基于UPLC-HESI-MS/MS法的韭菜坪2號煙葉代謝特征分析

申樹林,劉 濤,鄒 焱,顧懷康,何 軼,尹能文,孫夫軍,曹廷茂,喻奇偉,陳秀娥,李 成,李彩斌,曲存民

(1. 西南大學農學與生物科技學院,重慶 400716;2. 西南大學現代農業科學研究院,重慶 400716;3. 貴州省煙草公司畢節市公司,貴州 畢節 551700;4. 貴州省煙草科學研究院,貴陽 550000;5. 湖南中煙工業有限責任公司,長沙 410019)

【研究意義】畢節地區具有悠久的烤煙種植歷史,是貴州省重要的烤煙種植區。長期以來該地區的烤煙品種多為國內外引進,但由于畢節各地的生態環境差異大,外來引進品種K326、云煙85、云煙87等不能完全適應該地的生態條件,無法形成其煙葉質量的風格特色,導致煙葉生產經濟效益低[1]。為提高畢節地區煙葉生產效益,畢節市煙草公司選育了適宜當地的烤煙新品種韭菜坪2號[2]。后續研究表明,與對照材料(紅花大金元)相比,韭菜坪2號具有較強的區域適應性[3]。在適宜種植區(如赫章縣等),韭菜坪2號比對照材料(K326)具有更高的產量和品質[3-4]。產量方面,韭菜坪2號比對照K326增產100 kg/hm2以上[4]。品質方面,韭菜坪2號煙葉中的糖含量、糖堿比、棕色化反應產物含量較高,雜色煙較少,成熟度較好,香氣值較高,相同等級煙葉的總糖、還原糖、淀粉含量高于對照[3-4]。上述研究表明韭菜坪2號是適宜畢節地區的優異品種,然而其在畢節特別是赫章等地的煙葉香型風格特征形成機理尚不清楚。因此對韭菜坪2號進行代謝組分析,有助于全面了解韭菜坪2號煙葉風味形成的代謝基礎,為后續解析其煙葉香型風格特征形成機理奠定基礎,也為烤煙品種韭菜坪2號在赫章的穩定發展及其他區域的推廣應用提供理論依據,同時對高海拔煙區品種結構優化具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】煙葉代謝物是形成煙葉香型風格特征的物質基礎,目前認為煙草香氣主要受多酚類化合物、萜類化合物和生物堿類化合物的影響[5]。例如,煙葉多酚的組成及含量與煙葉風味緊密相關[6-7];具有合適煙堿含量的煙葉能提供好的香氣[8]。多項研究表明煙草多酚、煙堿等代謝物積累水平受土壤、海拔、溫度、降雨量等環境因素的影響[9-12]。近年來,隨著代謝組技術的成熟,其被廣泛應用在煙草研究中[13],如Li等[14]運用代謝組技術發現烤煙葉莖的存在對煙葉中的代謝物質具有顯著影響;Zhao等[15]運用代謝組技術發現煙葉打頂后延遲了葉片衰老,促進了煙葉次生代謝物的積累。前人研究表明,相較于傳統的化合物檢測方法,代謝組可以高通量、更全面地對樣本進行代謝物的檢測,有助于系統了解煙草代謝變化?！颈狙芯壳腥朦c】前人主要通過農藝性狀調查、煙葉品質鑒定對韭菜坪2號在畢節地區的適應性進行了分析,但還缺乏其具體適應機制的相關研究。因此,本研究采用液相色譜-質譜聯用技術對韭菜坪2號進行代謝組分析,進一步明確韭菜坪2號煙葉的代謝特征?！緮M解決的關鍵問題】通過與對照材料云煙87進行比較,鑒定韭菜坪2號煙葉中的特征代謝物,為從代謝組水平挖掘其適應性機制及煙葉風格形成特征提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云煙87和韭菜坪2號于2021年種植在赫章縣達依(簡稱DY,海拔1862.77 m,104°42′8″ E,27°10′44″ N)、可樂(簡稱KL,海拔1925.26 m,104°24′56″ E, 27°11′26″ N)、鐵匠(簡稱TJ,海拔2022.38 m,104°22′10″ E,27°3′15″ N)等3個鄉鎮,按常規方法進行種植管理。在煙葉打頂后10 d對韭菜坪2號和云煙87的健康植株進行取樣,每個材料選取3株長勢一致的植株,每株取1片中部煙葉(約倒7～8片葉)混合,依次命名為:JCP_TJ、JCP_KL、JCP_DY、YY_TJ、YY_KL、YY_DY。將煙葉樣品放入凍存管中并立即用液氮保存,隨后轉入-80 ℃超低溫冰箱保存用于后續代謝組分析,每組3個生物學重復。

1.2 煙葉代謝物提取

參照Qu等[16]方法,略有改動:將凍存新鮮煙葉研磨成粉末狀,稱取50 mg粉末,加入1 mL 80%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)。采用超聲儀(KQ-100E,昆山,中國)4 ℃超聲提取1 h,期間渦旋3次。10 000 r/min離心10 min,吸取上清液,經0.22 μm尼龍微孔過濾樣本后,保存于上樣瓶中,進行UPLC-HESI-MS/MS分析。

1.3 LC-MS/MS條件

參照Qu等[16]方法,略有改動:液相色譜分析使用Dionex UltiMateTM3000 UHPLC system(Thermo Fisher Scientific,USA);ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard預柱(孔徑:1.7 μm,2.1×5 mm,Waters,Ireland);Acquity UPLCBEH C18色譜柱(孔徑:1.7 μm,2.1×150.0 mm,Waters,Ireland)。流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈水溶液(B)。流速為0.3 mL/min,柱溫40 ℃,流動相梯度為0～2 min,5%～10% B;2～10 min,10%～25% B;10～15 min,25%～50% B;15～20 min,50%～95% B;20～23 min,95% B;23.0～23.5 min,95%～5% B;23.5～28.0 min,5% B。流速為0.300 mL/min,進樣量為10 μL。

質譜分析系統為Thermo ScientificTMQ-ExactiveTM,具體參數為:負離子模式,加熱電噴霧電離源(HESI),離子源電壓為3.5 kV,毛細管溫度為350 ℃,掃描范圍為100～1200 m/z。氣流參數設置:鞘氣(sheath gas)35;輔助氣(auxiliary gas)10;反吹氣(sweep gas)0。

1.4 數據分析

使用MS-DIAL v4.60對原始離子峰進行提取,同時刪除非特異離子峰[17];使用MetaboAnalyst5.0對離子峰進行PCA、差異倍數和t檢驗分析[18];代謝物鑒定二級質譜數據采用MS-DIAL軟件整合的公共數據庫,其包含Mass Bank、GNPS等多個質譜數據庫(http://prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html#MSP)。

2 結果與分析

2.1 韭菜坪2號代謝譜分析

利用MS-DIAL v4.60對原始離子峰進行提取,共鑒定到1880個離子峰。所有樣本PCA分析結果顯示,QC樣本聚合緊密,說明LC-MS/MS穩定性較好,獲得的數據結果可靠,可用于后續分析。主成分分析結果顯示,韭菜坪2號和云煙87在第一主成分水平上顯著區分(圖1),同時達依、可樂、鐵匠3個取樣點的樣本在第二主成分上也呈現分離。結果表明,韭菜坪2號和云煙87品種煙葉代謝組分具有顯著差異,且同一品種的代謝組分受環境條件影響明顯。

圖1 韭菜坪2號和云煙87的代謝物主成分分析Fig.1 PCA analysis of metabolites between Jiucaiping 2 and Yunyan 87

此外,達依和可樂取樣點的樣本距離較近且遠離鐵匠取樣點,表明達依和可樂的煙葉生長環境相似,但均與鐵匠的生長環境有著較大差異。

2.2 差異代謝物的篩選與鑒定

為篩選出品種之間的差異代謝物,本研究結合差異倍數和t檢驗兩種方法,分別對達依、可樂和鐵匠3個點的樣品代謝離子峰進行了差異分析。結果顯示,韭菜坪2號與云煙87在達依、可樂、鐵匠3個取樣點分別有397(200個下調,197個上調)、318(166個下調,152個上調)、259個(123個下調,136個上調)差異離子峰(圖2-A～2-C)。為排除環境因素的影響,本研究對3個試驗點樣品中共有差異離子峰進行統計:其中有46個離子峰的豐度在3個試驗點的韭菜坪2號中都顯著高于對照云煙87,而有49個離子峰的豐度在3個試驗點的韭菜坪2號中都顯著低于對照云煙87(圖2-D、2-E)。在3個試驗點中達依取樣點的差異離子數量遠多于鐵匠、可樂取樣點。

進一步對3個取樣點的共有差異離子進行二級質譜鑒定,在共有上調離子峰與共有下調離子峰中各鑒定到3種代謝物(圖3、表1)。其中,在韭菜坪2號中上調積累的化合物M_9637被鑒定為木犀草素7-(6’-丙二酰糖苷)。該化合物為黃酮類化合物,可能參與了韭菜坪2號煙葉獨特風味的形成。同時表明韭菜坪2號煙葉中類黃酮代謝水平可能高于云煙87。

2.3 多酚類代謝物的廣泛靶向檢測分析

多酚類物質對煙葉制品味道和顏色都有積極的影響,是煙葉中重要的次生代謝產物。本研究使用Qu等[16]構建的代謝數據庫對樣本中的酚酸和類黃酮代謝物進行了定量分析。共檢測到37種多酚類代謝物,其含量如圖4所示。異屬李素、槲皮素在3個取樣點的韭菜坪2號中均出現上調積累,其他代謝物在云煙87和韭菜坪2號之間不存在積累差異。異屬李素、槲皮素與非靶向分析鑒定的差異上調代謝物木犀草素7-(6’-丙二酰糖苷)均屬于黃酮代謝物。上述結果表明,韭菜坪2號煙葉的黃酮代謝水平高于云煙87。

A、B、C分別為達依、可樂、鐵匠3個試驗點的差異離子火山圖,上調表示該代謝物在韭菜坪2號中積累量高;D為韭菜坪2號在3個試驗點的上調積累差異離子韋恩圖;E為韭菜坪2號在3個試驗點的下調積累差異離子韋恩圖。A, B and C are the differential ion volcano maps of three experimental sites, DY,KL and TJ, respectively; Upregulation indicates a high accumulation of this metabolite in Jiucaiping 2; D is the venn diagram of the differential metabolites of up-regulated accumulation in Jiucaiping 2 at three experimental sites; E is the venn diagram of the differential metabolites of down-regulated accumulation in Jiucaiping 2 at three experimental sites.

差異上調離子(A～D)與差異下調離子(E～G)二級質譜比對圖,紅色為數據庫參考離子特征峰,黑色為樣品中離子特征峰。Secondary mass spectrometry comparison diagram of differentially up-regulated peaks (A-D) and of differentially down-regulated peaks (E-G). Red means the secondary mass spectrum information from database, and black means the secondary mass spectrum information from sample.

表1 差異代謝物信息

圖4 37種多酚物質含量熱圖Fig.4 Heatmap of thirty-seven phenolic compounds contents

2.4 尼古丁和降煙堿含量比較

尼古丁是煙草中決定刺激氣味的重要次生代謝物。本研究后續鑒定到尼古丁合成途徑的2種下游產物尼古丁和降煙堿,并對其相對離子峰強度進行提取(圖5)。在鐵匠試驗點,韭菜坪2號的尼古丁、降煙堿平均離子強度低于云煙87;在可樂試驗點,韭菜坪2號的尼古丁、降煙堿平均離子強度均顯著低于云煙87;在達依試驗點,韭菜坪2號只有降煙堿平均離子強度低于云煙87。結果表明,韭菜坪2號煙葉的尼古丁積累水平在其中2個試驗點(鐵匠、可樂試驗點)低于云煙87,而降煙堿的積累水平在3個試驗點下均低于云煙87,表現出比較穩定的特征。

3 討 論

作物具有豐富的次生代謝產物,這些代謝物廣泛參與作物的生命活動,其積累量與環境條件緊密相關。在水稻[19]、蘋果[20]等作物中的代謝研究表明,作物馴化過程中會改變其體內代謝物質的積累以適應環境變化,這使得同一作物不同品種對環境的適應性具有差異。本研究中,PCA分析結果顯示煙葉代謝物的積累與品種和環境均有密切的關系,特別是韭菜坪2號與云煙87在3個煙葉產區的代謝差異體現了品種對環境的適應性具有差異。在達依產區,2個試驗烤煙品種具有最大的代謝差異,因此達依地區可能更能彰顯韭菜坪2號的優異特征。

多酚是煙葉中重要的一類次生代謝產物,具有抗非生物脅迫的作用,也是煙葉中重要的香氣前體物質,如苯丙氨酸衍生物綠原酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、山奈酚-3-O-葡萄糖苷等[21-24]。Xu等[25]研究發現煙草通過提高類黃酮物質(槲皮素和山奈酚)的積累來響應冷脅迫。本研究發現,不同環境中木犀草素7-(6’-丙二酰糖苷)、異鼠李素和槲皮素3種類黃酮物質均在韭菜坪2號中上調積累。這表明韭菜坪2號為適應赫章地區的環境條件,其類黃酮合成途徑比云煙87更為活躍。此外,據前人報道,在卷煙中適量添加蒲公英類黃酮提取液可以使煙氣增香和增甜,其中木犀草素在類黃酮提取液中占有較高含量[26],因此木犀草素7-(6’-丙二酰糖苷)高積累的同時可能也改變了韭菜坪2號的煙葉香型風格。尼古丁是煙葉中主要的生物堿,占煙葉總生物堿的90%～95%[27]。同時尼古丁也是煙葉刺激氣味的主要因素,尼古丁含量高的煙葉一般為濃香型,含量低的一般為清香型[28-29]。清香型煙葉中過高的尼古丁含量會降低吸評質量[30]。本研究中韭菜坪2號的尼古丁、降煙堿含量低于同為清香型的云煙87。同時云煙87中尼古丁、降煙堿含量在3個取樣點之間無明顯差異,而韭菜坪2號表現出達依>鐵匠>可樂的趨勢,充分體現了韭菜坪2號在赫章地區的區域適應性?？偟膩碚f,通過代謝分析推測,韭菜坪2號通過類黃酮物質的高積累來適應畢節各地的環境;同時,類黃酮物質高積累與煙堿物質的低積累共同形成了韭菜坪2號的煙葉風味特色。

A、B為尼古丁、降煙堿二級質譜比對圖,紅色為數據庫參考離子特征峰,黑色為樣品中離子特征峰;C、D為各試驗點煙葉中尼古丁、降煙堿離子峰面積。Secondary mass spectrometry comparison diagram of nicotine (A) and nornicotine (B). Red means the secondary mass spectrum information from database, and black means the secondary mass spectrum information from sample. The peak areas of nicotine (C) and nornicotine (D) in tobacco leaves of each test site.

4 結 論

韭菜坪2號類黃酮化合物的高積累可能是其適應赫章地區環境的結果,同時高含量的黃酮糖苷衍生物和更低含量的尼古丁類物質可能是其特殊風味形成的主要原因。