pH-DO組合調控策略提高小白鏈霉菌ε-聚賴氨酸的生物合成

吳夢萍，王靚，張建華，張宏建，陳旭升*

1(江南大學，生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一種天然均聚氨基酸，由25～35個L-賴氨酸(L-lysine,L-lys)單體通過α-COOH和ε-NH2脫水縮合而成[1]。作為一種廣譜的陽離子抗菌肽，ε-PL可以破壞革蘭氏陽性/陰性細菌、酵母菌等真菌的細胞包膜結構，從而抑制微生物的生長。目前，ε-PL已被日本、韓國、美國和中國等國家批準作為食品防腐劑。此外，ε-PL具有良好的水溶性、對環境與人類無公害以及可生物降解性等極具商業價值的特性，因此被廣泛應用于食療劑、干擾劑、酶保護劑、藥物載體等領域[2]。然而，作為一種主要由鏈霉菌生產的次級代謝產物，ε-PL產量較低，限制了其工業化生產及商業應用。

pH和溶解氧(dissolved oxygen, DO)是影響ε-PL發酵最主要的限制因素。一般來說，pH可以通過改變細胞膜的表面電荷來影響營養物質的有效性和酶活性，從而影響細胞活力[3]。KAHAR等[4]發現ε-PL產生的最適pH為4.0，而pH>5對細菌菌絲生長更有利?；诖?，該團隊建立了兩階段pH調控策略，將產量從5.7 g/L提高到48.3 g/L，提高了7.47倍。REN等[5]發現短時的酸性pH沖擊可以促進菌體快速地生長及ε-PL的大量合成，隨后建立了pH沖擊工藝，將ε-PL產量提高了52.5%，達到54.70 g/L。此外，由于ε-PL發酵為好氧發酵且發酵液的黏度較高，限制了DO在擴大發酵時的傳遞效率。為了解決這個問題，XU等[6]在補料分批發酵過程中，外源添加了氧載體(0.5%正十二烷)，提高了發酵液中DO濃度，將產量提高了31.6%。隨后，該團隊通過過表達透明顫菌的血紅蛋白基因(vgb)，提高了StreptomycesalbulusPD-1發酵的氧氣攝取能力，將ε-PL提高至34.2 g/L，增加了50%[7]。然而，以往研究主要集中在ε-PL發酵前期(前36 h)對pH和DO的單獨優化，很少有策略對pH與DO進行同時優化。

在前期的工作中，本團隊經過多輪誘變與核糖體工程選育，篩選出一株高產菌StreptomycesalbulusWG-608，其搖瓶ε-PL產量較出發菌提高了42.3%[8]。該菌株在發酵進入穩定期后，出現了葡萄糖消耗速度大幅下降、菌體生長受到明顯抑制的現象，進而影響了ε-PL的單位菌體合成能力?；诖?，本研究開發了一種新的pH-DO組合調控策略，分階段對pH和DO進行系統優化，顯著提高了WG-608的單位菌體合成能力與ε-PL產量。隨后，研究了WG-608的細胞生理變化，包括關鍵酶活性、呼吸鏈活性和胞內核苷酸水平，以闡明pH-DO組合調控策略對細胞代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

StreptomycesalbulusWG-608由出發菌S.albulusM-Z18經多輪誘變及核糖體工程獲得，并由本實驗室保藏[9]。

1.1.2 培養基與溶液

種子發酵培養基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，用NaOH調pH至7.2。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖60，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，消泡劑0.2，pH 6.8。

流加培養基(g/L)：葡萄糖750，氨水12.5%(體積分數，下同)，(NH4)2SO4375，消泡劑100。

100 mmol/L Tris-HCl：2.4228 g Tris和0.0308 g二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT, 1 mmol/L)溶于20%甘油并定容至200 mL,再用濃HCl調pH至7.5。

1.1.3 主要試劑與儀器

葡萄糖(優級純)，山東西王藥業有限公司；酵母粉，Oxoid公司；其他試劑，均為分析純，國藥化學試劑有限公司；ATP、NAD(P)H試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；碘硝基氯化四氮唑藍(iodonitrotetrazolium chloride， INT)，上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒，寶日醫生物技術(北京)有限公司。

5 L發酵罐，上海保興生物設備有限公司；UV-2100分光光度計，優尼科儀器有限公司；AB204-N分析天平，瑞士梅特勒公司；GNP-9160恒溫培養箱，上海光都儀器設備有限公司；3K15高速冷凍離心機，德國Sigma公司；HYL-C組合式搖床，太倉市強樂設備有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SM-650D超聲破碎儀，南京舜瑪儀器設備有限公司；Biotek多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件

一級種子液培養，取孢子接種于種子培養基，置于30 ℃，200 r/min搖床培養24 h。

二級種子液培養，將6.4 mL種子液接入含80 mL種子培養基的500 mL錐形瓶中，30 ℃，200 r/min培養24 h。

5 L發酵罐ε-PL恒定pH補料分批發酵，在5 L罐中裝入3.2 L發酵培養基滅菌，設置發酵罐溫度30 ℃，初始轉速200 r/min，曝氣率1.14 vvm，pH 6.8，共發酵240 h。接種240 mL種子液入發酵罐，隨著發酵的進行，發酵pH自然下降，當pH降至4.0時，補加12.5%的氨水溶液將pH控制在4.0，直至發酵結束。通過調整轉速和通氣量，使DO盡量維持在30%，當發酵液葡萄糖濃度<10 g/L時，根據葡萄糖的消耗速率設定補料速率，補加的葡萄糖溶液質量濃度為750 g/L。當罐內的NH4+-N質量濃度低于0.2 g/L時，補加375 g/L的(NH4)2SO4溶液，使其維持在0.1～0.5 g/L，直至發酵結束。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 發酵過程參數測定方法

葡萄糖濃度測定方法：將發酵液樣品離心后取一定量的上清液，使用生物傳感分析儀(biosensor analyzer，SBA)緩沖液稀釋100倍，充分混勻后進行檢測并讀數；NH4+-N濃度測定方法：取發酵液離心后的上清液，稀釋一定比例后，通過靛酚藍反應法測定[9]。發酵液的ε-PL濃度由甲基橙比色法測定[10]；菌體干重(dry cell weight, DCW)由濾紙差量法測定[11]。

1.2.2.2 生理參數測量

粗酶液的制備參照王靚[12]的方法加以改進：取發酵液1 000×g離心5 min，棄上清液；0.2 g/L KCl溶液洗滌3次，棄上清液重懸于100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液；超聲破碎儀在60%功率下破碎細胞20 min(工作2 s，停2 s)，12 000×g離心20 min，上清液即為粗酶液，蛋白濃度測定參照BCA蛋白測定試劑盒。

酶活力測定方法：(1)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)活性測定參照TANG等[13]的方法并加以改進，100 mmol/L Tris-HCl緩沖液350 μL，0.4 mmol/L NADP+18 μL，5 mmol/L葡萄糖-6-磷酸7 μL，粗酶液50 μL；定義1U為30 ℃條件下每分鐘1 μmol/L NADP+轉化為NADPH所需的酶量。(2)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)活性測定參照BRAMWELL等[14]的方法并加以改進，100 mmol/L Tris-HCl緩沖液235 μL，1 mmol/L乙酰CoA 25 μL，40 mmol/L MnSO450 μL，100 mmol/L NaHCO350 μL，1.5 mmol/L NADH 50 μL，20 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸20 μL，500 U/mL蘋果酸脫氫酶10 μL，粗酶液10 μL，定義30 ℃條件下反應1 min催化生成1 μmol NAD+所需的酶量為1個酶活力單位；(3)檸檬酸合酶(citrate synthase, CS)活力參照MURAKAMI等[15]的方法, 100 mmol/L Tris-HCl緩沖液235 μL，6.7 mmol/L 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)， DTNB] 10 μL，200 mmol/L草酰乙酸二鈉5 μL，1 mmol/L乙酰CoA 25 μL，定義30 ℃條件下反應1 min催化生成1 μmol檸檬酸-CoA所需的酶量為1個酶活力單位；(4)天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK)活力參照曾昕[17]的方法，3 mol/L pH 7.0鹽酸羥胺-KOH 50 μL，100 mmol/L ATP 50 μL，100 mmol/L MgSO450 μL，3 mol/L (NH4)2SO4100 μL，50 mmol/L天冬氨酸-KOH 40 μL，粗酶液50 μL。定義30 ℃條件下反應1 min催化生成1 μmol天冬氨酰-β-羥肟所需的酶量為1個酶活單位；(5)PLS活性參考YAMANAKA等[16]的方法，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)400 μL，100 mmol/LL-lys 100 μL，50 mmol/L ATP 100 μL，50 mmol/L MgCl2溶液100 μL，50 mmol/L DTT 100 μL，粗酶液200 μL，酶活定義為30 ℃條件下1 s催化減少1 pmolL-lys所需的酶量。

電子傳遞鏈的測量方法參照曾昕[17]的方法，在30 ℃條件下反應，100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液60 μL，0.835 mmol/L NADH 15 μL，0.24 mmol/L NADPH 15 μL，0.133 mol/L丁二酸鈉 30 μL，1 g/L曲拉通30 μL，4 mmol/L INT 30 μL，粗酶液50 μL，測定490 nm處吸光度。細胞電子傳遞活性按公式(1)計算：

(1)

式中：φ，細胞電子傳遞鏈活性，μL O2/(h·g蛋白)；系數60可將反應時間分鐘換算成小時；ΔA490，反應時間內的吸光度變化值；V總，反應體系總體積，μL；1.42，INT接受O2電子比例；Δt，反應時間，min；V酶，酶液加入量，μL；H液，反應體系的光徑，nm。

ATP和輔因子測量：分別按照ATP檢測試劑盒、NADPH檢測試劑盒和NADH檢測試劑盒進行檢測。

1.2.3 數據分析

實驗重復2～3次，結果表示為平均值±標準差。采用GraphPad prism 8.0對實驗數據進行統計學分析，數據間的比較分析采用無交互作用的雙因數方差分析(Two-way ANOVA)中的Bonferroni’s檢驗，顯著性水平設定為0.05；作圖采用OriginPro 9.1軟件。

2 結果與討論

2.1 S.albulus WG-608在恒定pH策略下的5 L罐發酵

在之前的研究中，經多級誘變、基因組改組及核糖體工程育種獲得1株WG-608，其搖瓶的產量達到3.7 g/L，較出發菌M-Z18提高了48%[18]。在5 L罐中對WG-608進行了恒定pH 4.0補料-分批發酵，并研究其發酵特性。

如圖1-a，pH在發酵10 h后快速下降，在24 h前降至pH 4.0，并維持至發酵結束。接種后DO快速下降，當其降至30%左右，通過調節轉速和通氣量將其維持在30%左右。

a-ε-PL發酵過程情況；b-ε-PL日增長量、 菌體日增長量和葡萄糖日消耗量圖1 恒定pH補料-分批發酵Fig.1 Constant pH fed-batch fermentation

在整個發酵過程中，葡萄糖的質量濃度維持在1～10 g/L，以避免底物抑制。觀察到葡萄糖的消耗速度在0～72 h快速增加，而72 h后開始顯著下降。與之對應，菌體干重在前72 h內達到了39.57 g/L，而在72～240 h之間僅增長了9.59 g/L(圖1-b)。ε-PL在整個發酵過程中持續快速積累，這意味著ε-PL屬于生長半耦聯型產物，其產量既受菌體的生長影響，還與菌體質量濃度相關。經240 h的補料分批發酵，ε-PL達到(53.63±0.78) g/L。

以上結果表明，發酵后期(72 h后)WG-608的底物葡萄糖消耗與菌株生長均受到了強烈抑制。發現ε-PL的合成受pH 和DO的影響十分顯著，故將發酵過程劃分為2個階段，即菌體生長期(0～72 h)和產物合成期(72～240 h)。通過對pH和DO的系統優化，探索每個發酵階段最適合的發酵條件，以期進一步提高WG-608的ε-PL合成能力。

2.2 pH對S.albulus WG-608發酵ε-PL的影響

研究表明，ε-PL僅在酸性培養條件下大量積累[16]，但pH過低會抑制菌體的生長[19]。為了確定pH對高產菌WG-608生產ε-PL的影響，將pH分別控制在3.7、4.0、4.3和4.6，于5 L發酵罐內進行了72 h的補料分批發酵。如表1所示，pH值對菌體干重和ε-PL產量有顯著影響。隨著pH值的增加，菌體量逐漸增加，與KAHAR等[4]的結果類似。當pH為4.0時，ε-PL的產量達到最大值16.65 g/L，分別比pH 3.7，4.3和4.6提高了11.1%、10.9%、33.4%。此外，較低(3.7)或較高的pH(4.6)均不利于ε-PL的生產。這可能是由于當pH維持在3.7發酵時，細胞生長受到抑制(平均比生長速率最低)，進而限制了ε-PL的合成。pH 4.6時，底物的消耗主要用于菌體的快速積累，此時ε-PL的產量和單位菌體合成能力最低，分別為12.48 g/L和0.57 g/g。

表1 不同pH條件下WG-608生產ε-PL的情況Table 1 Comparison of ε-PL production by S.albulus WG-608 under different pH levels

在ε-PL發酵中，pH 4.0有利于胞內大量積累ATP，進而激活ε-PL合成酶的表達及調節其催化功能[16, 20]。然而，長時間的酸性環境導致ATP被大量消耗用以維持細胞穩態，不利于菌絲體的生長，繼而影響ε-PL的合成[4, 21]。本研究發現雖然WG-608在pH 4.0時ε-PL濃度達到最大值，但其實pH 4.0與4.3條件下的菌體量、產量和單位菌體合成能力相差不大(表1)。鑒于pH 4.3時菌株表現出更強的菌體生長能力，因此選擇在72 h后(發酵穩定期)將pH維持在4.3，以緩解酸性環境對菌體生長和ε-PL合成造成的不利影響[12]

2.3 DO對ε-PL補料分批發酵的影響

小白鏈霉菌發酵生產ε-PL屬于好氧發酵，發酵罐內的DO水平對菌體生長和產量都有顯著影響[6]。一般來說，發酵液中較高的DO條件有利于增強碳源的利用效率，增大碳代謝通量，從而提高發酵生產效率[22]。然而過量的DO水平也可能會導致胞內活性氧的過量積累，從而引起細胞氧化應激作用，最終導致細胞提早衰亡[23]。對于生物發酵過程，其不同階段的最適DO存在差異，因此在不同的發酵階段按需供氧顯得十分必要[24]。

根據2.1中WG-608的恒定pH發酵特征，將240 h發酵過程中的DO分為2個階段進行優化，即菌體生長期(0～72 h)和產物合成期(72～240 h)。

2.3.1 DO對菌體生長期ε-PL發酵的影響

在pH 4.0的條件下，將發酵罐內DO分別控制在20%、30%、40%，于5 L罐內進行72 h的分批-補料發酵。結果表明，DO維持在40%時，產量和DCW均達到最高，分別為19.30和39.77 g/L(表2)。說明該階段ε-PL合成的最適DO為40%。因此，選擇40%的DO水平作為菌體生長期的最適DO。

表2 菌體生長期DO對WG-608 ε-PL 產量的影響Table 2 Effect of dissolved oxygen on ε-PL production by S.albulus WG-608 during the growth period

2.3.2 DO對產物合成期ε-PL發酵的影響

基于2.3.1的實驗結果，將0～72 h的DO控制在40%，將72 h后的DO分別維持在10%、20%、30%，以探索發酵后期DO對ε-PL發酵的影響。圖2表明，將發酵后期的DO控制于20%，菌體量和產量均達到最高，分別達到57.13 和66.24 g/L。因此在產物合成期確定DO控制于20%更有利于小白鏈霉菌生產ε-PL。

a-菌體干重(DCW)；b-ε-PL產量圖2 不同DO條件下WG-608產物合成期生產ε-PLFig.2 ε-PL production by S.albulus WG-608 under different dissolved during the production synthesis period

2.4 pH-DO組合調控策略的建立

綜合上述結果，建立了pH-DO組合調控策略。整個策略分為2個階段，第一階段(0～72 h)，pH從6.8自然下降并維持在4.0，同時DO從初始的100%下降并維持在40%；第二階段(72～240 h)，DO控制在20%，pH控制于4.3。圖3-a顯示，經pH-DO組合策略調控，WG-608的DCW在72 h經短暫的停滯后，持續增長，這與原始策略顯然有很大的不同(圖1)。隨著菌體生長速率的增加，ε-PL的產量積累明顯高于對照策略。最終經240 h的發酵，ε-PL產量與平均比合成速率分別可達(68.77±2.53) g/L和(2.33±0.08) d-1，較原始策略分別提升了28.23%和12.02%(表3)。

表3 不同策略對WG-608生產ε-PL的影響Table 3 Effect of ε-PL production by S.albulus WG-608 under different fermentation strategy

a-ε-PL發酵過程情況；b-菌體比生長速率；c-ε-PL比合成速率；d-葡萄糖消耗量圖3 pH-DO組合策略生產ε-PLFig.3 The ε-PL production by pH-DO combination strategy注:圖中相同時段恒定pH和pH-DO組合調控策略之間的差異，以*表示0.01

圖3-b顯示，在0～72 h，pH-DO組合調控策略的日平均比生長速率顯著高于對照策略，而72 h后2種策略之間無顯著差異。而對于日平均比合成速率而言，pH-DO組合調控策略則在72 h后(除168 h)顯現出了明顯優勢。此外，對2種策略下2個階段葡萄糖的消耗總量進行統計(圖3-d)，結果發現在發酵第一階段(0～72 h)的2種策略下的葡萄糖消耗總量無顯著差異，而第二階段(72～240 h)，pH-DO組合調控策略的糖耗較原始策略顯著提高，由315.5 g/L增長到528.8 g/L，增加了67.6%，葡萄糖轉化率也提高了6.7%。以上結果說明，pH-DO組合調控策略主要通過前期增加單位菌體的合成速率，而后期增加對葡萄糖的消耗和單位菌體合成能力，最終提高了WG-608的ε-PL產量。

HUANG等[3]探究了菌體生長和產物合成的pH和DO差異的分析，發現菌體生長和產物合成的最佳pH和DO存在差異，因此建立了2階段pH和DO控制策略，將菌體的生長和產物的合成分為2個階段進行調控，最終使MortierellaalpinaCCFM698的總脂肪酸和二十碳五烯酸的產量提高了10.7%和26.6%，與本文研究結果相似。盡管如此，pH-DO組合調控提高ε-PL產量的原因仍不清楚。

2.5 pH-DO組合調控發酵提高產量機制初探

2.5.1 pH-DO組合策略對ε-PL合成途徑的關鍵酶活性的影響

2.4中分析了2種策略的基本發酵參數的差異，發現經pH-DO組合調控策略，WG-608對底物消耗顯著增加，推測該策略可能通過影響ε-PL的合成代謝，提高了對底物的攝取和利用。L-lys是ε-PL合成途徑中的唯一前體，據報道，用于L-賴氨酸合成的碳骨架主要通過糖酵解途徑、回補反應、磷酸戊糖(pentose phosphate, PP)途徑和三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環提供。因此，對不同發酵時期的4種關鍵酶，PEPC、G6PDH、CS、AK的活性進行檢測和分析，以進一步了解pH-DO組合調節對ε-PL合成和細胞生長的影響。

G6PDH是糖酵解途徑進入磷酸戊糖途徑(PP途徑)的關鍵限速酶，其活性決定了PP途徑代謝通量的大小。由圖4-a可知G6PDH的活性在48 h顯著提高，在其余時段也相對更高，這與2.4中在DO 40%期間比生長速率顯著提高一致。說明在pH-DO調控策略下，流入PP途徑的碳通量明顯增加，為WG608菌體的生長與L-lys的合成提供了更多的戊糖和NADPH。對胞內NADPH水平的檢測也印證了這一推測(圖5-a)。由于在pH-DO組合調控策略下細胞生長更好，PP途徑的增強似乎是一種對細胞生長需求的響應。

a-G6PDH；b- PEPC；c-CS；d- AK；e-PLS圖4 pH-DO組合策略與恒定pH策略下關鍵酶活性的比較Fig.4 Comparison of key enzyme activities of metabolic pathways with pH-DO strategy and constant pH strategy

TCA循環是能量代謝的中樞，也是細胞提供ATP和FADH2的主要途徑。CS是草酰乙酸進入TCA循環的第一個酶。圖4-c可知，隨發酵的進行，2種策略中的CS的變化趨勢基本一致。96 h后pH-DO策略中的CS活性顯著提高，這可能驅動TCA循環產生更多的 NADH 和 FADH2，并通過呼吸鏈和氧化磷酸化途徑合成更多的ATP。此外，增強的TCA循環可以為L-lys的生物合成提供更多的前體草酰乙酸(oxaloacetic acid, OAA)。TCA循環的許多其他中間代謝物，如檸檬酸和α-酮戊二酸，也是碳水化合物、脂質或氨基酸生物合成的重要前體?？傊?，pH-DO策略增強了TCA循環的代謝通量，為快速合成ε-PL和菌體量補充了足夠的能量和前體。

回補反應是PPC(PEP+CO2+ADP→OAA)補充OAA消耗的另一個重要途徑。從圖4-b可以看出，pH-DO組合調控策略中，PPC的活性高于對照組，可以為L-lys的合成回補更多的OAA前體。AK是L-賴氨酸生物合成中的關鍵酶。96 h后pH-DO策略中的AK活性也明顯更高(圖4-d)，表明pH-DO的組合調節明顯增強了L-賴氨酸合成途徑的代謝通量，從而促進了L-lys和ε-PL的合成。

PLS在2種發酵工藝中的變化趨勢較為一致，在96 h前逐漸升高至最大值，隨后開始降低。然而，pH-DO組合調控策略的發酵后期酶活力仍保持著相對較高的活力，這與2.4中產物比合成速率的趨勢較為一致，PLS在后期保持著較高水平的酶活力，這可能是pH-DO策略下發酵后期的比合成速率更高的原因。以上結果表明，經過pH-DO組合調控策略通過增強WG-608在整個發酵過程中的代謝活力和碳代謝通量，促進細胞攝取了更多的底物，以提高ε-PL的產量。

2.5.2 pH-DO組合策略對胞內輔因子的影響

大量研究證明，NAD(P)H是胞內氧化還原反應的重要輔因子，有利于胞內氧化還原的平衡，促進細胞的生長和NAD(P)H依賴性產物的合成，而1分子的L-lys的合成就需要消耗4當量的NADPH[25]。此外，PLS在利用前體L-lys合成ε-PL的過程中需要消耗大量ATP，且高濃度的ATP可以激活PLS的活性[16]。因此，胞內輔因子的濃度對L-lys與ε-PL的合成具有很大影響。在2.5.1的結果中，通過檢測代謝途徑的關鍵酶活性，推測pH-DO組合策略可能增大了碳代謝通量，但其對胞內輔因子帶來的影響，還需進一步評估。

大多數胞內ATP是通過呼吸鏈和氧化磷酸化產生的。由圖5-a的電子傳遞鏈強度檢測結果可以發現，pH-DO組合調控策略的電子傳遞能力更高，基本達到極顯著水平(P<0.01)，電子傳遞過程耦合了ATP的形成，表明ATP的合成能力在pH-DO策略中也被增強了。由圖5-b中可知，pH-DO組合調控策略中的胞內ATP濃度在整個發酵過程中呈下降的趨勢。而在恒定發酵過程中，ATP在前96 h下降，但96 h后卻開始積累。同時，96 h后，pH-DO組合調控策略中的胞內ATP濃度顯著低于對照組，這與預期截然相反。結合PLS活性在96 h 后仍保持著較高水平的情況，推測由于PLS的活性增強，大量合成的ε-PL增加了胞內ATP的消耗，以致最終胞內ATP濃度較低。

a-電子呼吸鏈；b-ATP；c-NADH；d-NAD+/NADH；e-NADPH；f-NADP+/NADPH圖5 發酵過程中生理參數比較Fig.5 Comparison of Physiological Parameters in Fermentation Processes

如圖5-c和圖5-d所示，2種策略中的胞內NADH水平呈波動變化，且pH-DO組合調控策略中的NADH水平基本高于對照。類似，NAD+/NADH的比值略微高于對照，說明pH-DO策略提高了NADH的利用率。pH-DO組合調控策略中NADPH水平在48和96 h時高于對照組，而在168和240 h低于對照，而NADPH的利用率(NADP+/NADPH)與上述結果恰恰相反。結合2.4的結果，推測雖然pH-DO調控策略增強了NADPH的供應量，但由于發酵后期NADPH被大量用于L-lys的合成，導致胞內實際NADPH水平下降。

綜合上述結果，可以發現pH-DO組合調控策略在提高胞內ATP、NADH和NADPH合成代謝的同時，也增強了其分解代謝?？偟膩碚f，經pH-DO調控，胞內總體代謝活力更強，為ε-PL和菌體的合成提供了更多的前體或中間代謝物。

3 結論

本研究表明，根據ε-PL高產菌S.albulusWG-608對發酵條件的需求，在發酵的不同階段對pH和DO進行不同控制，可以顯著提高S.albulusWG-608的ε-PL合成能力。采用新建立的pH-DO組合調控策略進行240 h的補料分批發酵后，WG-608的ε-PL產量和平均比合成速率達到68.77 g/L和2.33 d-1，比對照組(48.19 g/L和2.08 d-1)分別提高了28.33%和12.02%。進一步探究表明，該策略通過增強中心碳代謝途徑、L-lys與ε-PL合成途徑關鍵酶活性，增強WG-608對底物的攝取能力以及底物朝向ε-PL的代謝通量，最終提高了ε-PL的產量與比合成速率。胞內輔因子NADH、ATP與NADPH的合成增強，為L-lys與ε-PL的合成提供了足夠的還原力和能量。本研究所獲得的結果有助于ε-PL的大規模工業化生產。此外，由于pH-DO組合調控策略下ε-PL大量合成，促使游離胞內輔因子(ATP和NADPH)的含量大幅降低，有可能出現供不應求的狀態。因此，后期可以考慮利用代謝工程手段提高胞內輔因子的供應量和利用率，以期進一步提高小白鏈霉菌ε-PL的生產效率。