譜分類的α屬內的不同種（包括Alphapapillomavirus5、Alphapapillomavirus6、Alphapapillomavirus7、Alphapapillomavirus9），其中HPV16和HPV58屬于Alphapapillomavirus9，HPV18屬于Alphapapillomavirus7。高危型HPV 的感染與宮頸癌及癌前病變的發生密切相關，此外還與肛門癌、陰道癌、口咽癌及癌前病變的發生密切相關。②低危型HPV：包括HPV6和HPV11，屬于HPVα屬的Alphapapillomavirus10，無致癌性。HPV6 和HPV11 的感染與90%以上的尖銳濕疣和低級別鱗狀上皮增生病變的發生密切相關。③可疑高危型HPV：HPV26、53、66、73 和82，共5 種基因型。

2 HPV 的分子流行病學

宮頸癌是由高危型HPV 的持續感染引起的。不同的HPV型別在世界各地的流行病學分布不同。根據人乳頭瘤病毒資訊中心（HPV Information Centre）發布的最新調查報告，在全球范圍內，宮頸癌患者中宮頸細胞學檢測結果顯示，前10 位的HPV感染型別為：HPV16（55.2%）、HPV18（14.2%）、HPV45（5.0%）、HPV33（4.2%）、HPV58（3.9%）、HPV31（3.5%）、HPV52（3.5%）、HPV35（1.7%）、HPV39（1.5%）、HPV59（1.4%）[20]。在中國，宮頸癌患者中宮頸細胞學檢測結果顯示，前10 位的HPV感染型別為：HPV16（59.5%）、HPV18（9.6%）、HPV58（8.2%）、HPV52（6.5%）、HPV33（3.5%）、HPV31（2.8%）、HPV59（2.6%）、HPV45（1.9%）、HPV39（1.5%）、HPV56（1.1%）[20]。

2023年，人乳頭瘤病毒資訊中心最新的數據統計顯示，在全球范圍內宮頸細胞學檢查正常的女性中，HPV 感染率為29.8%。按洲統計，大洋洲最高，為66.7%；其次是非洲、美洲和歐洲，分別為39.2%、34.5%和27.2%，最低的是亞洲，為20.8%[20]。此外，有報告指出HPV 感染主要通過性行為傳播，其感染率高低主要取決于人群的年齡和性行為習慣。年輕的性活躍女性子宮頸部位HPV 感染率最高，感染高峰年齡在20 歲左右。我國女性存在第二個HPV 感染高峰，在40～45 歲[21]。在中國，宮頸細胞學檢查正常的女性中，最常見的5 個型別是HPV52（2.8%）、HPV16（2.7%）、HPV58（1.7%）、HPV33（1.1%）和HPV18（1.1%）[20]。

3 HPV 疫苗國內上市情況

接種HPV 疫苗是阻斷HPV傳播的最經濟、有效的手段[22-23]。早期動物乳頭瘤病毒模型（棉尾兔乳頭瘤病毒）研究表明，以感染性病毒顆?；蛘呷コ《綝NA成分的病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）免疫動物后，可以預防乳頭瘤病毒的感染，為研制HPV 疫苗的可行性提供了證據[24-26]。在20 世紀90年代初期，制備了HPV 的VLP，證明了重組HPV 疫苗的技術可行性[27]。同時期，眾多研究隊伍致力于HPV 疫苗的研制，其基本技術路線的原理均為通過DNA 重組技術體外表達HPV 主要衣殼蛋白L1，利用其自組裝形成VLP 的特性用作免疫原[28]。HPV L1 形成的VLP可以使機體產生中和抗體，從而阻止病毒感染，實現對宮頸癌等HPV 相關疾病的有效預防。目前認為，所有HPV 疫苗誘導的保護性中和抗體均為L1 蛋白的構象特異性抗體[29]。

2006年，美國食品藥品監督管理局(FDA)正式批準默沙東公司生產的Gardasil HPV 預防性疫苗上市。它是由釀酒酵母表達并純化的HPV6/11/16/18 L1 VLP 四價宮頸癌預防性疫苗。該疫苗被批準用于預防9～45 歲女性HPV6、11、16、18感染所引起的宮頸癌、陰道癌、外陰癌和肛門癌及癌前病變和生殖器疣[30]。這是FDA 批準的世界上第一個腫瘤疫苗。隨后，英國葛蘭素史克公司生產的商品名為Cervarix 的HPV 預防性疫苗也成功上市。它是來源于昆蟲桿狀病毒表達系統的HPV16/18 L1 VLP 二價宮頸癌預防性疫苗，使用AS04 佐劑（氫氧化鋁復合單磷酸脂質A），每0.5ml 的二價疫苗中HPV16/18 的L1 蛋白含量為20μg。這些成分吸附于含500μg 氫氧化鋁和50μg 3-O-去?；?4'-單磷酰脂質A 的AS04 佐劑系統中。該疫苗被批準用于9～45 歲女性，預防HPV16、18 病毒感染引起的宮頸癌、宮頸原位腺癌及癌前病變[31]。2014年，美國FDA 批準默沙東公司生產的重組九價HPV 疫苗Gardasil9（HPV6/11/16/18/31、33/45/52/58 九價疫苗）上市，從而成為全球第三種已上市HPV 疫苗。在我國，廈門大學聯合廈門萬泰滄海生物技術有限公司研發生產的二價HPV 疫苗馨可寧（Cecolin）在2019年被批準上市。2022年，玉溪澤潤生物技術有限公司生產的二價HPV 疫苗沃澤惠也成功上市。3 款進口疫苗價格昂貴且供應有限，滿足不了全球疫苗接種的需求。馨可寧每劑售價約為 Cervarix 的一半，療效卻與 Cervarix 相似。馨可寧和沃澤惠對于9～14 歲女性可采用2 劑次接種。這2 款國產疫苗的上市，很好地解決了進口疫苗價格昂貴且供應有限的問題，但這仍無法滿足全球日益增長的疫苗接種需求。表1展示了我國已上市的5 款疫苗概況。

表1 我國已上市的5 款疫苗概況

4 重組三價HPV疫苗的研發及其創新性

目前全球HPV 疫苗接種率仍不理想，遠遠低于世界衛生組織2030年“健康人群”的目標。因此需要加快疫苗的研發步伐，以滿足全球疫苗接種的需求。本公司積極響應世界衛生大會通過的《加速消除作為公共衛生問題的宮頸癌全球戰略》及提出的“90%的女童在15 歲前全程接種HPV 疫苗”目標，致力于重組HPV 疫苗的研發。根據HPV 流行病學數據，中國前3 位的HPV致癌型別為：HPV16（59.5%）、H P V 1 8（9.6%）、H P V 5 8（8.2%）[20]。本公司選擇大腸埃希菌原核表達系統，以16、18、58 型HPV 病毒作為靶向病毒株，開發了重組三價人乳頭瘤病毒（16/18/58 型）疫苗（大腸桿菌）（以下簡稱重組三價HPV 疫苗），用于預防HPV16、18、58 感染和由此導致的宮頸癌等相關疾病，預防范圍達77.3%，比已上市二價HPV 疫苗預防范圍增加了8.2%。本產品和已上市的疫苗技術路線基本相同，由單個HPV的主要衣殼蛋白L1，自動裝配成VLP，其結構和天然HPV 顆粒幾乎沒有差別，具有良好的免疫效果。用基因工程表達的L1 蛋白直接裝配出來的VLP 大小、形態各異，穩定性較差，還需要對其進行純化：先解聚得到五聚體，再重新組裝成VLP。

HPV VLP 疫苗工藝一般包括菌種庫建立、菌種發酵、菌體收獲、裂解、澄清純化、層析純化、VLP 組裝、換液、除菌過濾等步驟。目前，VLP 疫苗純化存在的問題主要有兩個方面：一方面是可溶蛋白少（產量低）、易形成無規則的聚集體；另一方面是宿主內毒素和DNA 殘留高。因此，我們對L1基因序列進行了優化：①從結構入手，提高表達量，降低無規則聚集和蛋白降解。②從工藝優化入手，以結構為基礎防止宿主內毒素和DNA 被VLP 包裹。研究發現：HPV L1 N 端參與五聚體間相互作用，但N 端截短不超過9 個（含9 個）氨基酸時，不影響HPV L1 五聚體形成VLP（T=7）；C 端不超過30 個氨基酸的截短亦不影響形成由72個五聚體組成的VLP（T=7）[32-33]。由于全長HPV L1 蛋白不能或很難在大腸埃希菌中表達，采用N端截短的方式，可以提高大腸埃希菌表達系統表達HPV L1 可溶性蛋白的表達量。采用C 端截短的方式，可以減少L1 蛋白降解，形成更多的、折疊正確的L1 五聚體蛋白，減少多聚體的形成，使得L1 蛋白在表達和純化過程中主要以可溶性五聚體形式存在，進一步降低了純化難度，有利于提高純化收率和產量，均一的L1 五聚體也保證了組裝后VLP 的均一度，從而獲得高純度、均一性好的VLP，顯著改善了產品質量，有效解決了VLP 純化過程中純度和收率低的問題，實現了VLP 的高效率組裝，為HPV VLP 的研究提供了新的研發思路。

5 重組三價HPV 疫苗免疫原性研究

HPV 疫苗能夠誘導特異性中和抗體，保護機體免受病毒侵害。因此，疫苗成功的關鍵是誘導有效的體液免疫，產生具有保護作用的中和抗體，對中和抗體的水平和持久性的研究是評估疫苗保護效果的重要依據[34]。

5.1 重組三價HPV疫苗在小鼠體內的免疫原性研究

針對本公司自制的重組三價HPV 疫苗開展免疫原性研究，以默沙東公司生產的Gardasil疫苗為陽性對照，分別免疫小鼠，檢測血清中的中和抗體滴度水平，檢測結果如圖1 所示。

圖1 重組三價HPV 疫苗和陽性對照疫苗在小鼠體內的中和抗體滴度水平變化曲線

圖1 中,黑色實線為重組三價HPV 疫苗免疫后的中和抗體滴度的動態變化，紅色實線為相同劑量陽性對照疫苗Gardasil免疫后的中和抗體滴度水平變化曲線。圖1 中，中和抗體滴度以Log10表示，誤差棒表示95%置信區間。

從圖1 可以看出，HPV16 VLP 產生的中和抗體滴度水平與陽性對照疫苗基本一致；HPV18 VLP 產生的中和抗體滴度水平略高于陽性對照疫苗；HPV58 VLP 產生的中和抗體在較高滴度水平。

5.2 重組三價HPV 疫苗在大鼠體內的免疫原性研究

針對本公司自制的重組三價HPV 疫苗開展免疫原性研究，以默沙東公司生產的Gardasil 疫苗為陽性對照，測定了重組三價HPV 疫苗在大鼠中的免疫原性，并觀察了其免疫持久性（21 周），檢測結果如圖2 所示。

圖2 Wistar 大鼠免疫后HPV 特異性體液免疫應答

圖2 中，黑色實線表示重組三價HPV 疫苗免疫大鼠后測定的結合/中和抗體滴度平均值；紅色實線表示為陽性對照疫苗Gardasil 免疫大鼠后測定的結合/中和抗體滴度平均值。圖2 中，結合/中和抗體滴度以Log10表示，誤差棒表示95%置信區間。

從圖2A、圖2C 可以看出，HPV16、18 VLP產生的結合抗體滴度水平與陽性對照疫苗基本一致；從圖2E 可以看出，HPV58 VLP 產生的結合抗體滴度水平較高。從圖2B、圖2D、圖2F 可以看出，HPV16 VLP 產生的中和抗體滴度水平與陽性對照疫苗基本一致，HPV18 VLP 產生的中和抗體滴度水平略高于陽性對照疫苗，同時HPV58 VLP 產生了較高的中和抗體滴度。

圖1 和圖2 的結果表明，重組三價HPV 疫苗可使小鼠和大鼠產生高滴度、持久性強的特異性中和抗體，且免疫效果與已上市疫苗相當。未來，該疫苗有望成為進口疫苗的有力競爭對手。

6 總結與展望

HPV 感染引起的疾病一直是人類關注的焦點。世界衛生組織于2020年11月17日 發布《加速消除宮頸癌全球戰略》（Launch of the Global Strategy to Accelerate the Elimination of Cervical Cancer），全球194 個國家承諾共同消除宮頸癌，以期到2030年，HPV 疫苗接種覆蓋率達90%、篩查覆蓋率達70%以及宮頸癌前病變和宮頸癌治療可及性達90%。HPV 疫苗在預防宮頸癌方面發揮著非常重要的作用。在過去20年中，HPV 疫苗研究快速發展，二價、四價和九價疫苗均已獲得上市許可，有效預防了全球HPV 感染?？禈沸l士采用原核表達系統研發了多款HPV 疫苗，包括重組三價HPV疫苗，重組九價HPV 疫苗，以及覆蓋全部高危型別的重組十五價HPV 疫苗。這些HPV 疫苗通過基因工程設計、生產工藝優化等方式提高了產量，從而大大降低生產成本，未來將在預防HPV感染方面發揮重要作用。相信在全體科研人員的努力下，人類將不再受HPV 感染的困擾。