侵染貴州煙草的辣椒脈斑駁病毒鑒定及其基因組分子特征分析

冷東蔚,韋學鋒,張洪保,馬志鋒,蔣 衛,吳慧子,田維強,蔡 璘

(1.貴州大學煙草學院/貴州省煙草品質研究重點實驗室,貴陽 550025;2.貴州省煙草公司遵義市公司,貴州 遵義 563000)

【研究意義】煙草(NicotianatabacumL.)是茄科煙草屬植物,是一種重要的葉用經濟作物[1-2]。貴州省作為我國第二大煙草產區,常年植煙面積在1.33×105hm2以上,烤煙種植是帶動貴州省鄉村振興的重要產業。目前已知侵染煙草的病原物至少109種,每年給我國煙草造成的產值損失達7×108元以上[3-5]。我國在煙草上已發現17種病毒,常見的病毒有煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、馬鈴薯 Y病毒(Potato virus Y,PVY)、煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)和煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)等[6]。煙草病毒病發生廣泛,危害嚴重,使煙草產量降低30%～50%,嚴重時甚至造成絕產,已成為制約各煙區發展的主要因素[7-8]。因此,明確貴州煙草病毒病發生現狀及變化趨勢對貴州烤煙生產可持續發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是一種正義單鏈RNA病毒,屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。1979年Ong等[9]在馬來半島首次發現ChiVMV危害辣椒;隨后在亞洲及非洲等多個茄科作物上檢測到該病毒[10-15],表明其在亞洲和非洲廣泛分布。相關研究表明,ChiVMV主要通過蚜蟲和機械摩擦傳播,茄科作物(如辣椒、番茄、茄子、煙草和曼陀羅等)是ChiVMV的主要寄主,此外,ChiVMV還會侵染醉魚草、滇重樓和部分藜屬植物[16-18]。2003年譚根堂等[19]首次在我國陜西省的辣椒上檢測到該病毒,此后在我國西南地區和沿海地區的茄科作物上也陸續發現其危害[20-28],表明其在我國已大面積發生且危害日趨嚴重。2017年王莉爽等[27]首次在貴州辣椒上發現ChiVMV危害,辣椒受害后葉脈呈暗綠條紋、葉沿皺縮、葉片變小和畸形,導致產量和品質嚴重下降,造成嚴重經濟損失。2021年Chen等[28]首次報道ChiVMV在貴州煙草上危害,引起葉片呈圓形褪綠、枯斑和煙草系統性壞死等癥狀,很大程度上降低煙葉可用性。近年來,對ChiVMV的研究報道越來越多,主要集中在對ChiVMV的株系分化、遺傳多樣性和分子進化特征等方面。賈樹丹等[21]研究表明,我國ChiVMV的株系分化存在較強的地域性,地理位置接近的廣東和海南ChiVMV分離株之間的變異較小,而地理位置相隔較遠的四川和海南ChiVMV分離株之間的親緣關系較遠;王莉爽等[27]對比分析發現,貴州ChiVMV辣椒分離株的CP序列與四川ChiVMV辣椒分離株之間同源性為99%,與云南ChiVMV株系之間也有很近的親緣關系。Anindya等[29]2004年首次報道ChiVMV全基因組序列。ChiVMV是馬鈴薯Y病毒屬家族成員,具有馬鈴薯Y病毒屬基因組結構的典型特征,基因組全長約9.7 kb,其中5′-非編碼(5′-UTR)包含163堿基,3′-非編碼區(3′-UTR)包含281個堿基,5′末端結合1個基因組連接蛋白(Viral genome-linked protein,VPg),3′末端具有Poly(A)尾,編碼的通讀蛋白被切割成11個蛋白,其中CP、HC-Pro和VPg病毒蛋白在病毒粒子和核酸的組裝、傳播和病毒侵染過程中具有重要作用[30-31]?！颈狙芯壳腥朦c】ChiVMV在煙草上的危害日趨嚴重但相關研究鮮見報道,僅有四川、云南和貴州在煙草上檢測到ChiVMV[16,28,32],且對于其株系分化和遺傳多樣性等研究多是基于該病毒的部分CP基因和3′-UTR序列,鮮有對ChiVMV全基因組進行分析比較。貴州各煙區病毒病發生嚴重,但對貴州各煙區病毒病發生以及變化趨勢的系統研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】針對貴州省疑似病毒侵染的煙草進行TMV、PVY、CMV和ChiVMV等病毒檢測,以掌握ChiVMV和主要病毒病在貴州煙草上的發生情況;在此基礎上采用RT-PCR分段擴增法明確貴州煙草分離株ChiVMV-GZ(GenBank:OP589298)的基因組特點,通過序列一致性分析以及構建系統發育進化樹明確貴州煙草ChiVMV分離株與我國其他省份不同ChiVMV株系之間的遺傳進化關系,以期為貴州煙草病毒病防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2022年6月采自貴州省貴陽、遵義、安順和銅仁等地煙區,煙葉表現不規則褪綠和枯斑的疑似病毒侵染癥狀,共80份。

1.1.2 試劑 TRizol(北京寶日醫生物技術有限公司),反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),大腸桿菌感受態細胞DH5α(上海唯地生物技術有限公司),pTOPO-Vector載體、2×PCR Mix(北京市艾德萊生物科技有限公司),DNA凝膠回收試劑盒(北京擎科生物科技有限公司);所用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成;無水乙醇、異丙醇和三氯甲烷等均為分析純(天津富宇生化有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及逆轉錄 采用TRizol法提取RNA,并參考反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明合成cDNA,反轉錄體系:2×NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 10 μL,Total RNA 2 μL,加入無酶水補足至20 μL。反轉錄程序:50 ℃ 30 min,85 ℃ 2 min。產物cDNA保存于-20 ℃待用。

1.2.2 病毒的檢測 根據NCBI已公布TMV、PVY、CMV、ChiVMV、TEV和PVX的CP基因序列設計引物,包括ChiVMV-CP-F(GCAGGAGAGAGTGTTGATGC)、ChiVMV-CP-R(CAATCCTCGAACGCCCAG CA)、TMV-CP-F(ATGTCTTACAGTATCACTACTCC)、TMV-CP-R(TCAAGTTGCAGGACCAGAG)、CMV-CP-F(GATAAGAAGCTTGTTTCGCG)、CMV-CP-R(GCTC GATGTCGACATGAAGT)、PVY-CP-F(GCAAATGACACAATTGATGCAG)、PVY-CP-R(TCACAGGTTCT TGACTCCAAG)、TEV-F(TGATGGATGGTGAGGAG)、TEV-R(GTGCCGTTCAGTGTCTT)、PVX-CP-F(ATGTCAGCACCAGCTAGCAC)和PVX-CP-R(TTATGGTGGTGGGAGAGTGAC)。采用RT-PCR對樣品進行病毒檢測,PCR反應體系:2×PCR Mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL,雙重蒸餾水補足至25 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共34個循環;72 ℃再延伸10 min。產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.3 ChiVMV基因組擴增 根據1.2.2擴增出的ChiVMV的CP序列以及NCBI已發表基因序列(MK405594.1)設計6對特異引物,包括ChiVMV-P1-F(AATACAAACATACAGAAAACGAAC)、ChiVM V-P1-R(CCAATGGCCAACTTGCGAGTC),ChiVMV-P2-F(GGTTACCATGCAAAGAGGTTC)、ChiVMV-P2-R(GTGGAATAATGTGATGCTTCTC),ChiVMV-P3-F(GGTTGGAAAGATTGCACTTCAG)、ChiVMV-P3-R(GAGTGCAATCAACTATGGAGAG),ChiVMV-P4-F(CTTGACATTGAGGCTGTGGTTG)、ChiVMV-P4-R(GACTTTAAGTACGGGGGAAACC),ChiVMV-P5-F(GTACAGTAACCCTGGAATTC)、ChiVMV-P5-R(CAATCGGCGTAGTGAATACCGC),ChiVMV-P6-F(TACTGCTGATGGAACAATAGTC)、ChiVMV-P6-R(AACGCCAACTATTGAACAACTC);引物所在基因組的位置如圖1所示。PCR擴增反應體系延伸時間為3 min,其他程序與1.2.2一致。參考DNA回收試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)操作說明回收目的條帶,將產物連接到pTOPO-Vector載體,轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞,于37 ℃條件下培養16 h后篩選陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司測序。

圖1 設計的6對引物所在基因組(MK405594.1)位置Fig.1 The location of designed 6 pairs of primers in the genome (MK405594.1)

1.2.4 病毒序列分析 使用Vector NTI Advance 11.5.1軟件拼接ChiVMV基因組,NCBI數據庫ORF finder程序確定其開放閱讀框。為進一步分析貴州ChiVMV-GZ分離株在遺傳上的進化關系,基于NCBI公布的ChiVMV基因組序列,以同屬的辣椒葉脈斑駁病毒(PVMV,DQ645484)和辣椒斑駁病毒(PepMoV,EU586121)作為外源病毒使用軟件MEGA 7.0以鄰近法構建系統發育樹,用SDT 7.1分析序列的一致性。

2 結果與分析

2.1 發病煙葉的癥狀及RT-PCR擴增產物

使用6種病毒特異引物對樣品進行檢測,共檢出4種病毒:ChiVMV、TMV、PVY和CMV,但未檢出TEV和PVX病毒(圖2)。從表1可知,除銅仁煙區采集的煙葉樣品未檢出CMV外,貴陽、遵義和安順煙區樣品均檢出ChiVMV、TMV、PVY和CMV 4種病毒,其中,TMV占比最高(48.75%),其次是ChiV MV(37.50%)和PVY(35.00%),CMV占比最低(8.75%)。PVY、TMV和CMV病毒以復合侵染為主,有少數樣品檢出PVY單獨侵染,由PVY單獨侵染的煙葉主要表現葉片黃化、卷曲和葉脈呈黑褐色等癥狀;ChiVMV侵染煙葉以單獨侵染為主,ChiVMV單獨侵染的煙葉會在葉脈之間形成黃色亮斑,少數樣品檢出ChiVMV與PVY或TMV間存在復合侵染現象。從表2看出,病毒之間復合侵染煙草的現象較普遍,從樣品中共檢出TMV+PVY、PVY+ChiVMV、PVY+CMV和ChiVMV+PVY+TMV 4種復合侵染類型,其中,4個地區均檢出復合侵染類型TMV+PVY和PVY+CMV,占比分別為26.25%和10.00%;貴陽的1個樣品、安順的1個樣品和遵義的3個樣品檢出PVY+ChiVMV侵染類型,總占比6.25%;遵義的2個樣品和安順的1個樣品檢出ChiVMV+PVY+TMV侵染類型,總占比3.75%?？傮w看,TMV+PVY侵染類型最為普遍,且不同病毒復合侵染引起的癥狀復雜,PVY+ChiVMV侵染煙葉除葉脈間出現圓形黃色斑點外,沿葉脈還會表現褪綠黃化以及壞死等癥狀;PVY+TMV侵染煙葉癥狀主要表現為黃化、細長畸形且厚薄不均;PVY+CMV侵染引起壞死癥狀,沿葉脈還會出現閃電狀壞死;受PVY+TMV+ChiVMV 侵染煙葉表現出褪綠黃化、圓形亮斑、葉片細長和葉脈壞死等癥狀(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker;1～22.煙草樣本;A.CMV;B.ChiVMV;C.TMV;D.PVY。M.DL2000 DNA Marker;1-22.Tobacco samples;A.CMV;B.ChiVMV;C.TMV;D.PVY.

2.2 貴州ChiVMV間的差異性及基因組全長

貴州貴陽、遵義、銅仁和安順4個煙草產區的樣本均檢出ChiVMV,經序列比對及基于CP序列構建系統發育樹(圖4)發現,4個地區的ChiVMV無明顯的遺傳分化。因此,后續研究隨機挑選貴州遵義分離所得的一段ChiVMV的CP序列進行全長擴增。從圖5看出,6對引物分別擴增獲得符合預期的片段,使用NTI Advance 11.5.1進行拼接獲得ChiV MV全長序列,全長為9736 nt,其中,5′UTR 179 nt,3′UTR 287 nt,編碼3089 aa的通讀蛋白。將獲得的序列上傳至NCBI,命名為ChiVMV-GZ,獲得GenBank登錄號OP589298。

2.3 ChiVMV-GZ的進化關系

從圖6看出,貴州煙草分離株ChiVMV-GZ與四川番茄分離株(KC711055)的序列一致性最高,為98.70%,其次與四川瀘州煙草分離株(MK405594)也具有較高的序列一致性(98.50%),此外與云南省辣椒分離株(MT974520、MT787292)和安徽省的煙草分離株(KX650863)的同源性均大于90%。從圖7看出,基于基因組序列構建的系統發育樹中ChiVMV分為4大分支,第Ⅰ支為美國落葵(BasellaalbaL.)分離株(OM108478);第Ⅱ支包括來自我國廣東省辣椒分離株(KU987835)、廣西省辣椒分離株(MT782116、MZ358113)、湖南省辣椒分離株(KR29 6797、LN832362)、臺灣省分離株(OK181760)和海南省辣椒分離株(GQ981316),韓國分離株(AM909719、AJ972878)和印度分離株(NC005778、AJ237843);第Ⅲ支包括來自印度的辣椒分離株(MN207122、MN508959、GU170808和GU1790807),來自巴基斯坦的辣椒分離株(MN508960);貴州分離株ChiVMV-GZ(OP589298)分布在第Ⅳ支株系,與我國四川省的煙草分離株(MK405594)和番茄椒分離株(KC711055、KC711056)、云南省的煙草分離株(JX088636)和辣椒分離株(MT974520、MT787292)、安徽省的煙草分離株(KX650863)在遺傳進化上的距離最近,聚為一支。

a.PVY侵染煙葉;b.ChiVMV侵染煙葉;c.PVY+ChiVMV侵染煙葉;d.PVY+TMV侵染煙葉;e.PVY+CMV侵染煙葉;f.PVY+ChiVMV+TMV侵染煙葉。a.Tobacco leaf infected by PVY; b.Tobacco leaf infected by ChiVMV; c.Tobacco leaf infected by PVY and ChiVMV; d.Tobacco leaf infected by PVY and TMV; e.Tobacco leaf infected by PVY and CMV; f.Tobacco leaf infected by PVY, ChiVMV and TMV.

表1 貴州各煙區煙草樣品的病毒侵染類型

表2 貴州各煙區煙草樣品不同病毒復合侵染類型的檢出率

圖4 貴州4個區域的ChiVMV-CP與其他來源地ChiVMV的系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic evolutionary tree of ChiVMV-CP in four regions of Guizhou and ChiVMV from other sources

M.DL5000 DNA Marker; P1～P6.ChiVMV基因組的6個片段。M.DL5000 DNA Marker;P1-P6.Six segments of the ChiVMV genome.

圖6 ChiVMV-GZ與其他來源地ChiVMV株系基因組序列的一致性Fig.6 Sequence identity between ChiVMV-GZ and ChiVMV lines from other origins

圖7 ChiVMV-GZ與其他來源地ChiVMV株系的系統發育進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of chiVMV-GZ and ChiVMV strain from other origins

3 討 論

自1979年Ong等[9]在馬來西亞半島發現ChiVMV以來,已檢測到該病毒在多個國家和地區發生。2017年王莉爽等[27]在貴州貴陽、遵義和畢節的黔西及大方4個辣椒產區檢測到ChiVMV,這是貴州省內首次報道該病毒;2021年Chen等[28]在貴州煙草上也檢測到該病毒,說明其已在貴州煙草和辣椒產區上普遍發生,且在茄科作物間廣泛傳播。ChiVMV的存在不僅造成了嚴重的經濟損失,還嚴重制約了貴州辣椒和煙草等作物的生產。本研究針對貴州省貴陽、遵義、銅仁和安順等地主要植煙區表現褪綠和枯斑等癥狀的煙草樣品(80份)進行鑒定,其中,TMV檢出率最高(48.75%),ChiVMV檢出率為37.50%,CMV檢出率最低(8.75%);遵義煙區的病毒檢出率最高,與實際調查情況相符,說明遵義煙區的病毒病在4個區域中發生最嚴重。王莉爽等[7]對貴州煙草發生的主要病毒病進行檢測的結果顯示,TMV是貴州省優勢病毒種群,而PVY是次優勢病毒種群。本研究結果表明,TMV在4個煙區的檢出率均最高,與王莉爽等[7]的研究結論一致,說明TMV仍是危害貴州煙草的主要病毒。但由于近年貴州省內對煙草病毒病檢測報道較少,不能明確病毒病的發生變化趨勢。ChiVMV在貴州省內主要煙區已經普遍發生并在部分區域危害嚴重程度甚至超過PVY,很有可能已經成為危害僅次于TMV的第二大病毒種群,應該引起重視與警惕。

本研究通過分段擴增獲得貴州煙草分離株ChiVMV-GZ的基因組全長,基于基因組序列與GenBank上已公布的來自不同國家、地區和寄主ChiVMV的全基因序列分析發現,ChiVMV-GZ與四川的番茄和煙草分離株的基因序列一致性最高,分別為98.70%和98.50%,此外與來自云南的煙草和辣椒分離株也具有較高一致性。說明本研究中貴州分離物與地理位置更近的四川和云南分離物親緣關系更近。2022年田紹銳等[26]在重慶涪陵、北碚地區煙葉樣品中首次檢出ChiVMV且基于ChiVMV的CP序列對比分析發現,重慶ChiVMV CP分離物與四川瀘州煙葉ChiVMV CP分離物親緣關系最近。湯亞飛等[23]基于全基因組分析比對發現,廣東辣椒分離物與海南分離物的親緣關系最近。賈樹丹等[21]研究發現,來自四川的ChiVMV辣椒分離物與來自海南的ChiVMV辣椒分離物之間CP序列一致性僅有85.20%～86.20%,親緣關系較遠。本研究結果說明,地理隔離是影響ChiVMV株系分化的主要因素,云貴川渝地區的ChiVMV株系間親緣關系很近,可能是4個地區相互接壤位于我國的西南部,地形均以山地和丘陵為主且生態環境類似所致,本研究結論與賈樹丹等[21,23,26]的研究結論一致。本研究構建系統發育進化樹發現,地理位置接近的地區ChiVMV分離物優先聚在同一分支,并未因寄主相同而聚在一分支,說明寄主并非影響ChiVMV株系分化的主要因素,但不可由此定論ChiVMV的株系分化完全由地理因素決定而不受寄主影響。楊潔等[17]研究發現,云南ChiVMV滇重樓分離物與云南ChiVMV煙草分離物之間的序列一致性最高(99.10%),而與云南ChiVMV辣椒分離物之間的序列一致性較低(85.70%),說明同一地區不同寄主的ChiVMV同樣存在遺傳分化趨勢,后期可針對不同寄主ChiVMV之間遺傳進化差異開展相關研究,以明確ChiVMV對不同寄主侵染的選擇性。

由于采樣點不全面以及樣本數較少等原因限制,部分病毒病及部分區域的檢測結果和實際調查情況有所差異,同時也還未能明確貴州省內不同地區、不同寄主的ChiVMV之間是否存在遺傳進化趨勢,下一步應在全省范圍內對不同寄主的ChiVMV開展相關研究以明確其差異性。

4 結 論

辣椒脈斑駁病毒在貴州煙草上已普遍發生,應引起高度重視。本研究在貴州煙草上首次分離獲得ChiVMV-GZ全長;基于遺傳進化分析,發現ChiVMV-GZ與來自四川和云南的ChiVMV株系間的親緣關系較近。本研究可為貴州煙草病毒病防控提供理論依據。