纖維蛋白凝膠管狀支架的制備及性能

林展翼 劉鵬 梅靜怡 周嘉輝

（1. 華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2. 華南理工大學 醫學院，廣東 廣州 510006；3. 廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）心內科，廣東 廣州 510080；4. 廣東省老年醫學研究所，廣東 廣州 510080）

疾病譜的改變及全球人口老齡化造成心血管性疾病逐年攀升，預測到2030 年全球每年將有2 330萬人死于該疾?。?］。血管移植是治療心血管疾病的重要手段，但血管移植物的臨床供給不足限制了其應用。目前小口徑（直徑 ≤ 6 mm）的血管移植物還是以自體血管的獲取為主，尋求移植物供給上的突破一直是血管外科界亟待解決的問題。組織工程血管體外培養技術在過去30年間取得了飛速進步，其關鍵技術集中在種子細胞、支架材料及構建環境的選擇這3個方面。目前，相關研究中選擇的支架材料主要是可降解的PGA（聚乙醇酸）材料［2］，但其酸性降解產物會影響細胞生長，材料降解不完全時將在移植者體內成為異物，這些缺點可能影響組織構建和移植的中遠期效果。

近年來，具有高含水量、良好生物相容性和離子傳送能力的水凝膠材料得到了廣泛應用［3-4］，國外已有實驗室使用纖維蛋白凝膠作為小口徑組織工程血管培養的支架材料［5］。纖維蛋白是一種單體纖維蛋白原的生物聚合物，包含Aα-、Bβ- 和γ- 這3對二硫鍵連接的多肽鏈，相對分子質量為3.4×105［6］。凝血酶可以將纖維蛋白原特異性切割為小的纖維蛋白肽，并在鈣離子（Ca2+）作用下刺激凝血因子（纖維蛋白穩定因子）轉化為凝血因子A（轉谷氨酰胺酶），后者催化纖維蛋白肽發生交聯，形成纖維蛋白凝膠。纖維蛋白凝膠具有降解產物無毒性［7-8］、生物相容性好等特點［9-11］，還具有能促進細胞分泌細胞外基質的優勢［12］，但形成的凝膠狀態不穩定，制備條件及過程要求比較苛刻。有鑒于此，文中針對小口徑組織工程血管的構建需求探索一種新型的制備方法，以期為小口徑血管的構建提供一種新的技術路徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

纖維蛋白原、凝血酶、氨基己酸、胰島素、Pluronic F-127，美國Sigama-Aldrich 公司產品；Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 培養基，美國Corning公司產品；抗壞血酸，美國Gibco公司產品；Phalloidin-iFluor 594、重組Anti-Vinculin 抗體，英國Abcam 公司產品。UV-2600型紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司產品；MERLIN 型場發射掃描電子顯微鏡，德國Zeiss 公司產品；Talos F200X 型場發射透射電子顯微鏡，美國FEI 公司產品；LSM900型激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司產品；DM18 型THUNDER 3D 細胞顯微鏡，德國Leica 公司產品；Instron 5967 型萬能材料試驗機，美國英斯特朗公司產品。如無特殊說明，所用試劑均為分析純。

1.2 纖維蛋白凝膠管狀支架的制備

將凝血酶和CaCl2（體積比1∶1）制成混合溶液后冰浴保存，另外用20 mmol/L 的HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）緩沖溶液在37 ℃下配制纖維蛋白原溶液。將纖維蛋白原溶液和混合溶液按4∶1的體積比構建纖維蛋白凝膠，其中凝膠懸浮液的最終含量為纖維蛋白原4 mg/mL、凝血酶0.8 U/mL及CaCl25.0 mmol/L。懸浮液通過吸管的作用混合均勻，混合后注入用5% Pluronic F-127 溶液預處理的模具中，通過可滑動的芯軸和中空圓柱形模具對凝膠支架進行塑形（如圖1所示），模具在37 ℃的5% CO2中保持10 min，使纖維蛋白完全凝膠化，最后得長度為3 cm、內徑為4 mm、厚度為1 mm的管狀凝膠支架材料。由于在負載細胞時凝膠管壁會發生收縮，對凝膠管外徑大小的選擇，需要根據小口徑血管移植物（直徑 ≤ 6 mm）的實際尺寸需求進行調整。制得的凝膠由于黏性高，需要用表面活性劑Pluronic F-127［13］對模具進行預處理，防止因凝膠與模具的黏附而破壞支架形狀。當使用管狀支架負載種子細胞進行培養時，還需要添加一定比例的胰島素和抗壞血酸，以促進細胞的增殖與細胞外基質的分泌［14］。

圖1 纖維蛋白凝膠管狀支架的制備Fig.1 Fabrication of fibrin gel tubular scaffold

1.3 負載細胞實驗

原代人真皮成纖維細胞購自美國ScienCell 公司。取第2代人成纖維細胞，使用含20% FBS（胎牛血清）的DMEM/F12培養基，在37 ℃、含5% CO2的細胞培養箱中進行培養。細胞生長達到約80%融合狀態時以胰蛋白酶消化，超速離心后制成細胞懸液進行下一步實驗。

將纖維蛋白原溶液、凝血酶與CaCl2（體積比1∶1）的混合溶液以及每毫升含106個細胞的細胞懸液按4∶1∶1 的體積比混合制成纖維蛋白凝膠懸浮液?；旌虾笞⑷胗?% Pluronic F-127溶液預處理的模具中，模具在37 ℃的5% CO2中保持10 min，使纖維蛋白完全凝膠化。獲得凝膠管后，將管狀凝膠放入含2 μg/mL 胰島素、2 mg/mL 氨基己酸、50 μg/mL抗壞血酸的DMEM 培養基的15 cm 培養皿中培養。每周更換培養液3次，每次更換70%培養液。

1.4 分析與表征

1.4.1 凝膠性能表征

設置分光光度計波長為352 nm，測定纖維蛋白凝膠成膠過程的光密度變化，將達到光密度最大值的時間定義為凝膠成膠時間。纖維蛋白凝膠在常溫蒸餾水中孵育，選擇不同時間點，用濾紙吸附掉凝膠表面水分后在微量天平上測定凝膠的濕重（mt），凝膠吸水率定義為所增加的質量（mt-m0）與初始質量（m0）的比率。將制備好的兩組纖維蛋白凝膠轉移至培養皿中，一組加入含2 mg/mL的氨基己酸（纖維蛋白酶抑制劑）的PBS溶液，另一組加入等量的不含氨基己酸的PBS溶液，將凝膠放置在37 ℃培養箱中孵育，在不同的時間點取出凝膠計算剩余凝膠體積，將其與凝膠初始體積進行比較，獲得凝膠降解速度。

使用萬能材料試驗機測量纖維蛋白凝膠的楊氏模量。纖維蛋白凝膠在PBS中孵育1 h，用濾紙吸干表面水分，然后裝載在兩個平板之間進行壓縮測試，壓縮速度為1.0 mm/min。采用應變范圍為0~0.05的應力-應變曲線的線性部分來計算凝膠的楊氏模量。

1.4.2 凝膠微觀結構分析

掃描電子顯微鏡分析：取2.5%戊二醛固定凝膠樣品后，依次在梯度乙醇（含量分別為30%、50%、70%、80%和95%）溶液中進行脫水，再使用臨界點干燥機進一步干燥脫水凝膠，將其安裝在鋁墊片上并濺射鍍鉑，利用場發射掃描電子顯微鏡進行觀察。

透射電子顯微鏡分析：取2.5%戊二醛固定凝膠樣品后，依次在梯度乙醇（含量分別為30%、50%、70%、80%和95%）溶液中脫水，脫水后通過純丙酮+包埋液對凝膠進行包埋，然后在梯度溫度（分別為37、45、60 ℃）下固化。采用超薄切片機對凝膠切片，經過醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，利用場發射透射電子顯微鏡進行觀察。

1.4.3 組織學分析

分別在第1天和第4天收集所制備的管狀凝膠。部分凝膠使用含4%多聚甲醛的PBS 溶液在冰上進行固定，再經過細胞膜通透步驟后采用PhalloidiniFluor 594抗體在室溫下進行染色，最后進行封片、觀察。另一部分凝膠在固定、通透處理后，于4 ℃下用重組Anti-Vinculin 抗體稀釋液孵育過夜，次日在室溫下加入兔抗鼠熒光二抗稀釋液孵育，然后進行封片、觀察。

選擇培養7 d的管狀凝膠，放置于含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定，再用OCT（最佳切削溫度）混合物進行包埋，液氮冷凍后采用HE（蘇木精-伊紅）染色法進行染色。

1.5 圖片處理及統計學方法

使用ImageJ軟件對掃描電鏡圖像進行分析，求出纖維蛋白凝膠的平均纖維直徑和孔隙大小。

采用SPSS19.0 統計軟件進行數據分析，實驗數據以“平均值±標準差”的形式表示。

2 結果與討論

2.1 纖維蛋白凝膠的性能和結構

2.1.1 凝膠的整體形貌

凝血酶溶液和CaCl2溶液按1∶1 的體積比制成混合溶液，再將纖維蛋白原溶液和混合溶液按4∶1的體積比混合，在37 ℃培養箱中保持10 min后即可使纖維蛋白完全凝膠化。纖維蛋白凝膠混合溶液在成膠前為透明液體（見圖2（a）），成膠時為半透明狀混合物（見圖2（b）），成膠后纖維蛋白凝膠整體外觀呈乳白色，外表光滑，結構完整，膠質分布均勻（見圖2（c））。

圖2 纖維蛋白凝膠的成膠過程Fig.2 Gelation process of fibrin gel

纖維蛋白凝膠的前體物質由蛋白質組成，因此其制備過程中對溫度和pH 值的控制尤為關鍵。本研究中采用HEPES 緩沖溶液作為材料體系的溶劑，有效地控制了凝膠的pH 值；同時，37 ℃的成膠溫度既可維持纖維蛋白原的蛋白構象，也保證了體系的成膠。

2.1.2 凝膠的成膠時間

在成膠過程中，纖維蛋白凝膠的濁度隨著時間的延長而顯著增加（如圖2 所示），可測得光密度（OD 值）上升到最大時的平均時間為（172.0±4.7） s（如圖3所示）。此時成膠過程結束，該時間點即為纖維蛋白凝膠的成膠時間。

圖3 纖維蛋白凝膠的成膠時間Fig.3 Clotting time of fibrin gel

在整個凝膠制備過程中，僅用不到3 min 的時間即可獲得外表光滑、厚度均勻的水凝膠，而較短的成膠時間將顯著影響凝膠的結構，獲得的凝膠更加致密，產生更多的凝膠纖維結構［15］。

2.1.3 凝膠的吸水性能

隨著凝膠在蒸餾水中培養時間的延長，其吸水量也逐漸增加（如圖4所示）。從開始到培養12 h，吸水速度相對較快；培養12~24 h期間，吸水速度逐步放緩；培養24~72 h時，凝膠的吸水量已經基本達到飽和，此時凝膠內外溶液交換處于動態平衡，纖維蛋白凝膠最終的吸水率為34.50%±1.87%。

圖4 纖維蛋白凝膠的吸水率Fig.4 Water absorption of fibrin gel

短時間內獲得的含有較多纖維結構的纖維蛋白凝膠具有更強的抗收縮能力［15］。隨著凝膠在蒸餾水中培養時間的延長，凝膠也可以穩定保持較好的吸水率，這有利于凝膠內部與外界環境進行穩定的物質交換，滿足負載種子細胞后細胞生長所需的環境條件［16］。

2.1.4 凝膠的降解時間

當凝膠靜置在PBS中自然降解時，從開始到第1天凝膠體積減小了40%，凝膠整體形狀不再完整。凝膠降解速度從第3 天到第7 天逐步減慢，直至第7 天時完全降解；而當凝膠靜置在含2 mg/mL ACA（氨基己酸）的PBS 溶液中時，凝膠在7 d 內的體積下降比例不足20%，整體形狀可以維持更長的時間（如圖5所示）。

圖5 纖維蛋白凝膠的自然降解與ACA介導的降解Fig.5 Natural degradation and ACA-mediated degradation of fibrin gel

普通條件下制得的凝膠存在快速降解現象，因為凝膠在自然狀態下很容易被溶液中的纖維蛋白酶分解，并不適合作為生物支架用于細胞長時間培養。因此，為了滿足小口徑組織工程血管培養的支架材料要求，需要在保存液中額外添加2 mg/mL 的氨基己酸，通過抑制纖維蛋白酶來調控凝膠的降解時間。

2.1.5 凝膠的力學性能

凝膠成膠后，利用萬能材料試驗機對纖維蛋白凝膠進行力學性能測試，測得凝膠的楊氏模量為（2 624±295） Pa。

天然纖維蛋白凝膠成膠后柔軟且易降解。已有研究表明，獲得的纖維蛋白凝膠在楊氏模量僅為570 Pa時也可直接作為負載細胞的支架［17］，但是凝膠短時間內就會喪失力學性能并完全降解。而在小口徑組織工程血管移植物構建的初始階段（1 至2周），力學性能需要由支架材料來提供，支架降解時間過快會導致這一階段管狀支架結構缺乏穩定性，此時就需要通過添加氨基己酸或采用其他改性方式來抑制纖維蛋白酶的降解作用，從而維持纖維蛋白凝膠支架的初始力學性能。

2.1.6 凝膠的微觀結構

掃描電鏡結果顯示，纖維蛋白凝膠的纖維網絡緊湊，呈致密的多孔結構，纖維與纖維之間交聯密切。運用ImageJ 軟件計算得凝膠平均纖維直徑為（0.41±0.03） μm，平均孔隙大小為（47.87±9.60） μm2（如圖6所示）。

對用于負載細胞培養的水凝膠來說，營養的自由交換是極其重要的。由圖6可知，纖維蛋白凝膠的纖維網絡精細且疏松多孔，纖維橫縱交錯排列。這種結構有利于營養物質及代謝物質的輸送和排放，是促進細胞生長的理想結構。交錯排列的凝膠纖維可以提供人成纖維細胞附著位點，同時也為細胞的伸展與遷移提供了空間［18］。

圖6 纖維蛋白凝膠的掃描電鏡圖及纖維直徑、孔隙大小Fig.6 Scanning electron microscope result of fibrin gel and fiber diameter as well as pore size

2.2 細胞相容性

2.2.1 負載人成纖維細胞的纖維蛋白凝膠管狀支架的組織學分析

通過HE 染色法對負載人成纖維細胞的纖維蛋白凝膠管狀支架切片進行染色，可見獲得的纖維蛋白凝膠管狀支架被酸性伊紅染液染成紅色，染色結果顯示凝膠厚度較均勻（如圖7所示），細胞在凝膠中結構完整、分布均勻且密度高。

圖7 凝膠-細胞混合物的HE染色結果Fig.7 HE staining result of gel-cell mixture

由圖7可知，人成纖維細胞在纖維蛋白凝膠中的生長狀況良好，凝膠內部提供的環境條件適合細胞的生長與增殖。

2.2.2 不同培養時間點人成纖維細胞微觀結構的變化

人成纖維細胞負載在纖維蛋白凝膠中進行培養后，掃描電鏡結果顯示：細胞在6 h 就發生分裂，并與纖維蛋白網形成聯系（見圖8（a））；12 h時細胞代謝活性增強，透射電鏡清晰顯示負載在凝膠內的人成纖維細胞有較多的細胞核和線粒體結構（見圖8（b））；1 d時人成纖維細胞在凝膠內逐漸伸展開，熒光顯微鏡下見大部分細胞伸出突觸（圖8（c）），細胞呈現梭形形態；4 d時細胞開始變得致密，熒光顯微鏡下見細胞與細胞之間開始形成黏附，細胞形態飽滿、活性高，形狀變為紡錘形（見圖8（d））。

圖8 人成纖維細胞在不同時間點的微觀結構變化Fig.8 Microstructural changes of human fibroblasts at different time points

僅僅在6 h 內，細胞與凝膠的纖維就交聯在一起，說明成纖維細胞與纖維蛋白凝膠的纖維束相容性較好，短時間內就能感知并適應凝膠空間網絡結構，并開始融入其中。培養12 h時細胞在凝膠內的代謝變得旺盛，說明凝膠疏松多孔的結構和較高的含水量可為細胞提供合適的生長環境以及物質交換的場所。一般情況下，細胞在適宜環境下新陳代謝會更加旺盛，細胞與細胞之間的聯系也會更加密切，這種適宜的環境有利于細胞分泌細胞外基質。培養1 d 后，細胞形態由最初零散的梭形轉變為更利于生長與分泌的紡錘形，Vinculin 染色結果顯示細胞與細胞之間形成了局部的緊密聯系。以上結果表明，成纖維細胞在凝膠內的生長狀況良好，能夠完全適應這一多孔隙支架材料環境。

3 結語

文中在嚴格控制溫度和pH 值等條件、并保證纖維蛋白原和凝血酶與CaCl2溶液體積比不變的情況下，采用管狀模具在短時間內獲得了外表光滑、厚度均勻的纖維蛋白凝膠管狀支架。該支架材料表面疏松、多孔，滿足內外營養自由交換的條件，力學性能穩定，可滿足負載細胞進行細胞培養的需求。通過分析該支架對人成纖維細胞生長的影響發現，該支架材料為細胞提供了良好的生長和增殖環境，在培養過程中細胞形態完整，分布均勻，生長狀況較好；免疫熒光實驗也證實，文中方法制備得到的纖維蛋白凝膠管狀支架具有良好的細胞相容性，有望用作小口徑組織工程血管移植物培養的支架材料。后續研究中，將探討纖維蛋白凝膠管狀支架作為細胞長期培養載體的穩定性，并嘗試用生物反應器與纖維蛋白凝膠管狀支架結合來獲取具有一定力學性能的小口徑組織工程血管。纖維蛋白凝膠支架也可運用在各種仿生材料和人造組織的制造中，具有廣闊的應用前景。