高壓均質輔助酶解豆乳對蛋白結構及抗營養因子的影響

齊寶坤 王 琪 鐘明明 廖 一 孫禹凡

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

0 引言

豆乳的穩定性和抗氧化活性并不理想，并且含有多種抗營養因子(ANF)影響其為人體提供營養健康[1]，包括熱穩定性ANF植酸(PA)、大豆球蛋白(11S)、β-伴大豆球蛋白(7S)、低聚糖等和熱不穩定性ANF胰蛋白酶抑制劑(TI)、脲素酶(UA)、抗維生素因子、致甲狀腺腫素、大豆凝集素(SBA)。其中，脲酶作為抗營養因子組分的一種，是無毒的酰胺酶類物質，易分解成含氮化合物進一步產生氨，導致氨中毒或引起機體中氨代謝紊亂；大豆凝集素約占大豆蛋白質的3%，是一種高度抗消化的糖蛋白；致甲狀腺素是由硫代葡萄糖苷形成的，這種物質會引起甲狀腺腫大；脂肪氧化酶(LOX)又稱為抗維生素因子，約占大豆蛋白的1%，催化脂肪氧化將脂溶性維生素和胡蘿卜素破壞，引發維生素缺乏；胰蛋白酶抑制劑是一種高分子蛋白質，大豆約含30 mg/g，嚴重影響消化過程；植酸與金屬離子(如鈣、鎂、鋅、銅和鐵)形成螯合物降低礦物質的生物利用度；大豆抗原蛋白主要存在于11S和7S中，會引起動物機體發生過敏反應。這些抗營養因子的存在會導致食物利用率低、生長性能下降，甚至引發疾病[2]。因此為了提高大豆的營養價值，鈍化大豆中抗營養因子(ANF)含量具有重要的現實意義。

近20年來對去除大豆抗營養因子的相關研究十分廣泛，研究方法包括熱處理和非熱處理物理手段、浸泡萌發、發酵、蛋白酶解改性、糖基化修飾及pH值調控化學方法等改變大豆蛋白的空間結構和分子特性，進一步影響 ANF 活性并對其功能性質進行研究。文獻[3]研究高壓均質與酶法聯合改性對大豆蛋白抗原性及結構的影響；文獻[4]采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分別水解脫脂豆粕，并采用雙抗體夾心酶聯免疫反應(ELISA)測定其抗原活性。文獻[5]進行酶促交聯處理，采用?；D移酶MTGase催化谷氨酰胺和賴氨酸殘基之間的?；D移反應，導致共價蛋白質交聯[6]，促使大豆交聯成高分子量聚合物，蛋白質氨基酸序列及空間結構發生改變引起抗原表位的隱藏或掩蓋進而抑制了11S和7S的抗原性。此外，酶法改性蛋白可以提高抗氧化劑活性，文獻[7]利用堿性蛋白酶制備大豆蛋白活性肽對抗氧化活性研究；文獻[8]研究發現高壓處理提高了酶的水解效率，在高壓下水解可以增加小肽的產量，獲得的水解物具有更高的生物活性。綜上所述，目前關于酶改性抑制大豆蛋白抗原性的研究較多，但對酶解豆乳蛋白結構和分子特性的改變與大豆中ANF及其功能特性的影響研究相對較少。

因此，本文以不同均質壓力預處理的豆乳作為底物，分別采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶進行水解，研究高壓均質輔助酶解豆乳對蛋白質結構與ANF的影響，通過豆乳前后溶解性、水解度和粒徑、Zate電位、儲存穩定性、豆乳微觀結構、線性表位、二三級結構的改變，對比分析豆乳抗營養因子含量的差異，以揭示高壓均質輔助蛋白酶解豆乳過程中鈍化抗營養因子的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(東農99)，東北農業大學大豆研究所；木瓜蛋白酶(酶活力為8.0×105U/g)，堿性蛋白酶(酶活力為2.0×105U/g)，菠蘿蛋白酶(酶活力為3.5×105U/g)，北京奧博星生物技術有限公司；植酸鈉、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)標準品、苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基苯胺(BAPNA)、乙二胺四乙酸，購買于北京化工試劑廠；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測試劑盒，上海酶聯生物技術公司。

1.2 儀器與設備

ATS-BASIC 100型高壓均質機，德國ATS儀器公司；Multiskan FC型酶標儀，賽默飛世(上海)儀器有限公司；LGJ-18 型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；DYY-6D 型電泳儀，北京市六一儀器廠；FL8500 型熒光分光光度計，美國 Perkiin Elmer 公司；ALPHA-T 型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Bruker公司；TU-1901型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1工藝流程

工藝流程如下：大豆→篩選→清洗→浸泡(料液比3 g/mL、12 h)→冷榨磨漿(料液比6 g/mL)→過濾→高壓均質(30～120 MPa)預處理→酶解(酶最適溫度、加酶量0.2%、保持豆乳自然pH值6.5)→噴霧干燥→過篩→成品。

1.3.2高壓均質輔助蛋白酶解豆乳工藝

取適量新鮮冷榨豆乳，等量分裝，采用不同均質壓力(30、70、90、100、120 MPa)預處理，每個樣品均質3遍，再等量加入不同酶水解處理(堿性蛋白酶 E1、木瓜蛋白酶 E2、菠蘿蛋白酶 E3)，加酶量參照文獻[3]。本實驗酶與底物質量百分比為0.2%，酶解溫度采用酶的最適反應溫度(E1：50℃；E2：55℃；E3：45℃)，水解時間為 20 min。

1.3.3溶解度測定

將水解物在室溫(20℃)下攪拌1 h，最后在20℃和9 000g下離心20 min。上清液中的蛋白質含量通過Pierce BCA Protein Assay 試劑盒測量，使用牛血清白蛋白作為標準。溶解度表示為存在于上清液中蛋白含量A1與樣品總蛋白質含量A2的百分比。氮溶解指數(NSI)計算公式為

(1)

1.3.4水解度測定

參考文獻[9]的方法，以絲氨酸作為標準，采用鄰苯二甲醛(OPA)法測定，取160 mg OPA(純度97%)溶于4 mL 無水乙醇，加入 0.2 g的SDS(十二烷基硫酸鈉)、7.620 g的硼砂、0.175 g DTT(二硫蘇糖醇，純度99%)去離子水定容200 mL?；靹虮芄獗４?。400 μL樣品與3.0 mL的OPA試劑混勻靜置2 min后，在340 nm下測定吸光度。水解度計算公式為

(2)

式中h——水解過程中，每克豆乳蛋白被斷裂的肽鍵數，mmol/g

htot——大豆蛋白總肽鍵數，取7.8 mmol/g

1.3.5粒徑、電位測定

采用Mastersizer 2000型粒度儀測定豆漿的粒徑分布。將樣品稀釋到合適倍數，設置顆粒折射率為1.46，分散劑折射率為1.33，吸收參數為0.001，測定溫度為25℃，平衡時間為2 min，計算3次重復試驗得到的平均值。

1.3.6十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

根據文獻[10]的方法，使用 SDS-PAGE法分析豆乳樣品中抗原蛋白以及 ANF組分分子量的分布模式。此方法采用 5% 的濃縮膠和 12% 的分離膠，在甘氨酸電極緩沖液進行跑膠，將豆乳樣品用純水稀釋為合適倍數，并與樣品緩沖液(含 5% β-巰基乙醇)按照體積比3∶1混合并在100℃加熱約10 min，上樣量為10 μL。

1.3.7傅里葉變換紅外光譜測定

參照文獻[11]的方法，對酶解豆乳蛋白二級結構進行測定，傅里葉變換紅外光譜儀檢測參數為波數4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，波數精度0.01 cm-1，掃描次數64次。使用 Peak Fit V4.12 軟件分析二級結構的變化。

1.3.8熒光光譜測定

參考文獻[12]的方法，利用FL8500型熒光光度計測定豆乳蛋白的本征發射熒光光譜。將新制備的豆乳用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.1～7.4)稀釋至合適濃度，發射光譜儀的激發波長為290 nm，在300～400 nm掃描發射光譜，激發和發射的狹縫均為5 nm。

1.3.9抗營養因子測定

1.3.9.1脲酶活性測定

UA活性參照文獻[13]的方法：將1.0 g樣品與50 mL尿素溶液(在50 mL 0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.0)中加入1 g尿素)35℃攪拌40 min。UA 活性表示為 pH值的變化。

1.3.9.2胰蛋白酶抑制劑活性測定

根據文獻[14]對TI活性進行測定。稱取1 g豆乳于50 mL Tris 緩沖液(0.05 mol/L，pH值8.2)中，恒溫搖床(150 r/min，25℃，3 h)，7 000 r/min離心10 min，保留上清液。一個胰蛋白酶單位(1TU)被定義為10 mL反應混合物(2 mL等分試樣、2 mL胰蛋白酶溶液、5 mL BAPNA溶液和1 mL乙酸溶液)在410 nm處增加0.01個吸光度單位?？範I養因子TI活性計算公式為

(3)

式中U0——豆乳樣品中胰蛋白酶活力量

U——生豆乳中胰蛋白酶活力量

1.3.9.3脂肪氧化酶活性測定

將2 g樣品與100 mL磷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH值6.5)攪拌120 min，然后離心(10 000g，在20℃下1 h)，測定收集的上清液中的LOX活性提取物。將10 mL上清液與5.0 mL(0.2 mol/L硼酸鈉緩沖液(pH值9.0)和 0.02 mol/L亞油酸)混合。用234 nm處吸光度計算LOX活性[15]，脂肪氧化酶(LOX)活性計算公式為

(4)

式中A1——豆乳樣品在234 nm處吸光度

A2——生豆乳在234 nm處吸光度

1.3.9.4植酸測定

參照文獻[16]采用三氯化鐵比色法測定 PA 含量。以植酸鈉標準品建立 PA 標準曲線，取 1.000 g 豆乳樣品，加入 50 mL 1.2% HCl，10% Na2SO4混合溶液于離心管中攪拌均勻，靜置浸提2 h，選擇離心機7 000 r/min，離心30 min，取全部上清液在4℃保存。取3.0 mL樣品液于25 mL離心管中，7 000 r/min離心10 min，上清液即為測定液，加入1 mL 0.2% 磺基水楊酸-0.02%FeCl3作為顯色劑，渦旋混勻；不含樣品溶液，即為比色空白溶液?？瞻滓赫{零，在500 nm波長下測定吸光度。通過PA標準曲線查出PA含量。

1.3.9.5大豆凝集素測定

取10 mL豆乳樣品，置于100 mL燒杯中，加入20 mL 0.85% NaCl 溶液，混勻，放入冰箱4℃浸提48 h，期間每隔6 h搖動1次。浸提完成的樣品在10 000 r/min、4℃離心 20 min，取上清液于-10℃保存待用。按照購買的大豆凝集素 ELISA試劑盒(96孔)中的使用說明書進行實驗。

1.3.9.6ELISA法測定大豆抗原蛋白含量

取10 mL待測樣品，加入 20.0 mL、0.03 mol/L的 Tris-HCl(pH值8.0，含有 0.01 mol/L β-巰基乙醇)緩沖液中，置于恒溫搖床 28℃、180 r/min浸泡1 h，再經過7 000 r/min離心 15 min，取上清液 4.0℃ 保存備用[17]。

抗原活性檢測：按照購買的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白 ELISA試劑盒(96孔)中的使用說明書進行實驗。在酶標板中加入 50 μL 稀釋樣、50 μL 的抗體工作液，37℃ 溫育 0.5 h；棄液后加洗滌液 200 μL 洗滌 4 次；加入HPR標記二抗 100 μL，37℃ 溫育30 min；棄液洗滌 4 次，加入 100 μL 混勻的顯色液，37℃ 溫育 15 min，最后加入終止液 50 μL，輕晃混勻后，立即于酶標儀 450 nm 處讀取吸光度。根據標準曲線計算抗原蛋白含量，抗原蛋白抑制率計算公式為[17]

(5)

式中A′1——生豆乳中抗原蛋白含量

A′2——樣品中抗原蛋白含量

1.4 數據分析

所有結果取3次平均值±標準偏差(SD)。使用IBM SPSS 25軟件對數據進行統計分析，顯著性水平為P<0.05。采用 Image Lab 軟件分析SDS-PAGE圖譜，采用 Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 高壓均質輔助酶解對豆乳溶解性和水解度影響

溶解性是影響豆乳蛋白功能和結構的重要指標，由圖1a可知，高壓均質預處理過程中，豆乳的NSI 隨著均質壓力的增大呈上升趨勢，當均質壓力為100 MPa時，豆乳蛋白的NSI最高，為81.6%，這可能是均質處理可以將蛋白質的結構展開，親水基團暴露，蛋白分子表面疏水基團分子間相互作用減小，增加了豆乳蛋白的水合作用。高壓均質輔助酶解處理使豆乳的NSI進一步增加，這是因為高壓均質處理促進酶與底物蛋白質充分接觸，酶解導致豆乳蛋白肽鍵斷裂，暴露更多可電離氨基和羧基，從而提高其溶解性[18]。其中，100 MPa高壓均質預處理條件下，E1、E2和E3豆乳NSI分別為88.1%、91.9%和90.8%，表明E2對豆乳蛋白的識別度高于E1和E3，酶解效果最佳。

圖1 高壓均質輔助酶解豆乳的NSI和DH

水解度(DH)是衡量豆乳酶解程度的重要標準[19]。圖1b顯示了不同均質壓力下3種酶解豆乳的DH變化，高壓均質預處理增加了豆乳的水解度，當均質壓力增加到100 MPa時 DH 達到最大，這可能是高壓均質的機械作用使蛋白質的結構被破壞，暴露更多蛋白酶結合位點，有效提高了酶解效率。結果顯示3種酶解豆乳DH從大到小依次為 E2、E3、E1，E2 酶解豆乳的 DH 最大值為 8.24%，這可能是因為 E2 的酶活力較高，E2 的酶切位點是精氨酸、賴氨酸、甘氨酸的羧基端，與豆乳的特異性較高。當豆乳中更多的蛋白質發生降解時，ANF 組分同時也被降解，達到降低豆乳 ANF 的作用。DH 反映了酶的作用效果進而揭示了大豆 ANF 組分的變化關系[20]。

2.2 粒徑、電位分析

豆乳的粒徑分布能反映豆乳中顆粒的大小和均勻性。如圖2(圖中圖例數字零表示生豆乳，下同)所示，生豆乳的粒徑分布在460 nm左右。采用 E1、E2、E3 酶解處理后，導致豆乳粒徑增大，大顆粒體積向右偏移至600、700、620 nm左右。隨著均質壓力的增加粒徑開始減小，100 MPa 時體積分布向左移動至 300 nm 左右，達到最佳狀態，粒徑與蛋白質的溶解度和酶解程度直接相關，即當形成較小的豆乳顆粒時，蛋白質具有更好的溶解性，這種現象更有利于蛋白質的降解，從而達到較高的 DH。電位是判斷豆乳穩定性的重要指標，豆乳顆粒越小則電勢絕對值越大，粒子之間的排斥力越大，使系統越穩定。如圖2顯示，與生豆乳對比高壓均質處理和酶解豆乳均使蛋白質表面帶電荷量顯著增加，這可能由于蛋白顆粒之間產生較大的靜電斥力，導致蛋白的帶電荷量增多從而使豆乳體系更加穩定[21]。

圖2 高壓均質輔助酶解豆乳的粒徑和電位

2.3 表觀穩定性及微觀形態的分析

圖3為豆乳在高倍顯微鏡下的微觀形態圖，可以看出蛋白質顆粒直徑較大并容易聚集，分散性較差，由以上結果可知 E2 酶解豆乳的 DH 較高，因此進一步觀察不同均質壓力下 E2 酶解豆乳的微觀變化。120 MPa-未加酶豆乳與生豆乳相比，結構變得松散，但顆粒大小并未發生明顯變化，E2 水解使豆乳顆粒尺寸明顯減小，30 MPa-E2豆乳的粒徑減小，但液滴分散并不均勻；隨著均質壓力繼續增加，70 MPa-E2豆乳的分散性逐漸變好，100 MPa-E2豆乳蛋白顆粒尺寸達到最小并且液滴分散很均勻，當壓力增加至120 MPa時，蛋白顆粒出現集聚現象形成一簇條形或球形的狀態，這說明均質壓力過大使豆乳蛋白受到劇烈的碰撞剪切，誘導蛋白分子重新結合導致少量蛋白出現堆積現象。說明適當壓力處理(100 MPa)能夠促進酶解豆乳中蛋白質肽鏈的斷開，產生更多小分子多肽，從而改變豆乳蛋白的線性表位與結構特性。

圖3 豆乳顯微結構圖

圖4(圖中0～7分別表示生豆乳，水解豆乳(E1、E2、E3)，100 MPa輔助(未加酶、E1、E2、E3)水解豆乳；a～c表示100 MPa輔助(E1、E2、E3)豆乳粉)是豆乳在4℃條件下貯藏30 d的表觀圖像，可以看出生豆乳產生了比較明顯的沉淀，并伴有少量脂肪上浮的“乳析”現象產生[22]。經100 MPa均質處理豆乳則無明顯沉淀產生。E1、E2、E3酶解豆乳在儲藏30 d時間內均出現不同程度的分層現象，但明顯低于未處理豆乳。采用高壓均質100 MPa輔助 E1、E2、E3 酶解，結果顯示無明顯沉淀和分層現象，說明高壓均質輔助酶解可明顯提高豆乳體系穩定性。此外，不同蛋白酶水解使豆乳粉的色澤發生改變，可以看出 E3 豆粉顯淡黃色，顏色較 E1和 E2 豆粉略深，所有豆粉顆粒較細且品質較好。

圖4 豆乳儲存穩定性及豆粉表觀圖

2.4 高壓均質輔助蛋白酶解豆乳對大豆蛋白結構的影響

2.4.1SDS-PAGE電泳分析

豆乳中的ANF組分主要有11S、7S和SBA等。7S的抗原表位主要在α′、α和β這3個亞基上，11S的抗原表位存在于酸性亞基A和堿性亞基B兩條肽鏈上，SBA以四聚體糖蛋白的形式存在于大豆中，亞基的分子量為30 kDa[23]。由圖5(圖中M表示marker；圖5a中1～6表示0、30、70、90、100、120 MPa輔助 E1 水解；圖5b中1～7分別表示生豆乳，30、70、90、100、120 MPa輔助 E2 水解，120 MPa-未水解；圖5c中1～6分別表示生豆乳，30、70、90、100、120 MPa輔助E3水解)可知，與生豆乳相比，隨著均質壓力增大，豆乳蛋白與3種酶作用效果顯著增強，豆乳蛋白水解度提高，分解產生大量小分子量肽段或氨基酸[24]。研究表明，高壓均質輔助酶解使豆乳蛋白的7S和11S亞基去除效率較高，α′和α條帶在較低均質壓力條件則消失，表明大分子蛋白亞基條帶首先被酶解成小分子亞基，隨著均質壓力提高至100 MPa時，β、A和B亞基條帶進一步變淺或消失，表明此時豆乳蛋白被進一步分解。通過豆乳蛋白的分子量分布結果得出這3種蛋白酶對抗原蛋白的抑制作用從大到小依次為E2、E3、E1，對SBA的抑制作用從大到小依次為E2、E3、E1。相比之下E2對豆乳蛋白的特異性較高，此外，適當高壓均質壓力(100 MPa)可以促進蛋白酶的水解作用，對大豆抗營養蛋白亞基組分起到良好的降解作用。

圖5 酶解豆乳SDS-PAGE圖譜

2.4.2蛋白二級結構分析

圖6 豆乳蛋白紅外光譜圖

利用Peak Fit擬合圖譜計算，得出二級結構含量如表1所示，采用E1、E2、E3處理后α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲的含量呈減少趨勢，β-轉角含量呈增加趨勢，E3所得產物α-螺旋含量最少，E2 對 β-折疊的影響較大，可能由于E2水解作用較強能將蛋白內部的 β-折疊破壞導致減少，E1 水解使無規則卷曲含量最少；100 MPa 預處理輔助 E1、E2、E3 處理促進了二級結構的變化趨勢，這可能是由于均質處理使其疏水位點暴露，增加了酶解效果，使豆乳中高級結構解聚，肽鏈被打斷。通過對二級結構含量的分析發現蛋白酶解后的α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲結構含量降低，從而使ANF表位尤其是抗原蛋白表位被掩蓋，這與文獻[26]的結果相一致。

表1 豆乳蛋白二級結構相對含量

2.4.3熒光光譜分析

圖7為高壓均質輔助酶解豆乳的熒光光譜圖?？梢钥闯?，生豆乳的熒光強度顯示最高，3種酶水解豆乳的最大吸收峰發生紅移且熒光強度降低的現象，并隨著均質壓力增加熒光吸收繼續減少，這可能是由高壓均質處理導致豆乳蛋白分子部分解折疊造成的，使蛋白柔性增加，三級結構變得更加舒展，色氨酸殘基暴露于蛋白質分子表面，增加了酶的識別度，酶解后出現紅移現象說明蛋白質的疏水區域局部改變，發色基團(如色氨酸殘基)所處環境由非極性向極性轉化[27]，因此豆乳的極性增加從而吸收峰發生紅移同時也使豆乳的基態更加穩定。這些結果表明，高壓均質改變了豆乳蛋白的空間結構，促進了酶的水解作用，并一定程度上破壞抗原蛋白的構象表位，從而影響了ANF組分的活性，文獻[28]研究表明，植物蛋白ANF多存在于其親水區域，酶解后導致疏水區域暴露，11S、7S和SBA蛋白親水區域表位被掩蓋或破壞，從而可能達到降低豆乳ANF的效果。

圖7 高壓均質輔助酶解豆乳的熒光光譜圖

2.5 抗營養因子分析

圖8顯示，未酶解豆乳隨著均質壓力的增加 ANF 呈減少趨勢，當壓力為120 MPa 時豆乳中的11S、7S、PA、SBA、TI、LOX 的抑制率達到最大，實驗結果分別為 14.37%、24.68%、38.05%、23.13%、32.69%、23.7%。高壓均質處理使豆乳中 ANF 減少，這可能是因為高壓均質處理使豆乳蛋白分子被降解以及空間結構發生改變，從而破壞或改變了 ANF 組分的抗原表位，壓力越大就會使更多 ANF 蛋白表位被破壞。此外，PA 的失活機制還與高壓均質觸發了大豆內部植酸酶的活性有關，植酸酶可以去除豆乳中的植酸鹽成分，從而使 PA 含量降低[29]。這表明了高壓均質預處理豆乳對 ANF 具有一定的抑制作用。

圖8 高壓均質輔助酶解對抗營養因子抑制率

高壓均質輔助 E1、E2、E3 酶解處理對 ANF 的影響如圖8所示，實驗結果表明，所有酶水解對 ANF 組分均具有良好的降解效果，其抑制率隨著均質壓力(0～100 MPa)的增大呈不斷增加的趨勢，當壓力超過 100 MPa 時變化趨勢逐漸平緩甚至減少。這表明了適度的均質壓力預處理，可以使豆乳蛋白柔性增加，結構更加舒展，促進了蛋白酶對豆乳蛋白的水解作用，從而使豆乳ANF含量逐漸降低，但隨著壓力繼續增大，蛋白發生重新凝聚，反而不利于蛋白酶的作用，因此選擇最佳均質壓力為100 MPa[30]。其中熱不穩定性ANF會受溫度的影響，高壓均質過程中產生的熱量以及蛋白酶在沸水中的滅活處理，這都影響了UA、TI、SBA 和 LOX的活性。UA受熱極易失活，實驗結果也表示所有酶水解豆乳中的UA均呈陰性；酶水解對 TI、SBA 和 LOX 組分也具有顯著的抑制效果(P<0.05)，尤其是 E2 和 E3 抑制率顯著高于E1，其中100 MPa-E2對 TI、SBA 和 LOX 的抑制率可達到 83.94%、70.4% 和 80.72%。E2 和 E3 對 PA 的抑制結果相近，最大抑制率為 72.26%，E2對 11S 和 7S 的抑制率高于E1和E3，這與豆乳蛋白的DH結果一致，即DH越大，高分子量蛋白顆粒的降解效果越好，對 ANF抑制作用越強。豆乳蛋白二級結構中 α-螺旋和 β-折疊含量的減少，三級結構中疏水區域減少，以及電泳圖譜顯示 E2 水解豆乳中的 11S 和 7S 蛋白亞基條帶最淺，都表明了 E2 對 ANF 組分的抑制效果最好。ELISA 結果也驗證了 E2 對 11S 和 7S 抑制率高于E1和E3，100 MPa-E2 水解對 11S 和 7S 的抑制率為 51.28% 和 57.83%。綜上所述，高壓均質處理通過改變豆乳蛋白的結構在一定程度上抑制了豆乳蛋白的ANF活性，但并未完全消除，這歸因于物理處理只是破壞了豆乳蛋白的構象表位。此外，E2 水解豆乳中的ANF含量小于 E1 和 E3，E2 對 7S和 11S 的抑制作用較強，由此得出高壓均質 100 MPa-E2 酶解豆乳對 ANF 抑制作用達到最佳效果。

3 結束語

對高壓均質-蛋白酶解降低豆乳ANF工藝進行研究，結果表明，經100 MPa高壓均質預處理輔助E2酶解豆乳的NSI和DH最大，豆乳的粒徑均勻穩定，沉淀率變小，儲存穩定性較好，并且蛋白質顆粒呈現均勻分散狀態。同時改變了豆乳蛋白的分子量分布，7S、11S以及SBA蛋白亞基發生降解；蛋白質二級結構中含有ANF表位的α-螺旋和β-折疊結構減少；蛋白熒光吸收強度降低并呈現紅移現象，三級結構發生改變；通過測定豆乳中的脲酶呈陰性，其中100 MPa-E2所得豆乳中的ANF含量最少，因此得出E2對豆乳中ANF的抑制作用最強。