擬南芥AtIDD4基因過表達植株構建及其對生長發育的影響

于德嘉,張國斌,陳健鑫,徐曉東,李林倩,董萍萍,郭麗紅,楊紅玉

(1.昆明學院農學與生命科學學院,昆明 650214;2.西南林業大學生物多樣性保護學院,昆明 650224;3.云南農業大學植物保護學院,昆明 650201;4.曲靖師范學院生物資源與食品工程學院,云南 麒麟 655011)

【研究意義】轉錄因子(Transcription factors,TFs)又稱為反式作用因子,在植物調控生長發育和響應逆境脅迫反應中發揮著重要作用[1],為探究擬南芥IDD基因家族中AtIDD4基因在調控植物生長發育與抗逆反應應答中的作用,本研究構建了擬南芥AtIDD4基因過量表達植物?！厩叭搜芯窟M展】鋅指蛋白是重要的轉錄因子,C2H2型鋅指蛋白廣泛存在,且是鋅指蛋白中研究最廣和最清楚的一類[2]。INDETERMINATE DOMAIN(IDD)家族屬于 C2H2型鋅指蛋白轉錄因子其中一類,是植物中特有的轉錄因子,不論在單、雙子葉植物中均高度保守。植物中的IDD基因通過與多種蛋白質相互作用,與激素級聯重疊,控制或調節植物的生長發育與抗逆反應應答[3]。ID-domain基因最初是作為玉米中一個典型的開花基因INDETERMINATE1(ID1)而被報道[4]。ID1基因編碼1個包含4個鋅指單元的核蛋白,具有 C2H2型鋅指蛋白的結構特點,由靠近 N 端的一個假定的核定位信號 NSL和4個鋅指單元(C2H2、C2H2、C3H和C2HC)構成ID-domain[5-6]。在植物中通過ID1基因的ID-domain所定義的基因家族成為了 C2H2型鋅指蛋白的一個亞族,即 IDD 鋅指蛋白家族[7]。擬南芥中有16個IDD基因家族成員,為AtIDD1-16,AtIDD4基因是其中之一[8]。通過酵母雙雜交系統篩選發現能與SCL3(Scarecrow-like 3)基因互作的轉錄因子有5個IDD基因家族成員,AtIDD4基因是其中之一[9]。SCL3通過這些轉錄因子調節 DELLA 蛋白和赤霉素 (Gibberellin,GA)的信號轉導通路[10]。AtIDD4等IDDs基因通過調控不對稱細胞分裂和細胞類型的模式化以確保植物根系的正常發育[11]。研究發現,AtIDD4在絲氨酸73位點磷酸化[12],這是一個高度保守的MAPK基序,在IDD/BIRD家族的所有家族成員中都是保守的[13],AtIDD4基因的缺失突變體植株轉錄組和全序列ChIP-SEQ分析表明,AtIDD4基因缺失突變體植株在先天免疫與生長發育的協調中起著重要作用,V?lz 等[14-15]研究表明,擬南芥AtIDD4基因的缺失突變體植株顯著增強了對半活體營養型病原菌丁香假單孢菌(Pseudomonassyringae)等病原物的抗性和對鹽脅迫的抗性?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關擬南芥AtIDD4基因超表達后對植株生長發育的影響鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】利用同源重組技術,旨在構建高表達載體pCAMBLA1300-35S-IDD4CDS,并通過農桿菌侵染法導入野生型擬南芥,提高AtIDD4基因在擬南芥中的表達水平,為探究AtIDD4基因對植物的抗性調控提供供試材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生型擬南芥(WT)(Arabidopsisthaliana)為Columbia生態型(Col-0),購自美國 Lehle seeds 公司[16]。農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101 購自上海唯地生物技術有限公司,大腸桿菌(Escherichiacoli)為DH5α,購自TaKaRa公司,限制性內切酶為BamHI和PstI,購自ThermoFisher SCIENTIFIC公司。試驗中所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 擬南芥培養條件

先用無菌水將擬南芥種子充分漂洗,再用消毒水[v(75%乙醇)∶v(30%H2O2)=4∶1]消毒30 s,無菌水漂洗3次后分散播種于MS培養基中,置于4 ℃冰箱中春化處理48 h。將處理后的種子放至光照培養箱(光周期為光照和黑暗各12 h/d,光照強度2000～3000 lx,溫度 22 ℃,相對濕度40%～60%)培養[17]。待長出2片真葉后將幼苗移栽到溫室調配的基質[v(營養土)∶v(珍珠巖)∶v(蛭石)=6∶6∶1]中繼續培養。

1.3 載體構建

1.3.1 擬南芥總 RNA 和 DNA 的提取 Trizol 法提取擬南芥總RNA,之后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其結構完整性,并通過Biodrop測定其濃度和純度;將檢測合格的 RNA 樣品用液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存[18]。擬南芥總DNA采用CTAB法提取。測定樣品的濃度和純度,檢測合格的 DNA 樣品置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 反轉錄合成cDNA 提取擬南芥葉片RNA,以RNA為模板用abm公司的逆轉錄試劑盒逆轉錄cDNA。首先在冰上預冷 200 μL的微量離心管,隨后在管內依次加入AccuRT Reaction Mix 2 μL和Total RNA 1 μg,用Nuclease-free H2O補足8 μL并置于PCR 儀內,42 ℃反應2 min,后置于冰上;加入AccuRT Reaction Stopper 2 μL;在預冷的微量離心管內配置反轉錄體系10 μL,包括5×All-In-One RT MasterMix 4 μL、Nuclease-free H2O 6 μL,配制完成后加入上述已去除基因組DNA的體系中并混勻;置于PCR儀內,25 ℃反應10 min,42 ℃反應15 min,85 ℃反應5 min,于-20 ℃保存備用。

1.3.3AtIDD4基因CDS的克隆 通過TAIR (https://www.arabidopsis.org/)網查找出AtIDD4基因的CDS序列,結合載體構建原則運用軟件Premier 5設計特異性引物,IDD4-F:5’-CGGGATCCATGTCGTCATCATCATATAACACA-3’、IDD4-R:5’-TGCACTGCAGTCAACCTCTTCCAAATGGATAA-3’;下劃線部分分別為XohI和PstI酶切位點。通過PCR法利用特異性引物以cDNA為模板擴增出CDS片段,并用瓊脂糖凝膠電泳進行目的片段檢測,將正確條帶片段切膠回收。

1.3.4 目的片段與載體連接 限制性內切酶將載體pCAMLA1300酶切后得到線性化質粒,使用天根純化試劑盒進行純化后置于-20 ℃備用,將回收純化后的DNA目的片段通過酶切位點連接至帶有35S啟動子驅動的pCAMBLA1300載體上,4 ℃過夜。之后通過熱激法將載體轉化至大腸桿菌(E.coli) DH5α感受態細胞中擴增,在配制LB固體培養基時加入卡那霉素(Kanamycin),在此培養基上培養大腸桿菌感受態細胞,在平板上挑取陽性單菌落至LB/Kan+液體培養基中搖床過夜培養(250 r/min 37 ℃)對檢驗正確的單菌落擴繁,之后進行菌液PCR鑒定,1%瓊脂凝膠電泳檢測,以及質粒提取及測序,獲得高表達載體pCAMBLA1300-IDD4CDS,見圖1。將鑒定成功的陽性克隆質粒于-20 ℃保存。

圖1 pCAMBLA1300-IDD4CDS 載體圖譜Fig.1 pCAMBLA1300-IDD4CDS vector map

1.4 農桿菌轉化

將農桿菌感受態細胞 GV3101從-80 ℃冰箱取出,在冰上解凍完成后加入測序正確的重組質粒3～5 μL,冰上靜置5 min。將離心管液氮速凍1 min,37 ℃水浴5 min,冰浴2 min,將重組質粒轉化至農桿菌GV3101感受態細胞中。加入液體 LB 培養基800 μL,28 ℃ 搖床150 r/min 培養3 h,8000 r/min離心1 min,將棄上清液的懸浮液涂于含卡那霉素和利福平(Rifampicin)的LB固體培養基上28 ℃培養48 h。PCR鑒定能夠生長的單菌落,并將成功轉入高表達載體的農桿菌于含卡那霉素和利福平的LB液體培養基中搖床培養(250 r/min 28 ℃過夜)進行擴繁備用。

1.5 擬南芥轉化及篩選

為促進擬南芥側枝長出更多花枝,在移栽后25～30 d時將初次開花的擬南芥花蕾去除。選取擬南芥花序未成熟的植株,利用5%蔗糖溶液使農桿菌重懸并調整OD值為0.8,加入表面活性劑 silwet-77 至濃度為 0.05%。擬南芥花浸泡于農桿菌懸浮液中 20～30 s[19],侵染后的植株套袋橫放培養,保持環境高度濕潤的條件下避光培養 18～24 h,之后正常光照培養。待種子自然成熟后收集種子。

通過含有50 mg/L潮霉素(Hygromycin)的1/2 MS培養基篩選浸染后得到的T0代種子,能夠在抗性培養基上正常生長的為成功轉入重組質粒的種子。培養20 d后轉入土壤繼續培養,單株收種。

1.6 轉基因陽性植株的鑒定

以擬南芥野生型植株為對照,利用半定量RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR 測定擬南芥轉基因植株AtIDD4基因的表達量。分別以擬南芥野生型和擬南芥轉基因植株的cDNA為模板,擴增擬南芥內參Actin基因和擬南芥AtIDD4基因。實時熒光定量RT-PCR反應按照 Blastaq 2×qPCR MasterMix 試劑盒操作步驟要求進行,在 ABI 7500型Real-time PCR 儀上進行反應。反應條件:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,40個循環。擬南芥內參Actin基因引物:actin-F:5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’;actin-R:5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。每個樣品3次重復。

1.7 表型觀察

將篩選鑒定出的T3代種子和野生型種子在MS培養基上同時點種,并移入光照培養箱中培養,待長出2片真葉后(生長10 d)將幼苗移栽到栽培土中,移入溫室培養14 d后觀察測量幼苗的生長狀況[20],以10棵幼苗作為1組稱量鮮重并進行5次重復,同時測量根系長度后進行統計學分析。生長25 d后觀察比較轉基因植株和野生型植株的表型。

2 結果與分析

2.1 AtIDD4基因的克隆

以野生型擬南芥(WT)的cDNA為模板,利用特異性引物通過PCR法擴增擬南芥AtIDD4基因的CDS片段。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,產物片段長度約為1500 bp(圖2),與預期片段的長度一致。

2.2 載體構建及陽性克隆檢測

大腸桿菌菌液PCR產物凝膠電泳結果(圖3)顯示,1～2、4～7、9～10及12～14號單菌落PCR條帶清晰且大小約1000 bp,與預期相符,說明質粒轉化成功。挑選條帶清晰的單菌落繼續擴繁、質粒提取及測序,并進行序列比對。如圖4所示,測序序列與網站序列完全一致,證明pCAMBLA1300-35S-IDD4CDS表達載體構建成功,該基因克隆成功。

2.3 農桿菌陽性克隆

上述測試正確的重組質粒轉化至農桿菌GV3101感受態細胞中,驗證正確的農桿菌擴繁后取菌液進行PCR擴增,擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果顯示與預期相符,得到成功轉化的農桿菌。

2.4 擬南芥轉化植株篩選與鑒定

利用農桿菌侵花法,將驗證正確的含有目的片段的質粒轉化到擬南芥野生型(WT)植株中,在含有潮霉素(Hygromycin, Hyg)的 MS 培養基上將收取的T0代種子點種進行潮霉素抗性篩選,在培養約2周后,挑選能夠在潮霉素板上正常生長的陽性植株。轉基因成功的幼苗可以在抗性培養基上正常生長,而非轉基因植株生長被嚴重抑制,一般在萌發10 d后死亡。將陽性植株移至營養土中繼續培養,成熟后收取T1代種子,將T1代種子再次播種于潮霉素板中,待植株稍長大后進行PCR鑒定,陽性植株移栽至營養土中單株收取T2代種子(圖5)。

M: DNA標記; 1: AtIDD4 CDS。M:DNA Marker; 1:AtIDD4 CDS.

M: DNA標記;1～14: pCAMBLA1300-35S-IDD4CDS。M: DNA Marker;1-14: pCAMBLA1300-35S-IDD4CDS.

pCAMBIA-1300-35S: AtIDD4陽性克隆測序序列; Sbjct: AtIDD4的CDS序列。The sequence of positive clon pCAMBIA-1300-35S: AtIDD4; Sbjct: The sequence of AtIDD4 CDS.

2.5 轉基因植株中 AtIDD4 基因的表達量檢測

以擬南芥野生型(WT)植株為對照,用半定量RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR的方法檢測T3代轉基因植株中擬南芥AtIDD4基因的表達量,內參基因選取擬南芥Actin基因。相較擬南芥野生型植株轉基因植株2個株系AtIDD4基因的表達量顯著提高,熒光定量RT-PCR顯示轉基因植株中AtIDD4基因的表達量約為擬南芥野生型植株的2倍,與半定量RT-PCR的結果相符。說明得到了擬南芥AtIDD4高表達的轉基因植株,并將這些植株命名為AtIDD4-OE(Over-expression)(圖6)。

箭頭: 平板上長出的幼苗為轉基因成功的植株。Arrow: Seedlings grown on the plate are transgenic plants.

2.6 轉基因植株表型觀察

為研究擬南芥AtIDD4基因過表達植株生長狀況,觀察統計了在 MS 培養基中垂直培養 14 d 的擬南芥AtIDD4基因過表達植株與擬南芥野生型(WT)植株幼苗的生長情況。發現兩者平均根系長度分別為3和5 cm,擬南芥AtIDD4基因過表達植株根系長度明顯短于擬南芥野生型(WT)植株。而兩者的平均幼苗鮮重分別為0.15 和0.29 g,擬南芥AtIDD4基因過表達植株幼苗鮮重顯著低于擬南芥野生型(WT)植株鮮重(圖7)。通過觀察在土壤中生長14 d的幼苗生長情況,從圖8可見,擬南芥AtIDD4基因過表達植株較野生型(WT)植株整體生長狀態較弱、幼苗矮小、蓮座葉面積較小。

A:半定量RT-PCR;B:熒光定量RT-PCR;WT: 野生型; IDD4-OE-1、IDD4-OE-2、IDD4-OE-3、IDD4-OE-4代表各株系;*表示 P<0.05。A: Semi-quantitative RT-PCR; B: Fluorescence quantitative RT-PCR;WT: Wild type;IDD4-OE-1,IDD4-OE-2,IDD4-OE-3 and IDD4-OE-4 represent each strain;*means P<0.05.

A:IDD4-OE和WT; B:過表達植株與野生型植株幼苗根系長度的統計學分析;C:過表達植株與野生型植株幼苗鮮重的統計學分析;****表示 P<0.05;標尺: 1 cm。A: IDD4 overexpression and wild type; B: Statistical analysis of root length in seedling of overexpressed and wild-type plants; C: Statistical analysis of fresh weight in seedling of overexpressed and wild-type plants;****means P<0.05; Ruler: 1 cm.

A:WT;B:IDD4-OE。

3 討 論

隨著反向遺傳學研究的深入,應用不同方法使基因超量表達或將基因表達量降低或敲除使基因不表達來觀察表型的變化已成為研究基因功能的一種重要手段[20]。過量表達植株的鑒定主要利用cDNA為模板進行qPCR擴增,因其程序繁瑣和操作具有一定難度,在大量篩選中不具有快速檢測的優勢[21]。鑒于“三引物”法在T-DNA插入突變體的純合性及插入位點鑒定中的重要作用[22-23],可將其用于過表達植株的鑒定,基于重組質粒的結構設計3個引物并兩兩配對過表達植株進行鑒定,第1對引物為35S啟動子左邊界與AtIDD4基因右邊界進行配對,第2對引物為AtIDD4基因左右邊界配對,進行快速鑒定。需要注意的是,在利用“三引物法”快速鑒定過表達植株時,回復突變和基因修復往往容易被忽略。

IDD家族是高等植物中高度保守的一類轉錄因子,IDD家族中的大多數成員已被廣泛證實能調控GA和IAA等植物激素的合成與轉導,共同調控植物的生長與形態建成[24]。Cui 等[25]研究了擬南芥AtIDD14、AtIDD15和AtIDD16基因協同調控生長素的生物合成和運輸,通過直接靶向作用于YUC5、TAA1和PIN1基因調節生長素的空間積累從而促進生長素的生物合成和轉運,進而控制植物器官形態發生和向地力反應,因此推斷AtIDD4基因過表達后將通過復雜的調控網絡調控植物生長激素種類和含量進而影響植株的正常生長發育。本研究構建的AtIDD4基因過表達植株,通過生長表型觀察,發現擬南芥AtIDD4基因過量表達后,擬南芥幼苗根系長度顯著降低,且生長勢顯著低于野生型植株,揭示了AtIDD4基因在擬南芥生長發育方面發揮負調控作用。既往研究證實,IDD4受KAN和REV的轉錄抑制[3],本研究中AtIDD4基因過表達株系在葉片形成和葉片大小方面受到損害,與HD-ZIPIII基因被抑制產生的形態相似[25],AtIDD4基因可能參與了上述3個因子的負反饋調節網絡。近年來,植物激素在植物免疫中的重要作用被大量研究所證實,擬南芥IDD家族成員2、3、4、5、9和10作為轉錄支架,使DELLA/RGA反式激活,調節GA信號轉導途徑[3]。GA、SA和JA互作網絡共同調控和平衡植物的生長與免疫進程,AtIDD4基因是否參與植物信號激素轉導是今后研究的重要切入點。因此,本研究構建的AtIDD4基因過表達植株為后續探究AtIDD4基因協調植物防御等其他生物學功能提供了重要的材料。

4 結 論

本研究構建了擬南芥AtIDD4基因過量表達植物AtIDD4-OE,植株中AtIDD4基因的表達量顯著提高。表型觀察結果表明,AtIDD4-OE幼苗根長和幼苗鮮重等指標顯著低于擬南芥野生型(WT)植株;土壤中生長14 d的擬南芥AtIDD4基因過表達植株與擬南芥野生型(WT)植株比較,植株矮小,蓮座葉面積較小,表明擬南芥AtIDD4基因過量表達會抑制擬南芥的生長,其在擬南芥生長發育過程中以負調控因子發揮作用。