生態環境因子與天麻品質相關成分含量的關系研究*

朱成豪,郭怡博,王尚濤,張遠帆,周建國,陳庭國,孫志蓉**

(1.北京中醫藥大學中藥學院,北京 102488;2.寧強縣農業農村局,陜西漢中 724400;3.寧強天麻研究所有限責任公司,陜西漢中 724400)

中藥材天麻又名赤箭、定風草,為蘭科(Orchidaceae)植物天麻(Gastrodiaelata)的干燥塊莖,具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡之功效,常用于治療小兒驚風,癲癇抽搐,破傷風,頭痛眩暈,手足不遂,肢體麻木和風濕痹痛等病癥[1],在中國已有2 000多年的藥用歷史?，F代藥理研究表明,天麻還具有鎮靜催眠、鎮痛、抗驚厥、抗氧化、改善記憶力、增強免疫和降血壓等作用[2]。天麻的主要活性成分有天麻素、對羥基苯甲醇和巴利森苷類等[3-5],而浸出物也是評價其藥材質量的重要指標。1987年天麻被列入《中國珍稀瀕危保護植物名錄》[6],2021年又被收錄于《國家重點保護野生植物名錄》[7],為國家二級重點保護野生植物。長期以來,因受生態環境和人為因素的影響,野生天麻的生長發育和繁殖機能逐漸減退,人工栽培呈必然趨勢。已有研究表明,氣溫在20-25 ℃時天麻生長較快,而在30 ℃以上時,天麻的生長便會受到抑制[8];烏天麻(G.elataf.glauca)適宜生長在海拔較高的云南和貴州,而紅天麻(G.elataf.elata)則主要分布在海拔相對較低的陜西、河南等地[9]。此外,土質疏松,利水透氣的微酸性或中性土壤較適宜天麻生長[10]。目前有關生態環境因子對天麻內在品質相關成分含量影響的研究還很有限,探明生態環境因子與天麻品質形成之間的關系,對天麻資源的可持續利用及道地性形成機制的解析具有重要意義。本研究對在陜西省漢中市寧強縣采集到的48份天麻樣品進行浸出物及主要有效成分含量測定并建立指紋圖譜,利用ArcGIS 10.2和SPSS 20.0軟件分析氣候、土壤、地形地貌等77個生態環境因子與成分含量之間的相關性,總結天麻品質相關成分在小尺度(縣域)空間范圍內的變異規律,為天麻資源的可持續開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司),Diamonsil C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,北京迪馬科技有限公司),Quintix35-1CN型十萬分之一電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司],BSA124S型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司],HH-4A型數顯單控單列恒溫電熱水浴鍋[國華(常州)儀器制造有限公司],KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司),SHB-IIIS型循環水真空泵(北京世紀予華儀器有限公司),350T型德蔚高速多功能粉碎機(廣州市渲龍廚具有限公司),DHG-9123A型鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 試劑

天麻素(批號:T10M9F55562)、對羥基苯甲醇(批號:H21D6Q7813)、巴利森苷A(批號:P24S11F124204)、巴利森苷B(批號:A13GB157725)、巴利森苷C(批號:D06N11S130122)、巴利森苷E(批號:D08D11S133702)均購自上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%。其他試劑還有乙腈[色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、磷酸[色譜純,福晨(天津)化學試劑有限公司]、水(娃哈哈純凈水)、無水乙醇(分析純,天津市致遠化學試劑有限公司)、甲醇(分析純,天津市致遠化學試劑有限公司)。

1.3 樣品

于2021年10-12月在陜西省漢中市寧強縣18個鎮采集林下栽培的新鮮天麻,記錄經緯度和海拔,隨機從中抽取分析樣品。具體樣品信息見表1。樣品經北京中醫藥大學孫志蓉教授鑒定為天麻(GastrodiaelataBl.)的新鮮塊莖,將塊莖放入蒸鍋中,保持水沸騰蒸制30 min,待天麻無白心時取出,室內自然冷卻,隨后將天麻樣品放入鼓風干燥箱中于60 ℃烘干至恒重,粉碎,過4號篩后干燥保存備用。

表1 天麻樣品信息

1.4 生態環境因子

月度氣象數據(包括平均氣溫、降水量、水氣壓、風速、太陽輻射,時間尺度為1970-2000年)以及海拔數據均源自全球氣候數據庫(http://www.worldclim.org/)。土壤數據(土壤沙含量、黏土含量)來源于聯合國糧食和農業組織土壤門戶網站的世界土壤數據庫(HWSD)土壤數據集(v1.2,https://www.fao.org/soils-portal/en/),中國區域的土壤數據由第二次全國土地調查提供的《1∶100萬中華人民共和國土壤圖》(1995年編制)得到。坡度數據使用ArcGIS 10.2軟件的投影柵格、按掩膜提取、坡度分析工具處理海拔數據得到。所有數據空間分辨率為30 s(約1 km×1 km)。

1.5 浸出物含量測定

參照《中華人民共和國藥典(一部)》(2020年版)[1](以下簡稱《中國藥典》)的方法測定。取供試品2-4 g,精密稱定,置于100-250 mL錐形瓶中,精密加水50-100 mL,密塞,稱定質量,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸1 h。自然冷卻后,取下錐形瓶,密塞,再稱定質量,用水補足減失的質量,搖勻,用干燥濾器濾過,精密量取濾液25 mL,置于已干燥至恒重的蒸發皿中,水浴蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定質量。

1.6 有效成分含量測定

1.6.1 色譜條件

采用Diamonsil-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B),梯度洗脫(0-10 min,3%-10% A;10-15 min,10%-12% A;15-25 min,12%-18% A;25-40 min,18% A;40-42 min,18%-95% A);流速為0.8 mL/min;檢測波長為220 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

1.6.2 對照品溶液的制備

取對照品適量,精密稱定,置于10 mL 容量瓶中,加乙腈-水(3∶97)混合溶液溶解定容,配制成質量濃度分別為天麻素(100 μg/mL)、對羥基苯甲醇(30 μg/mL)、巴利森苷A (362.6 μg/mL)、巴利森苷B (101.8 μg/mL)、巴利森苷C (102 μg/mL)、巴利森苷E (102.2 μg/mL)的混合對照品溶液。

1.6.3 供試品溶液的制備

精密稱定天麻樣品粉末0.5 g,置于具塞錐形瓶中,加入50%甲醇25 mL,稱定質量,超聲處理(500 W,40 kHz) 30 min,自然冷卻后,用水補足減失的質量,4 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。將48份天麻供試品的指紋圖譜數據導入“中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004版)”,以S10(大安鎮新明村)樣品為參照峰,采用中位數法和自動匹配法,獲取共有峰并建立寧強縣天麻共有的對照指紋圖譜,計算供試品相對于對照指紋圖譜相似度值。

1.6.4 標準曲線的制備

精密量取1.6.2節制備的混合對照品溶液,用乙腈-水(3∶97)混合溶液逐級稀釋至0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00倍,制成一系列不同濃度的混合對照品溶液,各取10 μL注入高效液相色譜儀。以1.6.1節的色譜條件測定各對照品峰面積,以對照品濃度為橫坐標(X),以峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸(表2)。

表2 各成分線性關系

1.6.5 精密度試驗

精密量取1.6.2節制備的混合對照品溶液,以1.6.1節的色譜條件測定各對照品峰面積,重復6次。其中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C與巴利森苷A的峰面積相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)分別為0.26%、0.20%、0.06%、0.05%、0.06%、0.11%。

1.6.6 穩定性試驗

精密量取1.6.3節制備的供試品溶液,分別于配制后0、6、12、24、36 h各進樣1次,以1.6.1節的色譜條件測定峰面積。其中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C與巴利森苷A的峰面積RSD分別為1.32%、2.18%、1.83%、1.98%、2.21%與2.25%,表明供試品溶液36 h內穩定性良好。

1.6.7 重復性試驗

精密稱取同一天麻樣品粉末2.0 g,共6份。按1.6.3節下制備成供試品溶液,以1.6.1節的色譜條件測定各供試品峰面積并計算各成分質量分數。其中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C與巴利森苷A的質量分數RSD分別為2.60%、1.17%、1.39%、1.42%、1.54%、1.43%。

1.6.8 加樣回收率試驗

精密稱定已知成分含量的天麻供試品0.5 g,共6份,按照要求制備供試品溶液,分別加入各對照品溶液,進樣測定,記錄峰面積,計算平均加樣回收率及RSD,結果見表3。

表3 6個特征性成分加樣回收率試驗結果

1.7 數據分析

使用ArcGIS 10.2軟件的采樣工具對48個采樣點的環境數據進行提取,其中海拔匹配情況見圖1。使用SPSS 20.0軟件對數據進行方差分析及皮爾遜相關性分析,運用Microsoft Office Excel 2020、Adobe Illustrator CS6、OriginPro 2015完成數據和圖表分析制作。

圖1 海拔匹配程度

2 結果與分析

2.1 指紋圖譜建立及相似度分析

通過比較對照品色譜圖(圖2),判定共有成分分別為A:天麻素,B:對羥基苯甲醇,C:巴利森苷E,D:巴利森苷B,E:巴利森苷C,F:巴利森苷A,與《中國藥典》規定的特征圖譜保留峰一致,說明建立的檢測方法穩定、可靠。48批天麻樣品的共有峰為6個,共有峰保留時間RSD較小(0.09%-0.17%),共有峰的峰面積RSD較大(18.50%-52.59%),說明48份天麻樣品中同一成分的含量差異較大。由表4可看出,不同采樣點之間天麻的特征圖譜相似度較高,除S37(舒家壩鎮文家河村)樣品相似度低于0.9(為0.843),其他樣品相似度均為0.948-0.998,表明寧強縣內天麻有效成分基本一致。

A indicates Gastrodin,B indicates P-hydroxybenzyl alcohol,C indicates Parishin E,D indicates Parishin B,E indicates Parishin C,F indicates Parishin A.

表4 48批天麻樣品的指紋圖譜相似度

2.2 不同采樣點天麻浸出物及有效成分含量聚類分析

對48份天麻樣品的浸出物及6種有效成分的含量作聚類分析,結果表明:漢源街道辦黃壩驛村天麻的天麻素、巴利森苷B、巴利森苷C含量最高,分別為1.05%、0.79%、0.30%;陽平關鎮張家河村天麻的對羥基苯甲醇含量最高(0.18%);高寨子街道辦古城村天麻的巴利森苷A含量最高(1.95%);高寨子街道辦何家院子村天麻的巴利森苷E含量最高(0.93%),巴利森苷類成分總含量以高寨子街道辦古城村最高(3.57%),約為大安鎮龍泉村(1.52%)的2.35倍,其次是漢源街道辦黃壩驛村(3.54%)。數據標準化后的聚類分析結果表明,總體來看不同采樣點聚為3類。6種成分聚為4類,其中天麻素與巴利森苷C、巴利森苷A、巴利森苷B聚為一類,浸出物、對羥基苯甲醇、巴利森苷E各為一類(圖3)。

The data in the table represent the content of relevant components,unit:%.

2.3 天麻浸出物及有效成分含量

48份天麻樣品的浸出物及有效成分含量統計分析結果見表5,其中天麻素的含量為0.252 6%-1.050 7%,對羥基苯甲醇為0.027 4%-0.182 7%,巴利森苷E為0.378 9%-0.928 3%,巴利森苷B為0.312 2%-0.787 8%,巴利森苷C為0.087 3%-0.301 2%,巴利森苷A為0.379 2%-1.949 0%,浸出物為16.05%-30.59%。含量變化幅度對羥基苯甲醇>天麻素>巴利森苷A>巴利森苷C>巴利森苷B>巴利森苷E>浸出物,表明浸出物及巴利森苷E含量穩定性高,離散程度小,對羥基苯甲醇及天麻素穩定性低,離散程度大?？h內所有樣點的浸出物均符合《中國藥典》要求。不同采樣點天麻浸出物及6種有效成分含量的差異顯著(P<0.001,表6),其中6種有效成分總量以漢源街道辦黃壩驛村天麻最高,達4.65%,約為大安鎮龍泉村天麻(1.81%)的2.57倍;漢源街道辦黃壩驛村紅天麻浸出物含量最高,達30.59%,禪家巖鎮張家壩村烏天麻浸出物含量最低,為16.05%。

表5 寧強縣天麻浸出物及有效成分含量

2.4 天麻浸出物及有效成分含量與生態環境因子的相關性分析

將天麻浸出物及有效成分含量與采樣點相應的77個生態環境因子進行Spearman相關性分析和顯著性檢驗,結果表明:浸出物含量與年平均氣溫、年平均水氣壓及土壤沙含量均呈顯著或極顯著正相關,與年平均降水量、年平均風速、海拔、土壤淤泥含量均呈顯著負相關。6種有效成分總量與年平均氣溫、年平均降水量、年平均風速均呈顯著正相關,與海拔、坡度呈顯著負相關。巴利森苷類成分含量與環境因素的關系和6種有效成分總量表現一致,而天麻素+對羥基苯甲醇總量僅與坡度呈顯著負相關關系(圖4)。隨著土壤沙含量和淤泥含量的升高,6種有效成分總量整體呈先升后降的趨勢(圖5)。由圖6可以看出,對羥基苯甲醇與2月降水,8、9月太陽輻射,交換性鹽基,土壤黏土含量及土壤的陽離子交換能力呈顯著正相關;巴利森苷A與1、12月降水,3、7、8月風速,土壤淤泥含量呈顯著負相關,與黏性層土壤的陽離子交換能力呈顯著正相關;巴利森苷E與坡度呈顯著負相關;巴利森苷B與黏性層土壤的陽離子交換能力呈顯著正相關。根據相關性大小發現,生態環境因子與天麻浸出物及有效成分含量的關系為氣候>海拔>土壤,氣候因子中影響較大的為12月降水量、4月風速和12月平均氣溫。與坡度相比,海拔影響較大。土壤因子中影響最大的為土壤淤泥含量,其次為土壤沙含量。

圖4 天麻浸出物及6種有效成分含量與部分生態環境因子的關系

The data in the table represent the correlation coefficient between the content of a certain component and its corresponding environmental factors.

3 討論

天麻的人工培育會受到多種因素的影響,如促進種子萌發的萌發菌、為其提供直接營養的蜜環菌、栽培的環境和技術等。本研究選擇栽培條件相對一致的樣點(萌發菌、蜜環菌和栽培技術相同)采集天麻樣品,并結合采樣點生態環境因子數據分析發現,寧強縣天麻浸出物及有效成分含量與生態環境因子的關系為氣候>海拔>土壤。其中,氣候因子中影響較大的為年平均氣溫、年平均降水量和年平均風速;海拔的影響大于坡度;土壤因子中影響最大的為土壤淤泥含量,其次為土壤沙含量。

氣候是地球上某一地區多年時段大氣的一般狀態,是多個生態環境因子的綜合表現[11]。其中,光照、溫度、水分對中藥材的分布與品質的形成最為重要,如防己(Stephaniatetrandra)中粉防己堿和防己諾林堿含量與年平均氣溫呈正相關[12];歐洲莨菪(Scopoliacarniolica)在干旱時阿托品含量達1%,而在濕潤環境下只有0.3%-0.5%[13]。本研究發現,寧強縣屬山地暖溫帶濕潤季風氣候,縣域內所產天麻的6種有效成分總量與年平均氣溫呈顯著正相關,天麻浸出物含量與1-5月、10-12月降水量,1-12月風速呈顯著或極顯著負相關,原因可能是一定氣候區域內氣溫影響了蜜環菌和天麻的生長及二者的伴生關系,有利于生物量積累和品質形成,而春季和秋冬季的降水直接影響林地土壤水分和空氣濕度,風速會增加林地通透性并調節氣溫,同時也會在少雨年份或季節加大蒸發量而加劇干旱程度,影響萌發菌、蜜環菌和天麻的生長。中藥資源具有明顯的空間和地域分布規律[13],藥材品質的形成與產地的地理位置、地形地貌、海拔等因子密切相關,如紋黨(Codonopsispilosula)中浸出物含量與海拔呈正相關[14]。本研究中天麻浸出物含量與海拔卻呈顯著負相關,可能是由于高海拔主要種植烏天麻,其麻形偏小,水分含量低,浸出物含量相對較高;但是低海拔紅天麻個大,浸出物絕對含量較高。已有研究證實中藥材在不同采收時間里的有效成分含量存在差異[15]。本研究選擇天麻成熟期進行采收,不同采樣點的天麻成熟期具有差異,導致天麻成熟期時間不一的原因可能包括環境因素和人為因素(栽培技術),本研究在保證栽培條件(所用菌種和栽培技術)一致的前提下進行采收,以此來探究環境因素對天麻質量的影響。土壤是藥用植物生長的基礎,土壤的質地、養分、酸堿性等均會對中藥材的品質產生影響[16],如最適合金銀花(Lonicerajaponica)的土壤類型是中性或稍堿性的沙壤土[17]。本研究發現,天麻6種有效成分總量與土壤淤泥含量呈顯著負相關,與土壤沙含量呈顯著正相關。因天麻適宜生長在較疏松的沙土或沙壤土中[18],土壤通透性不佳不利于蜜環菌生長,且易染雜菌,從而影響天麻生長。此外,本研究發現天麻在生長過程中受到環境脅迫(如氣溫、水氣壓較高等)時,在外觀形態上會變細長、生物量降低、浸出物含量增加,當處于順境(如氣溫較低、風速較快等)時,天麻會變短粗、生物量增加、浸出物及巴利森苷A含量降低,同樣體現了中藥材的“逆境效應”[19]。寧強縣天麻的6種有效成分總量和海拔、坡度呈負相關,高海拔下氣溫低,可能不利于有效成分的積累,這與6種有效成分含量與年平均氣溫呈正相關的結果吻合。

位于寧強縣巴山北坡高中山區的毛壩河鎮、禪家巖鎮、二郎壩鎮及巴山鎮的氣候特點為氣溫低、風速大、促生產月降水量大、光照稍不足,浸出物含量相對較低,6種有效成分含量相對居中,在天麻栽培過程中應注意調節林分郁閉度,采取覆蓋保溫和防積水等措施;寧強縣北部秦嶺南坡中山的代家壩鎮、巨亭鎮、大安鎮、太陽嶺鎮以及縣南部的二郎壩鎮、巴山鎮的氣候特點為7-8月降水量相對較少,光照充足,氣溫較低,2-4月、9-11月降水量稍不足,浸出物和6種有效成分含量相對較低,種植天麻時應注意在天麻生長前期和中后期適當補水,適當調節林分郁閉度;寧強縣中部代家壩鎮、胡家壩鎮、漢源街道辦、高寨子街道辦、鐵鎖關鎮、陽平關鎮的氣候特點為氣溫較高、光照較為充足、風速較低、降水量較為充沛,浸出物和6種有效成分含量相對較高,栽培時應當注意林分郁閉度、溫度和濕度的調控,保持通風以保證產量;寧強縣西部低山區青木川鎮、廣坪鎮、安樂河鎮、燕子砭鎮的氣候特點為氣溫高,促生產月降水量少,風速低,氣候較不利于天麻增產,浸出物和6種有效成分含量相對居中,栽培時應當注意調控溫度和濕度。

4 結論

陜西省漢中市寧強縣天麻浸出物含量與年平均氣溫、年平均水氣壓、土壤沙含量均呈顯著或極顯著正相關,與年平均降水量、年平均風速、海拔、土壤淤泥含量均呈顯著負相關;6種有效成分總量與年平均降水量、年平均氣溫、年平均風速均呈顯著正相關,與海拔、坡度呈顯著負相關。生態環境因子與天麻浸出物及有效成分含量的關系為氣候>海拔>土壤,氣候因子中影響較大的為12月降水量、4月風速和12月平均氣溫。與坡度相比,海拔影響較大。土壤因子中影響最大的為土壤淤泥含量,其次為土壤沙含量。

本研究從小尺度層面上探究生態環境因子對天麻品質相關成分含量的影響,研究結果可為寧強縣優質天麻培育及天麻資源合理開發利用提供參考,同時為其他行政區域面積大、地形地貌復雜縣域的中藥材產業規劃提供參考。在具體研究過程中應考慮到所用生態環境因子數據庫的實時性和分析方法的準確性。