原生質體融合結合基因編輯技術顯著提高釀酒酵母2-苯乙醇產量

林路成，徐志偉，張建澤，單玉棟，肖峰，徐浩，李芩萍，易蒲紅，汪琨*，朱廷恒,2*

1(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州，310014)2(中國農業大學 有機循環研究院(蘇州)，江蘇 蘇州，215000)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)是一種芳香族化合物，廣泛用于食品和化妝品行業。2-PE主要通過化學合成生產，但此法會產生有毒副產物。利用微生物轉化進行天然2-PE的生產受到了廣泛關注[1]。其中，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是最主要的生產菌株。釀酒酵母通過莽草酸途徑(從頭合成)和艾氏途徑合成2-PE[2]。最近研究表明通過強化釀酒酵母莽草酸途徑構建的工程菌株JM26產2-PE達643 mg/L[3]。然而，從頭途徑合成2-PE產量低，要實現工業化生產，仍然面臨著代謝工程方面的巨大挑戰[4]。當L-苯丙氨酸(L-Phe)是培養基中唯一的氮源時，2-PE主要通過艾氏途徑合成。L-Phe由芳香族氨基酸氨基轉移酶Aro9催化生成苯丙酮酸，然后通過苯丙酮酸脫羧酶Aro10脫羧為苯乙醛，再由醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)還原為2-PE[5]，2-PE的工業生產主要依賴于該途徑。

為了提高釀酒酵母的2-PE產量，可用誘變育種、基因組改組、基因工程和基因編輯等方法[2,6]。這些方法在菌株改良的初始階段有一定效果，尤其是在產量較低的菌株中。釀酒酵母S288C中過量表達轉氨酶ARO8和苯丙酮酸脫羧酶ARO10后，2-PE產量達到2.61 g/L[7]。多個相關基因組裝構建的釀酒酵母菌株YS58在5 L發酵罐中的2-PE產量達到6.3 g/L[8]。我們前期對釀酒酵母CWY132菌株進行了研究，通過優化培養條件，2-PE產量達到3.52 g/L[9]，發酵罐小試其產量達4.1 g/L[10]。以糖蜜為碳源，進一步利用液-液兩相的分批補料發酵及工藝進行轉化，2-PE產量最高達到9.03 g/L[11]。

當產量達到一定水平時，2-PE對酵母細胞的毒性便成了限制產量的瓶頸。此外，釀酒酵母在轉化2-PE的過程中會產生較多的副產物乙醇，從而與2-PE產生協同抑制效應[12]。通過原位產物回收技術，2-PE的產量從2.28 g/L增加到5.14 g/L[13]。然而，去除回收殘留有機溶劑存在困難，限制了其應用[2]。因此，提高菌株對2-PE的耐受性是進一步提高產量的潛在途徑。釀酒酵母菌株的耐受性是由多基因控制的復雜綜合性狀，通過隨機誘變或基因工程提高菌株耐受性的策略相對來說效率較低。因此，有必要將傳統方法和基因工程方法相結合來改良菌株。

我國釀酒業高度發達，酵母菌株的多樣性非常豐富，是重要的資源寶庫。例如，在制備茅臺酒時，釀酒酵母在高溫、高酸和高乙醇濃度等多種應激因素的環境中生長。在制曲過程中，溫度達60 ℃，pH值在2.0左右，乙醇體積分數達82%以上[14]。生長在這種特殊環境中的微生物區系具有獨特的物理和化學特征，可以從中篩選出耐受性更好的菌株。例如，篩選出的耐熱脅迫釀酒酵母菌株可耐受2.5 g/L的2-PE，顯著高于不耐熱菌株(1 g/L)，相應地，2-PE產量達4.5 g/L[15]。

在獲得具有不同優良性狀的多個酵母菌株后，有必要將這些性狀聚合到一個酵母菌株中。原生質體融合顯示出高效的潛力，可以在不需要了解具體機制的情況下實現。該方法已用于改善釀酒酵母的乙醇生產性能，融合菌株同時獲得雙親的發酵性能和乙醇耐受性[16]。釀酒酵母和巴斯德酵母菌的融合菌株SP2-18的乙醇產量為74.65 g/L，而親本的乙醇產量分別為33.12和65.44 g/L[17]。釀酒酵母和乙醇假絲酵母的融合菌株R6在生產高品質低醇蘋果酒方面具有巨大潛力[18]。這些研究表明，原生質體融合是釀酒酵母菌株改良的有效策略。

CRISPR/Cas9技術已成功應用于釀酒酵母的基因操作，DI-CRISPR(Delta整合的CRISPR)可以實現外源基因的高拷貝整合[19]。研究表明釀酒酵母cdc25(Ras家族鳥嘌呤核苷酸交換因子)的點突變菌株(W1416C)可以在39 ℃高溫下有效地進行乙醇發酵，產量為6 g/L[20]。但是cdc25突變對2-PE產量是否有促進作用尚不明確。在本研究中，我們篩選出3株耐受性好、2-PE產量高的釀酒酵母菌株，經原生質體融合后，進一步利用DI-CRISPR對融合菌株進行研究，探索cdc25及艾氏途徑關鍵酶基因對2-PE產量的影響。構建策略見電子增強出版附件1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基和試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母CWY132、釀酒酵母NGER，諾睿特生物公司；LSC-1(CICC 33068)、LSC-2(CICC 1005)和LSC-3(CICC 32304)，中國工業微生物保藏中心；S.C-1分離于浙江紹興黃酒釀造樣品。其他各菌株及來源見電子增強出版附件2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

1.1.2 試劑及其配制方法

NaH2PO4· 2H2O、山梨醇、β-巰基乙醇、EDTA-2 Na、酵母基因組DNA提取試劑盒、蝸牛酶，上海生工生物工程有限公司；崩潰酶，美國Sigma-Aldrich公司；cDNA轉錄試劑盒、Power SYBR?green PCR Master Mix試劑，美國Thermo Fisher Scientific公司。

0.2 mol/L PB溶液：87.7 mL 0.2 mol/L NaH2PO4· 2H2O和12.3 mL 0.2 mol/L Na2HPO4·2H2O，pH 6.0。

PBS溶液：50 mL 0.2 mol/L PB溶液和450 mL 1 mol/L山梨醇溶液，pH 6.0。

細胞壁裂解預處理液：取0.2 mL β-巰基乙醇和2.233 g EDTA-2Na，溶解于PBS中，定容至100 mL，0.22 μm過濾器過濾。

1.1.3 培養基

YPD培養基用于菌株活化和分離。YPDS培養基(原生質體再生培養基)：YPD中添加182.17 g/L山梨醇。

2-PE發酵培養基(g/L)：葡萄糖 30，MgSO40.5，K3PO45，酵母提取物 1.5，L-Phe 5。

1.2 酵母菌株的分離與鑒定

樣品進行稀釋后涂布在YPD平板上于30 ℃培養48 h，通過菌落形態和顯微觀察選擇酵母菌，分離純化后進行分子鑒定。酵母基因組DNA用試劑盒提取。ITS(Internal Transcribed Spacer)的全序列用引物對Seq-F(5′-CGCCAGGTTTTCACAGAC-3′)/Seq-R(5′-GAGCGATACATTTCACAGC-3′)進行PCR擴增。將ITS序列與GenBank核酸數據庫進行相似性分析，用MEGA7.0軟件進行系統發育樹分析。

1.3 2-PE生長曲線及耐高溫性的測定

用光密度法(OD600)測定各菌株的生長曲線。用梯度稀釋滴板實驗分析2-PE的耐受性，將酵母細胞濃度調整為107個細胞/mL，取5 μL稀釋液滴在含有2-PE的YPD平板上培養。

1.4 原生質體制備、融合、再生

通過離心收集新鮮培養的酵母細胞，在PBS溶液中與4 mL酶液混合，酶液由70 mg/mL蝸牛酶和2 mg/mL崩潰酶組成，30 ℃、60 r/min下酶解2 h。利用雙親滅活的方法進行細胞融合和選擇，使滅活效率≥95%。離心收集原生質體，PBS洗滌并懸浮，一親本的懸浮液置于25 W紫外線燈下照射，涂布于YPDS平板，在30 ℃培養，另一親本在60 ℃水浴中處理。處理后的雙親原生質體濃度調整為107/mL，各取0.5 mL混合并離心后懸浮在1 mL 40%(質量分數) 聚乙二醇6000，30 ℃避光培養25 min。離心收集原生質體，PBS稀釋后涂布于YPDS板在30 ℃培養觀察，等待融合子出現。

1.5 融合子鑒定

細胞DNA含量按照公式(1)計算[18]：

(1)

式中：Ki，稀釋因子；E，1個紫外吸收單位代表DNA質量濃度等于50 μg/mL。

1.6 使用DI-CRISPR構建艾氏途徑和cdc25突變體中的基因過度表達

融合菌株RH2-16為宿主，將艾氏途徑中關鍵酶基因ARO8、ARO10和ADH2分別由組成性啟動子磷酸甘油酸激酶驅動表達，整合在釀酒酵母基因組的delta位點。將這3個基因組合，獲得7種類型菌株：↑ARO8，↑ARO10，↑ADH2，↑ARO8+↑ARO10，↑ARO8+↑ADH2，↑ARO10+↑ADH2和↑ARO8+↑ARO10+↑ADH2(↑表示超表達)。DI-CRISPR基因編輯參考文獻[20]進行。通過LiAc介導的方法轉化酵母，利用構建特異性引物(正向引物位于目標基因的開放閱讀框內，反向引物位于delta位點)對轉化子進行了PCR鑒定。通過PCR引入cdc25基因的點突變，并如上所述構建突變株。引物見電子版增強出版附件3(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

1.7 qRT-PCR分析

使用cDNA轉錄試劑盒進行轉錄，以1 μg總RNA為模板合成cDNA。以ACT1基因作為內參，進行qRT-PCR，在7500 Real-Time PCR系統使用Power SYBR?green PCR Master Mix試劑進行擴增。引物見電子版增強出版附件3(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

1.8 2-PE發酵生產及效價測定

對數生長期的酵母細胞以10%(體積分數)的接種量添加到含有5 g/LL-Phe的50 mL發酵培養基中，30 ℃，200 r/min發酵36 h。發酵液離心后取上清液用氣相色譜測定2-PE的濃度。向樣品中加入200 μL內標溶液(甲基異丁基甲醇1 g/L水溶液)，并混合500 μL乙酸乙酯。取上層有機相測量(島津GC 2014)。獨立進行3次實驗，每個處理至少3個重復。

1.9 數據處理

實驗重復3次，使用GraphPad作圖及數據分析。

2 結果與討論

2.1 酵母菌分離鑒定

共篩選獲得25株酵母菌株(電子版增強出版附件2)。通過菌落形態分析、顯微觀察和分子鑒定，鑒定出19株釀酒酵母、2株Wickerhamomycesanomalus、2株Pichiapastoris、1株Torulasporadelbrueckii和1株Candidaanglica。根據ITS序列分析，工業菌株CWY132與從源于四川的樣品中分離的SC001、SC003和SC009之間相似性高，與GenBank中的釀酒酵母JYC2558菌株遺傳關系接近。來自CICC的LSC-1和來自甘肅的SC008顯示出高度同源性，而從浙江衢州分離的S.C-1與紹興分離的S.C-2遺傳上并不相近，親緣關系見系統發育樹(電子版增強出版附件4，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。

2.2 分離菌株的性狀測定

以工業菌株CWY132為參考，對分離的酵母菌株從2-PE產量、2-PE耐受性及高溫耐受性進行評價。結果表明，不同菌株的2-PE產量差異顯著。釀酒酵母的2-PE合成能力高于其他酵母菌。有6株酵母的2-PE產量在1～2 g/L，4株低于1 g/L。5株釀酒酵母(LSC-1、SC002、SC003、SC004和SC005)的2-PE產量穩定在3.4 g/L以上，高于工業菌株CWY132(電子版增強出版附件5，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)，表明釀酒酵母在2-PE的合成中具有天然優勢。上述5株2-PE產量較高的釀酒酵母生長速率顯著高于CWY132，其中LSC-1生長速率最高，其2-PE產量也高。2-PE耐受性測定發現在2.80 g/L時，NGER、S.C-1和LSC-1的生長明顯優于CWY132。在3.60 g/L時，NGER生長最好(圖1-a)。高溫耐受性測定發現，在40 ℃時，CWY132的生長受到顯著抑制，而其他3株仍能生長。在41 ℃培養48 h后，只有S.C-1生長(圖1-b)，表明S.C-1能夠抵抗高溫脅迫。綜上，以LSC-1、NGER和S.C-1這3株菌作為原生質體融合的親本菌株。

a-不同濃度2-PE脅迫；b-高溫脅迫圖1 釀酒酵母菌株在2-PE和高溫脅迫下的耐受性測定Fig.1 Tolerance test of S.cerevisiae strains under stress of 2-PE and high temperature

2.3 第一輪原生質體融合獲得耐受性增強的融合子

以NGER和S.C-1為親本進行第一輪原生質體融合，共獲得20個融合子，其中RH1-4與NGER生長性能相近，但在2-PE質量濃度為3.60 g/L時，耐受性提高(圖2-a)。在40 ℃下生長性能比較發現，RH1-4與S.C-1耐熱性相近，表明其從親本中同時獲得了高溫和2-PE耐受性(圖2-b)。RH1-4的2-PE產量為2.11 g/L，比親本分別增加了11%和24%(圖2-c)。

a-在3.6 g/L 2-PE脅迫下生長；b-在40 ℃下生長；c-2-PE產量圖2 第一輪原生質體融合子篩選Fig.2 Screening of strains with 2-PE tolerance from the first round of protoplast fusants注：*表示差異顯著性(P<0.05)(下同)

2.4 第二輪原生質體融合獲得2-PE高產融合子

將RH1-4和LSC-1作為親本進行第二輪原生質體融合，共獲得約100個融合菌株，根據高溫耐受性分為A至C級。A：接近LSC-1水平；B：LSC-1和RH1-4之間；C：接近RH1-4的水平(圖3-a)。C級融合子中只有幾株的2-PE產量接近RH1-4(2.11 g/L)，其余都低于RH1-4，接近第一輪親本SC-1的產量1.67 g/L。B級融合子的耐受性沒有達到RH1-4的預期水平，但它們的產量相對較高。其中一株融合子RH2-16的2-PE為4.05 g/L，比親本LSC-1增加18.8%。另一株RH2-26的產量達3.96 g/L，增加了16.5%(圖3-b)。

a-40 ℃脅迫下；b-2-PE產量測定圖3 在原生質體融合的第二輪中篩選2-PE產量 和耐受性增加的融合子Fig.3 Screening of fusants with increased 2-PE titre and tolerance in the second round of protoplast fusion

2.5 融合子的遺傳穩定性和2-PE產量測定

細胞DNA含量測定結果(每107個細胞中)：親本NGER、SC-1和LSC-1的分別為0.71、0.67和1.08 μg；融合子RH1-4和RH2-16的分別為1.05和1.49 μg，符合雜合子的特征。融合子連續傳代后檢測2-PE和乙醇產量，發現各菌株連續培養10代、20代、30代后2-PE產量基本穩定(電子版增強出版附件6，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)，說明融合子遺傳穩定性良好。RH2-16的最高產量為4.31 g/L，5代的平均產量為4.04 g/L。親本和融合子菌株的2-PE產量、耐性等性狀的綜合比較見電子版增強出版附件7(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031898)。此外發現，在最適生長溫度(30 ℃)下2-PE產量最高，即使是耐熱菌株(電子版增強出版附件8)，有的高產2-PE菌株也具有較好的乙醇生產能力(電子版增強出版附件6和附件8)。

2.6 cdc25突變株表型測定及基因表達分析

cdc25W1416C和cdc25N1393T的2個點突變分別被引入融合子菌株RH2-16。結果表明，cdc25W1416C在40 ℃、105CFU/mL時生長較好，而野生型幾乎不能生長(圖4-a)。cdc25W1416C在3.0 g/L的2-PE平板上生長優于野生型(圖4-b)，表明該突變株提高了綜合耐受性。cdc25N1393T未發現上述表型。

qRT-PCR技術分析了RH2-16、cdc25W1416C、CWY132、NGER和S.C-1菌株的耐熱相關基因(hsp12、hsp104)、乙醇脫氫酶基因(adh2)和艾氏途徑分支途徑酶基因(ald3)的轉錄水平。結果表明，與RH2-16相比，RH2-16(cdc25W1416C)中hsp104轉錄水平增加了5倍，S.C-1中hsp12增加了近9倍(圖4-c)。cdc25W1416C的2-PE產量增加8%(圖4-d)。說明cdc25W1416C點突變可有效提高耐熱性，增加2-PE產量。

a-40 ℃脅迫；b-2-PE脅迫；c-基因轉錄水平差異分析；d-2-PE產量測定圖4 cdc25W1416C突變株的表型鑒定Fig.4 Phenotype identification of cdc25W1416C mutant strains

2.7 艾氏途徑相關基因過表達對2-PE合成的影響

選擇芳香族氨基酸氨基轉移酶(ARO8)、苯丙酮酸脫羧酶(ARO10)和醇脫氫酶(ADH2)基因，構建了7株過表達單基因或組合的菌株，分別記為↑ADH2，↑ARO8，↑ARO10，↑ARO8+↑ARO10，↑ARO8+↑ADH2，↑ARO10+↑ADH2和↑ARO8+↑ARO10+↑ADH2(圖5-a)。測定2-PE產量發現，RH2-16為3.92 g/L，RH2-16 ↑ADH2和RH2-16↑ARO8+↑ARO10分別為3.91和3.88 g/L。其他菌株產量下降，其中RH2-16↑ARO10為3.49 g/L，降低了12%(圖5-b)。結果表明，該策略不能有效提高菌株RH2-16的2-PE產量。

3 結論與討論

微生物合成2-PE等天然代謝物的能力，菌株之間的差異很大。篩選優良的菌株并采取有效的改良措施，是工業化生產開發的途徑[21]。我國酵母菌株資源豐富，分離獲得綜合性狀優良的菌株用于2-PE生產的潛能很大，本文研究結果證實了這一點。

a-特異性引物PCR鑒定；b-2-PE產量測定圖5 過表達艾氏途徑基因各菌株的分子鑒定和2-PE產量Fig.5 Molecular characterization of strains overexpressing Ehrlich pathway genes and determination of 2-PE titre

原生質體融合可以繞過有性繁殖的障礙，通過重組基因組DNA的大片段，獲得具有親本遺傳特征的穩定“雜交”細胞。此外，在細胞融合過程中，可以有效地從親本基因組或突變的隨機組合中獲得新的正向遺傳變異。釀酒酵母菌株LSC-1、NGER和SC-1經兩輪原生質體融合后，優良性狀已成功整合到融合子菌株中，其2-PE產量顯著高于工業菌株CWY132，產量提高主要歸因于其耐受性的增強。研究表明，耐熱性是其他脅迫耐受性的良好指標，耐熱菌株可以幫助減少2-PE的毒性作用[22]。耐高溫的菌株對氧化和滲透脅迫也有更強的抵抗力[23]。耐熱菌株Ye9-612在30～40 ℃下具有恒定的生長速率，但非耐熱菌株Ye9-596(同一親本的后代)則受到嚴重影響[15]，本文研究結果與這些發現一致。

盡管一些研究表明，在艾氏途徑中超表達與2-PE合成相關的基因可以提高產量[2,5-6]，但在本研究中，用相同的策略未能提高融合子RH2-16的2-PE產量?？赡苁荝H2-16的2-PE產量相對較高，進一步提高對酵母細胞產生更強的毒性。此結果與之前報道的類似，即4.0 g/L 2-PE可以完全抑制所試酵母細胞的生長[21]。

綜上，從自然資源中篩選優良性狀的菌株做親本，通過原生質體融合是一種有效的酵母育種方法。與需要突變文庫構建和遞歸融合的基因組改組相比，該法更簡單、高效。對具有良好抗逆性的酵母菌株進行轉錄組分析，有助于理解多重耐受機制[24]。RH2-16可以作為生產2-PE的工業菌株，也可以作為分析2-PE合成機理或用于育種的優良候選菌株。