超聲聯合微泡對卡鉑化療A549肺癌細胞凋亡影響的實驗研究

李 玥 蔣 帥 楊 希 龔思銘 何 穎 曹軍英 卓忠雄

據2020年國際癌癥研究中心數據顯示，我國已成為肺癌疾病負擔最重的國家，肺癌發病率和死亡率逐年上升，分別占全球總病例的37.0%、39.8%［1］。我國肺癌臨床診療指南（2021版）［2］針對可完整切除的ⅡA～ⅡB期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，推薦以鉑類為基礎的方案進行輔助化療；針對ⅢA期可手術的NSCLC患者，推薦術后含鉑兩藥方案輔助化療；針對Ⅲ期不可切除的NSCLC患者，推薦以鉑類為主的同步化療方案或序貫化療方案（均為1類推薦證據）?？ㄣK作為肺癌化療方案一線藥物，確保其抗腫瘤療效并減少嚴重全身毒副作用一直是臨床醫學面臨的難題。微泡作為無肝、腎毒性的超聲對比增強劑，在超聲輻照下可向腫瘤遞送化學治療劑，該方法稱為聲化療［3］?；熯^程中，超聲聯合微泡（ultrasound combined with microbubbles，USMB）可以開放生物膜屏障、輔助化療藥物進入腫瘤細胞，改善藥物分布［4-5］。本實驗旨在探討USMB在卡鉑化療A549肺癌細胞凋亡中的作用。

材料與方法

一、主要實驗材料

1.細胞及試劑：A549肺癌細胞系（由陸軍軍醫大學第二附屬醫院中心實驗室提供）；胎牛血清（澳大利亞AusGeneX公司），DMEM/F12培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司），青-鏈霉素（美國GE Healthcare Life Sciences公司）、胰酶（北京索萊寶科技有限公司），卡鉑（昆明貴研藥業有限公司）。SonoVue（意大利Bracco公司，2～5×108個微泡/ml）。醫用超聲耦合劑（重慶安碧捷科技股份有限公司）。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen公司）。

2.儀器：彩色多普勒超聲診斷儀（Accusonic Plus-AP 170，澳大利亞Metron公司），901150探頭，面積5 cm2，聲 強0～3 W/cm2；流 式 細 胞 儀（Gallios，美 國Beckman Coulter公 司）；離 心 機（5702 R，德 國Eppendorf公司）。

二、主要實驗方法

1.細胞培養、傳代及分組：A549肺癌細胞采用DMEM/F12培養基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素）于37℃、5%二氧化碳孵箱中培養。待細胞貼壁生長融匯至80%～85%，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化，行1∶3傳代培養。取對數生長期細胞，于6孔板中每孔配置5×105個細胞懸液，設置6組：對照組（未經任何處理）、US組（僅使用超聲輻照）、USMB組（使用超聲輻照聯合微泡）、CBP組（僅使用卡鉑）、CBP+US組（使用超聲輻照+卡鉑）、CBP+USMB組（使用超聲輻照聯合微泡+卡鉑）；其中卡鉑均采用最適宜劑量50μg/ml［6］。超聲輻照方法：保持孔板水平，于每孔板底部涂耦合劑后進行超聲輻照，每15 s水平轉動探頭90°，避免探頭各個區域能量差異所致輻照能量不均。超聲輻照參數：聲強0.6 W/cm2，峰值負壓0.35 MPa，占空比10%，中心頻率1 MHz，脈沖重復頻率100 Hz，輻照時間1 min［6］。SonoVue微泡配制：加入5 ml注射用0.9%生理鹽水振搖并完全溶解凍干物，制成六氟化硫微泡混懸液，使用血球計數板計數，加入培養基稀釋至細胞與微泡數量比約1∶1。

2.流式細胞術檢測各組A549肺癌細胞凋亡率：各組處理后培養24 h。收集上清液中的懸浮細胞，使用PBS漂洗2次，加入胰酶（不含EDTA）消化細胞，輕柔吹打并收集細胞懸液，合并上清液與消化下的細胞懸液，離心5 min（1000 r/min），使用PBS漂洗后再次離心5 min（1000 r/min）重懸加入EP管，離心（1000 r/min，5 min）去上清液，將細胞重新懸浮在100μl結合緩沖液（約1×105個細胞），轉至5 ml試管中，加入5μl FITC標記的Annexin V、5μl PI室溫避光反應15 min，加入400μl結合緩沖液，在1 h內使用流式細胞儀檢測各組A549肺癌細胞凋亡率；應用Kaluza分析軟件（美國Beckman Coulter公司）分析其結果。其中，Annexin V（+）/PI（-）提示早期凋亡細胞；Annexin V（+）/PI（+）提示晚期凋亡細胞；總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。各組均收集3個獨立樣本，取平均值。

三、統計學處理

應用SPSS 26.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

各組A549肺癌細胞24 h凋亡率點陣圖見圖1。檢測12 000個細胞，其中右上象限示晚期凋亡細胞，右下象限示早期凋亡細胞，左下象限示正常細胞。

圖1 流式細胞術檢測各組A549肺癌細胞24 h凋亡率點陣圖

各組A549肺癌細胞凋亡率比較見表1。A549肺癌細胞總凋亡率由低到高依次為對照組、US組、USMB組、CBP組、CBP+US組、CBP+USMB組；其中CBP+USMB組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均最高，與其余各組比較差異均有統計學意義（均P＜0.01），CBP+US組與CBP組晚期凋亡率、總凋亡率比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。CBP組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率與對照組、US組、USMB組比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）。對照組、US組、USMB組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率兩兩比較差異均無統計學意義。

表1 各組A549肺癌細胞凋亡率比較（） %

表1 各組A549肺癌細胞凋亡率比較（） %

與CBP+USMB組比較，#P＜0.01；與CBP+US組比較，*P＜0.01；與CBP組比較，△P＜0.01

組別對照組US組USMB組CBP組CBP+US組CBP+USMB組早期凋亡率0.45±0.11#*△0.56±0.23#*△0.65±0.26#*△1.84±0.08#1.82±0.42#3.39±0.92*△晚期凋亡率1.34±0.49#*△1.51±0.16#*△1.94±0.21#*△2.86±0.84#*5.69±0.36#△7.99±0.54*△總凋亡率1.79±0.59#*△2.07±0.10#*△2.59±0.28#*△4.70±0.90#*7.51±0.74#△11.39±0.54*△

討 論

含鉑類化療方案是肺癌治療的常用方法，如何促進鉑類藥物于腫瘤靶區局部充分釋放、改善其在瘤區的分布、減少全身毒副作用成為當前研究熱點［7］。Shen等［8］采用USMB聯合含鉑類化療方案治療3例晚期惡性腫瘤患者，發現肝轉移瘤、腹壁轉移瘤直徑縮小，患者疼痛癥狀減輕。超聲靶向藥物遞送主要機制包括空化、聲孔效應、聲輻射力、聲流；其中超聲空化為液體介質中的氣體核（微泡）經超聲波作用后發生振蕩、生長、破裂等一系列動力學過程。當微泡在細胞附近振蕩時，對細胞產生的剪切力可誘導細胞膜瞬時穿孔，即聲孔效應，為開放生物膜屏障提供暫時、可逆的時間窗，同時刺激細胞內吞作用，促進超聲輻照區細胞的藥物分子攝取。流體介質中的聲輻射力及聲流通過產生壓力梯度，推動藥物粒子在聲波傳播方向的遞送［9-10］。各機制相互作用產生一系列化學和機械效應，促進化療藥物穿透生物膜屏障。本實驗旨在探討USMB在卡鉑化療A549肺癌細胞凋亡中的作用。

抵抗細胞死亡為癌癥的六大特征之一［11］，細胞凋亡屬于程序性細胞死亡。本實驗采用最適宜的超聲輻照參數與卡鉑劑量［6］聯合作用于A549肺癌細胞，結果顯示CBP+USMB組、CBP+US組總凋亡率與CBP組及其余各組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01），表明USMB可協同卡鉑誘導A549肺癌細胞凋亡。其可能機制有：①USMB、超聲引發一系列化學效應（如超聲、USMB與卡鉑可協同誘導A549肺癌細胞內源性鈣釋放，鈣超載為A549肺癌細胞凋亡的可能機制［12］），誘導A549肺癌細胞凋亡；②超聲空化、聲孔效應、聲輻射力、聲流等產生一系列機械效應，作用于細胞膜屏障，增加了卡鉑藥物遞送效能；③化學效應與機械效應協同誘導A549肺癌細胞凋亡。本實驗中CBP+USMB組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均最高，與其余各組比較差異均有統計學意義（均P＜0.01），原因可能為CBP+USMB組SonoVue微泡的物理特性使其成為理想空化核，降低了穩態空化的閾值。在較低聲強下，微泡發生穩態空化并形成微流，從而促進微泡及粒子位移，對相鄰細胞產生剪切力，增加細胞膜通透性，增加卡鉑藥物遞送并協同誘導A549肺癌細胞凋亡。Cao等［13］研究發現USMB組AsPC-1胰腺癌細胞凋亡率增高，與US組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而本實驗中USMB組、US組、對照組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率兩兩比較差異均無統計學意義，原因可能為該超聲輻照條件下，USMB產生的空化效應較微弱，無法直接誘導A549肺癌細胞凋亡。本實驗CBP+US組早期凋亡率與CBP組比較差異無統計學意義，但晚期凋亡率及總凋亡率比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）；而本課題組前期實驗［6］顯示兩組細胞存活率比較差異有統計學意義，表明CBP+US組可抑制A549肺癌細胞活性，但未明顯誘導細胞凋亡，未聯合微泡的CBP+US組產生的空化效應及卡鉑藥物遞送效能較CBP+USMB組低，有待進一步優化參數以調控其誘導細胞早期凋亡。

本實驗的局限性：僅使用流式細胞術檢測各組A549肺癌細胞凋亡率，實驗方法單一、數據不夠充分，今后將進一步優化超聲參數，進行體外及動物實驗，檢測腫瘤凋亡信號通路相關蛋白表達水平，探討超聲、USMB聯合化療藥物誘導腫瘤凋亡的分子機制、微泡聲學行為與促進藥物遞送之間的關系，擬實現藥物的超聲控釋與局部靶向釋放。

綜上所述，USMB在卡鉑化療A549肺癌細胞凋亡中有協同作用。