黑曲霉脂肪酶Lip A的異源表達與酶學性質分析

王雅琪，凡林林，李文瑤，李弘軒，杜麗平,2，王洪，馬立娟,2*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457) 3(中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室，四川 宜賓，644000)

脂肪酶(EC3.1.1.3)可以催化長鏈?；视驮谥|-水界面分解為二?；视王?、單甘油酯、甘油和游離脂肪酸[1-2]。目前研究發現脂肪酶還可以催化酯合成、酰胺化、醇解、酯交換等一系列反應[3]，在食品工業、紙漿工業、化妝品行業以及精細化學品加工中有著廣泛的應用。

近年來，真菌脂肪酶得到了廣泛關注，已有不少真菌脂肪酶如來源于南極假絲酵母的脂肪酶B(Novozyme 435)和來源于米黑根毛霉的脂肪酶(Novozyme Lipozyme RMIM)等實現了商業化，并被應用于食品釀造行業中[4]。例如，王丹丹等[5]研究了Novozym 435在兩相體系中合成白酒中四大酯類物質的能力，結果表明己酸乙酯在有機相合成轉化率最高，丁酸乙酯在水相合成轉化率最高。絲狀真菌黑曲霉因其獨特的食品安全特性和優良的蛋白質分泌系統和修飾能力，已成為食品酶生產的重要宿主之一[6]。2007年，黑曲霉CBS513.88基因組被完全解析并公布[7]，生物信息學預測發現其基因組中存在大量編碼脂肪酶基因的開放閱讀框。此后，黑曲霉脂肪酶得到了廣泛的關注。2009年，SHU等[8-9]首次克隆得到黑曲霉F044脂肪酶基因并實現在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源表達。2020年，XING等[10]克隆黑曲霉胞外脂肪酶基因EXANL1在畢赤酵母中異源表達，研究了其結構與功能之間的關系。研究表明，黑曲霉脂肪酶種類繁多且其三維結構和催化特性也有著顯著的差異[11-13]，因此，研究不同類型黑曲霉脂肪酶的催化特性對其在食品工業中的應用具有非常重要的指導意義。

脂肪酸乙酯是白酒中重要的風味化合物[14]，白酒中脂肪酸乙酯的合成主要依賴于羧酸水解酶家族、脂肪酶、酯酶和角質酶[15]。目前，關于脂肪酶催化酯化反應的研究主要集中在有機相體系中進行[16]，其中少數酶在水相條件下可以催化酯的合成[17]。2020年，XU等[18]報道了一種來源于Monascuspurpureus的羧酸酯酶在水相體系中催化脂肪酸乙酯的合成。本實驗室早期的研究中發現黑曲霉可以顯著提高白酒中脂肪酸乙酯的含量，因此對黑曲霉進行了轉錄組分析，本研究根據黑曲霉基因組注釋，從中挑選出一個轉錄水平較高的脂肪酶基因LipA進行了生物信息學分析，成熟的脂肪酶Lip A由279個氨基酸組成，之后對該酶的酶學性質和酯化特性進行深入研究，為其在食品工業中得到有效應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌株

EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliRosetta(DE3)、質粒pET-28a(+)，均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

限制性內切酶，大連寶生物工程有限公司；2×TaqMaster Mix DNA聚合酶、同源重組酶、質粒提取試劑盒，Vazyme公司；IPTG、卡那霉素、氯霉素、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，Solarbio公司；Ni柱、PD-10脫鹽柱，GE公司；10 kDa超濾管，Millipore公司；對硝基苯酚丁酸酯等系列底物，Sigma公司；其他生化試劑均為國產分析純，天津市江天化工技術有限公司。

1.3 重組菌株的構建及誘導表達

根據NCBI數據庫中脂肪酶的氨基酸序列，將黑曲霉脂肪酶成熟蛋白編碼序列(去掉信號肽及內含子)進行合成并根據大腸桿菌表達系統進行密碼子優化。將合成后的片段以上、下游引物5′-TAAGAAGGAGATATACCATGGCGCCGACCCCGCTGGATG-3′和5′-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGCAGC-3′進行PCR擴增后通過同源重組與載體pET-28a(+)連接，重組產物轉化至E.coliDH5α中，提取質粒并測序驗證成功后，將重組質粒轉化至E.coliRosetta(DE3)中進行誘導表達。將重組菌株在37 ℃、220 r/min條件下培養至OD600=0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG溶液，在25 ℃、220 r/min條件下誘導發酵20 h后，離心收集菌體，使用pH 7.4 PBS洗滌菌體后重懸菌體。使用高壓均質機破碎菌體收集上清液即為粗酶液，將粗酶液經Ni柱進行洗脫，洗脫后的重組蛋白使用PD-10和超濾管去除咪唑分子，蛋白質濃度測定使用Bradford試劑盒測定。

1.4 脂肪酶Lip A的酶活力測定及氣相檢測

1.4.1 脂肪酶活力測定

參照文獻[19]的方法進行。500 μL反應體系中包括400 μL的Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L、pH 8.0)、50 μL的pNPB(10 mmol/L)和50 μL酶液，37 ℃下反應5 min，500 μL無水乙醇終止反應，410 nm下測量吸光度值。酶活力定義：在一定溫度和pH下，1 min內催化生成1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為一個活力單位(U)。

1.4.2 氣相色譜的檢測

氣相色譜檢測條件：色譜柱為HP-INNOWax(30 m×0.32 mm×0.5 μm)，檢測器為氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector, FID)。進樣器溫度260 ℃，進樣量1.0 μL，檢測器溫度300 ℃。柱溫在65 ℃保持5 min，以5 ℃/min上升到150 ℃，保持2 min，共24 min。載氣N2，色譜柱流速0.8 mL/min。

1.5 脂肪酶Lip A的生化特性分析

按照1.4.1的方法，對脂肪酶進行生化特性分析，每個反應平行3次，以最高酶活力定義為100%，計算相對酶活力。

(1)最適溫度和熱穩定性

在不同溫度(20～70 ℃)測定重組脂肪酶的酶活力，將酶液分別放置在不同溫度(40～70 ℃)保溫，間隔2 h取樣，以未經處理的酶的酶活力定義為100%，測定殘余酶活力。

(2)最適pH和pH穩定性

在不同pH條件下(pH 5.0～11.0)測定重組脂肪酶的酶活力，將酶液分別置于pH 4.0～10.0的不同緩沖液中，于4 ℃放置1 h后，測定殘留酶活力。所用緩沖液為：20 mmol/L Na3PO4緩沖液(pH 4.0～6.0)、20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～7.0)、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～9.0)、20 mmol/L甘氨酸-KOH緩沖液(pH 9.0～11.0)。

(3)金屬離子和螯合劑對酶活力的影響

在反應體系中加入不同金屬離子(Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Li2+)和金屬螯合劑至終濃度為1和10 mmol/L，以未處理酶的酶活力為100%，計算相對酶活力。

(4)有機試劑耐受性

將酶液與有機試劑按照9∶1(體積比)混合均勻后，置于4 ℃放置1 h后，對照組使用緩沖液代替有機試劑，以未處理酶的酶活力為100%，計算相對酶活力。

(5)底物特異性及動力學參數測定

分別配制10 mmol/L不同碳鏈長度的對硝基苯酚酯(p-nitrophenyl,pNP)為底物，測量脂肪酶的酶活力。使用異丙醇配制不同濃度的底物，測定脂肪酶在不同濃度下的酶活力，利用Graphpad Prime 7.0 軟件中的Michaelis-Menten方程擬合得到不同底物的動力學參數[20]。

1.6 脂肪酶Lip A酯化乳酸乙酯特性分析

參考文獻[21-22]的方法，乳酸和乙醇濃度分別為0.3和1.2 mol/L，溶劑為PBS，反應體系為5 mL，酶10 mg，40 ℃，搖床轉速200 r/min，反應時間12 h。同時以高溫滅活的脂肪酶Lip A作空白對照離心，取上清液。留作氣相分析。

(1)溫度對酯化反應的影響

低溫下脂肪酶無法發揮應有的催化活性，溫度過高又會使脂肪酶變性而無法進行催化反應，因此找到合適的催化溫度會大大提高乳酸乙酯合成量，按照上述的反應體系，反應溫度在30、40、50、60 ℃操作，計算催化乳酸乙酯生成量。

(2)反應體系中酸醇物質的量比對酯化反應的影響

因為乳酸的成本高于乙醇，同時乳酸的電離系數高，含量過多會使整個體系的pH急劇下降，因此固定乳酸含量，改變乙醇的含量探究酸醇比對酯化反應的影響。按照上述的反應體系，酸醇物質的量比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，計算催化乳酸乙酯生成量。

1.7 脂肪酶生物信息學分析

使用The Lipase Engineering Database(LED，http://www.led.uni-stuttgart.de/)BLAST查詢與脂肪酶Lip A親緣性較近的蛋白序列，使用MEGA 7.0軟件進行系統發育樹分析，采用鄰域連接法(neighbor-joining, NJ)構建系統發育樹。

2 結果與討論

2.1 黑曲霉脂肪酶Lip A表達菌株的構建及其表達純化

構建質粒pET-28a(+)-LipA的結果如圖1-a所示，重組質粒提取驗證如圖1-b所示，重組質粒大小為6 127 bp。重組菌經誘導、菌體破碎以及Ni柱純化后SDS-PAGE結果如圖1-c所示，目的蛋白條帶在大約27 kDa處出現，蛋白的分子質量大小與理論值一致，采用PD-10去除咪唑小分子，測定純化后的脂肪酶Lip A測定比酶活力為58.31 U/mg，超濾后的脂肪酶Lip A比酶活力為132.4 U/mg，純化倍數為2.27倍。

a-表達質粒pET-28a(+)-LipA圖譜；b-重組質粒(M-Marker； 1-重組質粒6 127 bp)；c-SDS-PAGE分析(M-Protein Marker； 1-重組脂肪酶粗酶液；2-純化流穿液；3-高鹽洗脫液； 4-純化后樣品)圖1 脂肪酶Lip A表達質粒的構建及誘導表達結果分析Fig.1 Construction and induced expression of lipase Lip A

2.2 黑曲霉脂肪酶Lip A的生化性質解析

2.2.1 溫度與pH對脂肪酶Lip A的影響

如圖2-a所示，脂肪酶Lip A最適溫度為50 ℃，且在40～60 ℃下孵育8 h后殘余酶活力均在60%以上(圖2-b)，隨著時間延長，重組酶活力出現顯著下降。當孵育溫度升高至70 ℃時，酶活力下降較快，8 h后其殘余酶活力僅為40%左右(圖2-b)，此時酶的構象在高溫下已經被破壞，導致酶的不可逆變性[23]。

a-最適反應溫度；b-溫度穩定性；c-最適反應pH；d-pH穩定性圖2 溫度和pH對脂肪酶Lip A活性的影響Fig.2 Effect of temperature and pH on the activity of lipase Lip A

如圖2-c所示,脂肪酶Lip A的最適pH為8.0，在pH 6.0～8.0，酶活力保持在70%以上，具有較寬泛的pH適用范圍，當pH>10后，酶活力驟降，表明該酶不適應在極端堿性條件下使用。如圖2-d所示，在pH 4.0的環境下孵育1 h后，重組酶剩余酶活力依然可以保持在60%左右，在pH 5.0出現降低是由于脂肪酶Lip A的等電點在這一范圍，該酶在酸性及弱堿性條件下具有較好的穩定性可能取決于蛋白質的一級結構，環境pH的變化會影響蛋白質中三維結構中離子鍵的改變，從而導致酶的構象發生變化[24]。

2.2.2 金屬離子對脂肪酶Lip A的影響

如表1所示，在1 mmol/L金屬離子條件下，Ca2+和Mg2+對脂肪酶Lip A具有促進作用，其他金屬離子則有不同程度的抑制作用。在10 mmol/L金屬離子條件下，Ca2+對于脂肪酶Lip A的促進作用更加明顯，相較于對照提高了55%。而高濃度的Mg2+對脂肪酶Lip A的酶活力卻由低濃度時的促進作用轉變為抑制作用，其他金屬離子對酶活力的抑制作用也進一步增強，其中Cu2+、Fe3+等最為明顯，重金屬離子作為親電試劑可能與脂肪酶中的氨基酸殘基發生電荷相互作用，改變其構象，從而使脂肪酶變性[25]。

表1 金屬離子及螯合劑對脂肪酶Lip A活性的影響 單位：%

2.2.3 有機試劑對脂肪酶Lip A的影響

對照組用PBS替代有機溶劑，實驗組中酶液與有機溶劑按照9∶1(體積比)混合。如圖3所示，正庚烷、正己烷明顯提高了脂肪酶Lip A的催化活性，正庚烷對該酶活性提高50%左右；醇對脂肪酶Lip A的酶活力基本無明顯影響，其他有機溶劑則呈現出不同的抑制作用。脂肪酶的結構通常由疏水的催化核心和親水的表面構成，其催化活性需要一定極性的溶劑來維持，正庚烷和己烷作為極性溶劑使得蛋白構象發生改變，底物更容易進入催化口袋進行催化反應[26]，然而大多數有機溶劑則會削弱蛋白質的疏水鍵，使酶分子內部斥力增加，造成蛋白質的三級結構延展，最終導致脂肪酶喪失催化活性[27]。由此可見，脂肪酶Lip A可以耐受有機相的環境，為其在有機相中應用奠定了基礎。

圖3 有機試劑對脂肪酶Lip A活性的影響Fig.3 Effect of organic solvents on the activity of lipase Lip A

2.2.4 脂肪酶Lip A底物特異性分析

由圖4可見，脂肪酶Lip A作用于對硝基苯酚乙酸酯(pNP-C2)的水解活性最高，作用于對硝基苯酚月桂酸酯(pNP-C12)和對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNP-C16)的水解活性分別為作用于pNP-C2水解活性的23.04%和9.71%，可見，脂肪酶Lip A偏好于水解中短鏈對硝基苯酚酯，對長鏈底物表現出較低的水解活性。

圖4 脂肪酶Lip A的底物特異性Fig.4 Substrate specificity of lipase Lip A

米氏常數Km代表酶與底物的親和力，Km越小表明酶與底物的親和力最強，以pNP-C2為底物時，該酶的Km為(0.228±0.05) mmol/L(表2)，表明pNP-C2為脂肪酶Lip A的最佳底物，脂肪酶Lip A對C2～C8的對硝基苯酚酯等具有較高水解酶活性，表明該酶更可能為羧酸酯酶，而不是真正的脂肪酶[28-29]。

表2 脂肪酶Lip A動力學參數Table 2 Kinetic parameters of lipase Lip A

2.3 脂肪酶Lip A酯化特性分析

脂肪酶Lip A催化脂肪酸乙酯的研究中發現，脂肪酶Lip A在水相條件下可以催化乳酸和乙醇合成乳酸乙酯。溫度對其催化乳酸和乙醇合成乳酸乙酯的影響結果如圖5-a所示，50 ℃時脂肪酶催化乳酸乙酯合成含量最高，為40.81 mg/L，實驗結果表明脂肪酶Lip A在較低溫度下無法最大程度發揮催化活性，而較高的溫度又會使酶失活，使其蛋白結構發生不可逆性損傷[23]。由圖5-b可知，隨著乙醇濃度的增加，乳酸乙酯生成量逐漸降低，說明乙醇作為一種短鏈醇，同時也作為酶的失活劑，高濃度的乙醇會破壞酶的三維構象，并最終導致酶的催化效率降低。

a-最佳反應溫度；b-最佳酸醇物質的量比圖5 脂肪酶Lip A催化合成乳酸乙酯的最佳反應 溫度和最佳酸醇物質的是比Fig.5 Optimum reaction temperature and substrate molar ratio for the synthesis of ethyl lactate by lipase Lip A

2.4 脂肪酶Lip A系統發育樹的構建

蛋白序列相似性分析是蛋白質研究過程中不可或缺的一步，構建系統進化樹可以快速準確地概括不同生物體間的親緣關系，進而反映進化關系[30]。本研究中利用LED數據庫比對脂肪酶Lip A編碼的氨基酸序列，發現該酶屬于abH23同源家族[29]，abH23同源家族中包含大量不同來源的脂肪酶序列，它們被劃分為4個組(圖6)，脂肪酶Lip A被劃分到Rhizomucormihei組，該酶與來源于米曲霉的二?；视王ッ?BAA12912.1)和來源于粗糙脈孢菌的三?；视王ッ?EAA32130.1)同屬于一個進化分支，表明它們有共同的祖先，并且可能在某些催化特性方面具有相似的性質。

圖6 脂肪酶Lip A與abH23同源家族的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of lipase Lip A and abH23 homologous family

3 結論

本論文成功克隆表達了來源于黑曲霉CBS513.88中具有潛在脂肪酶催化特性的Lip A蛋白，該酶的蛋白分子質量約為27 kDa。酶學性質分析表明，脂肪酶Lip A的最適溫度和pH分別為50 ℃和8.0，且在40～60 ℃和pH 5.0～8.0有較好的穩定性。該酶對有機試劑有較好的耐受性，Ca2+、Mg2+、正庚烷和正己烷對脂肪酶Lip A的水解活性有促進作用，該酶對不同長度碳鏈底物均表現出活性，動力學參數表明其作用于對硝基苯酚乙酸酯時催化活性最高。序列相似性分析結果表明脂肪酶Lip A為abH23同源家族Rhizomucormihei脂肪酶中的一員。此外，該酶可以在水相介質催化乳酸乙酯的合成，這一特性使其在食品加工與釀酒工業中具有一定的應用價值。