農藥環境污染對兩棲動物蛙類毒性效應研究進展

明仁月，陳可嘉，李蘭英，楊 亞，盧 平

（貴州大學精細化工研究開發中心，貴陽 550025）

農藥是農、林、牧業中控制有害生物和調節植物生長的化學藥品[1]。研究報道，若不施用農藥，水果、蔬菜和谷物產量將分別減少78%、54%和32%[2]。因此，農藥在提高全球農作物產量、提供充足的優質食品和緩解貧困等方面做出了重大貢獻[3]。據統計，全球每年使用農藥約30億kg，但能有效控制害蟲的總量只有1%[4]。大量的農藥通過噴灑[5]、徑流或滲流[6]等方式廣泛分布于環境中，污染了水生和陸地環境，對非靶標生物構成一定的威脅。

兩棲動物是維持水生、陸地和農田生態系統的非靶標生物，對平衡生態系統和保障糧食安全具有重要的意義[7]。然而兩棲動物皮膚具有滲透性[8]，對環境化學物質較敏感，在水生和陸地棲息地接觸農藥的風險較高[9]。研究發現環境中的農藥會顯著影響兩棲動物的發育[10]，導致平衡生態系統中兩棲動物減少[11]，威脅了兩棲動物的種群，削弱了兩棲動物在生態系統中的功能。蛙類是常見的兩棲動物，它們在食物鏈中發揮著重要的作用，每年捕食數以億計的昆蟲，是環境健康的重要指標。當污染物影響棲息地時，它們往往是第一批受害者，為生態系統中的敏感生物提供了預警。因此，研究農藥對兩棲動物的風險具有重要意義。

為了更好地保護兩棲動物，實現人類活動和自然的和諧統一，本文根據近年來農藥對兩棲動物影響研究的文獻，將農藥對兩棲動物的毒性效應進行了總結和分析，為評估農藥對兩棲動物的風險及農藥的合理使用提供科學依據。

1 農藥環境污染物對蛙類急性毒性研究

蛙類是農業害蟲的主要天敵之一[12]，其典型的發育階段如圖1所示[13-14]。急性毒性試驗是評估農藥對非靶標生物造成影響的重要手段，通過LC50（半致死濃度）可以快速有效地評價毒性，為長期慢性毒理試驗、生殖毒性試驗等提供基礎數據[15]。當前，國內外學者就農藥對蛙類急性毒性試驗的數據見表1。

表1 農藥對兩棲動物蛙類急性毒性試驗數據

圖1 蛙類典型發育周期

不同類別的農藥對兩棲動物產生的毒性不同。根據GB/T 31270.18—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》第18部分“天敵兩棲類急性毒性試驗”中農藥對兩棲動物的急性毒性劃分，96 h的LC50≤0.1 mg/L為劇毒，0.1＜LC50≤1.0 mg/L為高毒，1.0＜LC50≤10 mg/L為中毒，LC50＞10 mg/L為低毒。

擬除蟲菊酯、有機氯、有機磷類殺蟲劑對蛙類的毒性大多表現為高毒，與其他發育階段相比，對蝌蚪階段的毒性更大；氨基甲酸酯殺蟲劑對蛙類毒性研究較少，從文獻上看，不同的氨基甲酸酯殺蟲劑對蛙類毒性表現不一，滅多威對蝌蚪表現為低毒，甲萘威對成蛙毒性較高；新煙堿殺蟲劑對蛙類毒性的研究大多集中在蝌蚪發育階段，該階段毒性為低毒，對胚胎和蛙階段的研究較少；多數除草劑類農藥對蛙的胚胎、蝌蚪、蛙發育階段表現為中毒。殺菌劑品種繁多，結構不一，對非靶標生物有著不同的選擇性，對蛙類的毒性研究集中在蝌蚪發育階段，不同的殺菌劑對蝌蚪表現出顯著差異的急性毒性，如肟菌酯對非洲爪蟾蝌蚪表現為低毒，而吡唑醚菌酯對美國牛蛙蝌蚪毒性達到了劇毒。

從毒性數據上發現，①對于同一種兩棲動物，同一類型的不同種農藥表現的毒性差異很大，如久效磷對Boana xerophylla蝌蚪的毒性為低毒，二嗪磷為中毒，而毒死蜱為高毒。同一農藥對不同發育階段兩棲動物體現的毒性也存在著差異，如Roundup-草甘膦（有效成分為異丙胺鹽）對非洲爪蟾蝌蚪表現為高毒，對胚胎和成蛙為中毒；硫丹對非洲爪蟾蝌蚪也表現為高毒性，而胚胎為中毒。②手性農藥對兩棲動物的毒性存在著顯著差異，S-聯苯菊酯對非洲爪蟾蝌蚪為高毒，而R-聯苯菊酯為中毒，但手性農藥對兩棲動物毒性研究報道較少，應加強對該類農藥的關注。多種毒性數據顯示，兩棲動物幼體階段比胚胎對環境中的農藥更為敏感，這可能是胚胎外層膠膜的存在使其免受化學品的污染[16]。

2 農藥環境污染物對蛙類發育的影響

農藥在減少害蟲造成的作物損失方面發揮著關鍵作用，然而，殘留在環境中的農藥對兩棲動物的生存造成了一定的危害，對兩棲動物各個發育階段表現出不同程度的損傷。

在胚胎階段，西維因、硫丹和辛基苯酚降低了河邊蠑螈的存活率[47]；百菌清的持續暴露抑制了阿根廷蟾蜍的孵化率，并造成其腹部和尾畸形[48]；百草枯導致蟾蜍發育停滯，頭和背部畸形明顯[49]。在幼體階段，噻蟲嗪和氯噻嗪抑制了非洲爪蟾蝌蚪體重和體長的發育[50]；暴露于氯氰菊酯僅168 h對蟾蜍產生的畸形指數就達到了5[51]；毒死蜱嚴重損害了黑眼瞼小樹蛙口腔及腸的結構[52]，導致捷蛙的骨骼和肌肉缺失，改變了鰓的形態和超微結構，蝌蚪依靠鰓呼吸，而影響鰓的發育會導致其呼吸困難，對蝌蚪健康和體能造成一定的影響[53]；西草凈不僅延遲了Silurana tropicalis后肢的發育，還造成尾扭曲嚴重[54]；阿特拉津的脅迫降低了南方豹蛙發育階段的生長率，造成按時變態的蝌蚪較少[55]；硫丹的暴露導致了變態后Fejervarya sp.1和F.teraiensisd前后肢的畸形[56]；西維因使南方豹蛙在變態發育過程中有較高的死亡率，且近18%的豹蛙出現了畸形，包括內臟和四肢等[57]，同時農場中發現成年階段草蛙和湍雨濱蛙的前肢和后肢不完整[58]；毒死蜱、樂果和敵稗的暴露導致沙漏樹蛙的脊柱側彎、后凸，以及水腫和皮膚潰瘍等損傷[59]。研究還發現農藥對兩棲動物妊娠母體有一定的毒性。農藥污染池中暴露程度更高的蟾蜍種群長期存在生殖障礙——受精、存活率低等問題[60]。農藥對蛙類常見的形態損傷見圖2，圖中af表示軸彎曲，e為水腫，b為尾畸形，m為頭畸形，rbs為體型縮小，ut為尾發育不全[52,54]。

圖2 農藥脅迫下對蛙類形態常見的損傷

生物生長過程受基因在時間、空間上高度有序表達的調控。農藥散播在環境中，可能會干擾兩棲動物發育相關基因的表達，影響基因的功能，造成包括畸形在內的各種發育異常。如草甘膦暴露于非洲爪蟾胚胎后，心臟中isl1（胰島素增強子結合蛋白1）、nkx2.5（心臟特異性同源盒轉錄因子）、mhca（α-肌球蛋白重鏈）、actc1（心肌α-肌動蛋白）和tnni3（肌鈣蛋白I）表達降低，心臟結構異常，導致心率降低[61]。在有機錫的暴露下，非洲爪蟾甲狀腺應答基因trβ（甲狀腺激素受體β）、bteb（基本轉錄元件結合蛋白）、dio2（碘甲腺原氨酸脫碘酶-2）、tshβ（促甲狀腺激素β亞基）和slc5a5（溶質載體家族成員5）的表達受到影響，擾亂了甲狀腺的信號通路，抑制了甲狀腺的發育[62]；在甲萘威的作用下，綠蛙蝌蚪甲狀腺的應答基因表達受到抑制，影響了其在mRNA中的豐度分布[63]。

3 農藥環境污染物對蛙類行為活動的影響

動物的行為（覓食、社交、交配、捕食、遷徙和躲避）是評價動物及其種群狀態的標志[64]。兩棲動物具備獨特的生理特性，在食物鏈中有著重要的地位，而農藥的廣泛使用對其生存、捕食和繁殖造成了一定的影響，進而危害了其種群和生態系統的平衡。

異常旋轉和不正確姿勢是神經毒性應激的標志之一[65]。在硫丹的暴露下，斑點蛙蝌蚪表現出尾旋轉快速、側臥及背部向下等異常行為[6]；滅多威的暴露使得阿拉伯蟾蜍蝌蚪也出現類似的情況[66]。

食物是動物生長及生理功能的必需品[67]。西維因導致南方蟾蜍蝌蚪進食量減少了40%[68]；唑酰草胺對非洲爪蟾蝌蚪攝食有顯著的抑制作用[69]。覓食的減少會導致用于分配儲存、繁殖和生長的能量受到限制[70]，對健康造成影響。

游泳模式是評估蝌蚪生態毒理學行為活動的一種典型方式[71]。南方豹蛙蝌蚪游泳的總位移和平均速度隨著噻蟲胺暴露濃度的增加而顯著下降[72]；敵草隆的暴露顯著降低了牛蛙蝌蚪的最大速度[44]。在視覺測定和視頻跟蹤模式下，發現硫丹對非洲爪蟾蝌蚪游泳行為造成了影響，且導致其取食次數降低[73]。草甘膦的暴露降低了捷蛙蝌蚪躲避蜻蜓幼蟲的能力[74]；模擬蒼鷺攻擊的環境，發現暴露于吡蟲啉的林蛙難以逃離捕食者的追捕，而沒有接觸吡蟲啉的林蛙會通過移動和跳躍等方式來躲避[75]。

交配行為也會因農藥污染物受到影響。接觸莠去津的雄性非洲爪蟾睪丸酮降低、繁殖腺變小、喉部發育雌性化，導致交配行為受到影響，從而降低了它們的生育能力[76]。

除此以外，研究表明農藥產生的毒性效應可能會干擾兩棲動物的自主神經調控，從而影響其行為。2，4-二氯苯氧乙酸能夠降低牛蛙蝌蚪的呼吸速率[77]，硫丹的暴露降低了青蛙蝌蚪在水面呼吸的頻次[78]，而充足的水面呼吸對于調節兩棲動物的血氧有著重要的意義[6]。

4 農藥環境污染物對蛙類氧化應激的影響

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的狀態，一般主要是指自由基在體內產生的一種負面作用，是導致衰老和疾病的一個重要因素[79]。自由基會產生氧化應激現象，該現象對脂質、蛋白質、DNA及外源抗氧系統的酶系統和非酶系統都會產生負面影響[80]，如圖3所示。

圖3 產生氧化應激的自由基途徑

丙二醛（MDA）是脂質過氧化反應產生的代謝產物，其含量可反映脂質過氧化水平，即機體細胞受自由基攻擊的程度。在噻蟲嗪的影響下，中華蟾蜍蝌蚪體內丙二醛含量顯著升高，造成了脂質過氧化[33]；隨著暴露時間的持續，戊唑醇使黑斑蛙體內MDA含量持續升高[81]。蛋白質羰基是多種氨基酸在蛋白質氧化修飾過程中的早期標志，其含量高低表明蛋白質氧化損傷程度的大小，是衡量蛋白質氧化損傷的主要指標[82]。敵百蟲的暴露不僅使Boana curupi蝌蚪體內MDA升高，而且增加了蛋白質羰基的含量，誘導了脂質、蛋白質的氧化損傷[83]。在彗星實驗中，根據Endo III sites位點計算分析草甘膦和草膦酸銨對砂質犀角蟾蝌蚪是否造成DNA損傷，結果表明兩種農藥均造成蝌蚪的DNA損傷，其中草甘膦引起的氧化損傷更為嚴重[84]。

抗氧化系統主要分為酶類抗氧化系統和非酶類抗氧化系統，其使自由基的產生與消除處于動態平衡狀態，是生物體的一種適應性機制?？寡趸笍牟煌嵌葏f助清除體內的活性氧（ROS），在抗氧化過程中起著重要的作用[85]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是抗氧化系統的核心組成部分，在防御氧自由基方面起著不可或缺的作用[86]；谷胱甘肽S-轉移酶(GST)是一種已知的II相代謝解毒酶，可催化谷胱甘肽（GSH）與外源物質及其代謝產物相結合[87]。熱帶爪蟾胚胎暴露于低濃度高效氯氟氰菊酯后，隨著濃度的增加，SOD和GST活性顯著升高，誘導氧化應激[88]；黑斑蛙蝌蚪在高劑量吡蟲啉暴露下，體內SOD、CAT、GST活性降低[32]。分析其原因，可能是ROS過度積累，導致這些酶無法抵御高水平的氧化應激，從而失去活性[89]。在阿特拉津和毒死蜱的脅迫下，東北林蛙變態時期肝臟組織中的SOD和CAT活性隨著農藥劑量的上升而顯著下降[90]；非洲爪蟾幼蛙暴露于啶蟲脒導致SOD、CAT、GST活性增加[35]；農藥誘導的GST和CAT活性存在性別差異，成年雌雄非洲爪蟾暴露于三唑酮及其代謝物三唑醇，發現對雌性血液中SOD的影響大于雄性，與GST和CAT的結果相反[91]。農藥的暴露也會改變其他抗氧化酶的活性。GR（谷胱甘肽還原酶）是生物體中去除過量ROS的抗氧化酶，可以促進生物體細胞的健康發育[92]。黑斑蛙蝌蚪暴露于吡蟲啉后，GR活性顯著升高[93]。T-AOC（總抗氧化能力）是機體抗氧化系統功能狀態的綜合能力，其大小直接反映機體清除自由基的總體能力[87]，對機體T-AOC的檢測可以直觀地反映環境化學物質對生物體生理毒性的影響程度。隨著啶蟲脒和噻蟲嗪濃度的升高和持續暴露，鎮海林蛙蝌蚪體內的T-AOC受到抑制并逐漸下降，對蝌蚪的抗氧化系統造成了毒害作用[94]。

非酶類抗氧化劑GSH（谷胱甘肽）是多種酶的輔酶，涉及多種生物學過程，參與清除ROS，防護氧化應激對機體產生的損傷[95]。研究發現，蟾蜍的GSH不受甲萘威的脅迫，這可能是由于CAT被抑制，從而維持了GSH水平的結果[96]。NO是一種高活性、膜可滲透的自由基，也是一種重要的信號分子和非酶抗氧化劑[97]。戊唑醇暴露于變態期非洲爪蟾，導致其NO水平下降[98]，ROS會氧化NO合成酶的輔因子，減少其活性，使NO含量降低[100]。

5 農藥環境污染物對蛙類代謝器官的影響

代謝是生物體從環境中攝取營養物質轉化為自身物質，同時將自身原有組成物轉變為廢物排出到環境的不斷更新的過程。肝臟和腎臟是維持兩棲動物正常功能的重要代謝器官。

肝臟有著強大的解毒、代謝、免疫的生理功能，肝臟通過肝藥酶清除血液中的廢物和外來異物，防止肝損傷以維持生命的正?；顒覽100]，因此，肝臟是某些農藥對非靶標動物毒性的主要靶器官[101]。據報道，檢測農田中的兩棲動物，僅在其肝臟內就檢測出9種農藥[102]。農藥造成的肝臟毒性主要決定于暴露強度、影響的細胞類型以及化合物的暴露時間。常見的肝損傷類型主要有肝細胞死亡、膽汁淤積、膽管損傷、肝血竇異常、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化和肝腫瘤等。戊唑醇和乙胺嘧啶對意大利樹蛙蝌蚪肝臟表現出不同的損傷，戊唑醇對肝臟表現出肝變質和肝細胞的間隙擴張[103]；乙胺嘧啶暴露導致意大利樹蛙血管擴張及竇充血明顯[104]；西瑪津可導致非洲爪蟾蝌蚪肝細胞壞死及萎縮[105]；在吡蟲啉的作用下，發現炎癥細胞聚集在非洲爪蟾幼蛙的肝組織中[35]。三唑酮及其代謝物三唑醇對非洲爪蟾成蛙的肝臟造成肝質膜溶解、肝竇輕度擴張及細胞索結構疏松等損傷[91]；接觸敵百蟲后的樹蛙，發現其肝細胞空泡化、壞死和腫脹[106]；溴氰菊酯增加了沼澤蛙肝臟黑素吞噬聚集物，肝竇擴張、浸潤、血管上皮、中央靜脈變性等病變[107]；在施用農藥的稻田中發現Lysapsus limellum和Rhinella bergi肝竇增大、血運過度、肝細胞空泡化和血管擴張等現象[108]；林蛙接觸毒死蜱后，肝纖維化突出[109]，而肝纖維化是慢性肝損傷的病理特征[110]。肝細胞毒性生物標志物是評價肝損傷的重要手段，如丙氨酸轉移酶、天冬氨酸轉移酶、山梨醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶等。啶蟲脒引起了埃及蟾蜍血清中肝功能酶活性異常[111]。

兩棲動物在新陳代謝過程中會產生多種廢物，大部分廢物通過腎小球濾過、腎小管的重吸收及分泌功能排出，同時排出體內的多余水分，以此調節體內的酸堿平衡，并維持內環境的穩定[112]。而污染物在兩棲動物體內的堆積會破壞以上平衡，對腎臟產生負面的影響[113]。常見的腎臟損傷有水腫、腎小管擴張、單核細胞浸潤、腎小管上皮細胞變性、出血及纖維化等。在敵百蟲的脅迫下林蛙蝌蚪外觀浮腫嚴重，解剖后發現其鰓腔內充水，腎臟器官顏色異常呈灰白色[114]；戊唑醇的暴露造成意大利樹蛙蝌蚪腎臟炎癥，并導致腎小管擴張、出血及單核細胞浸潤等損傷[104]；溴氰菊酯造成沼澤蛙腎臟腎小球收縮、腎小管上皮細胞變性、腎小囊細胞肥大等一系列問題[106]；在西維因的暴露下，在蟾蜍的腎臟中觀察到腎小管上皮變形、空泡化、核溶解、壞死、出血及纖維化[115]。除此以外，研究還發現農藥的存在會抑制腎臟的發育，敵敵畏的暴露，抑制了斑腿泛樹蛙腎臟的發育，導致其腎臟萎縮[116]。

6 農藥環境污染物對蛙類免疫系統的影響

免疫是阻止機體受到病原體攻擊的一種防護措施[117]。兩棲動物暴露于農藥后，免疫系統是其抵抗外來物質的重要場所[118]。農藥對兩棲動物免疫系統的直接或者間接損害，將導致免疫細胞發生變化，進而影響機體的免疫反應。注射炎癥介質巰基乙酸，白細胞數量顯著減少，且其吞噬活性減弱與炎癥介質巰基乙酸模型相比，低濃度的莠去津對北方豹蛙也產生了類似的作用，表現為白細胞數量減少，吞噬活性降低，降低了炎癥反應的應答[119]；北方豹蛙和非洲爪蟾暴露于6種混合農藥后，對寄生蟲的抗性減弱，其中豹蛙蝌蚪中淋巴細胞數量顯著減少[120]，爪蟾蝌蚪中脾細胞和吞噬細胞數量顯著減少[121]。

農藥的暴露，對免疫細胞相關酶也造成了一定的影響，它們是維持脊椎動物機體免疫系統功能重要的酶[122]。在倍硫磷和氧樂果的暴露下，青蛙組織中MPO（髓過氧化物酶）活性增加[123]。MPO是中性粒細胞釋放的防止病原體侵入機體的一種酶，在生理過程下，病原菌侵入機體MPO形成次氯酸，促進吞噬溶酶體內所含微生物的破壞[124]。隨著MPO活性的增加，產生的次氯酸促進了宿主組織損傷。

農藥還可改變免疫基因的表達，不僅抑制了免疫反應，還增加了兩棲動物感染寄生蟲的風險。莠去津抑制了非洲爪蟾蝌蚪中與免疫功能相關的7個基因的表達[125]；氯氰菊酯和噻苯達唑長期暴露引起非洲爪蟾蝌蚪線粒體熱激蛋白hsp 70和IL-1b（白細胞介素1b）顯著上升[126]。莠去津[127]和西維因[128]導致幼體和變態期的非洲爪蟾抗病毒能力減弱，蝌蚪在感染FV3（蛙病毒3型）病毒后死亡率增加，炎性因子TNF-α和抗病毒基因IFN-I（I型干擾素）發生顯著改變。

7 結論和展望

環境中的農藥污染了兩棲動物的棲息地，損傷了兩棲動物的黏膜、皮膚、組織和器官，影響了兩棲動物的變態發育和生長發育過程，降低了兩棲動物的免疫能力，使兩棲動物的行為活動受限，躲避天敵、捕食、繁殖的能力下降。高效、低毒、低殘留的化學農藥一直是開發綠色農藥和環境友好農藥的準則，技術、防控手段和方式的不斷改進可以減少化學農藥使用的途徑，制定科學、合理有效的農藥使用準則和規范，評估農藥對兩棲動物的風險，防止農藥在環境中的污染及對非靶標生物造成的影響，對在全球兩棲動物數量銳減的背景下更好地保護兩棲動物具有重要意義。