抗性糊精對急性潰瘍性結腸炎小鼠的保護作用

秦妮娜，馬志花，張晨一，陸陽，陳立勇,3，朱志勇，李朝蘋

1(山東大學齊魯醫學院，公共衛生學院營養與毒理學系，山東 濟南，250012)2(山東第一醫科大學 公共衛生學院， 山東 濟南，250117)3(山東大學齊魯醫院，臨床營養科，山東 濟南，250063)4(山東省康復醫院，外科，山東 濟南，250109) 5(山東第一醫科大學附屬省立醫院，臨床營養科，山東 濟南，250021)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種病因未明的非特異性、反復發作的腸道疾病，是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的一種，臨床以腹痛、腹瀉、血便和黏液膿血便為主要癥狀[1]。UC最初見于西歐和北美，在亞洲等國家鮮有報道；但由于飲食習慣、生活節奏等改變，中國UC的發病率快速增長，現已成為我國消化系統常見疾病之一[2]。UC的發病機制尚未明確，但最新的研究表明，遺傳易感性、環境因素、免疫應答異常、腸道微生態紊亂等與其發生和發展有關[3]。飲食既是一種重要的環境因素，又是影響腸道微生物組成的重要因素，在UC發生、發展及綜合管理過程中起著重要作用。飲食因素，特別是膳食纖維攝入量，與已確診UC患者的臨床發作風險有關[4]。

抗性糊精(resistant dextrin，RD)是一種以淀粉為原料、經過一系列加工純化而成的低分子水溶性膳食纖維。因其具有較低黏度、良好的水溶性和抗消化酶解等特性，被廣泛應用于食品加工及功能食品的研發等領域[5]。近年來，越來越多的研究發現，抗性糊精具有控制體重、調節血糖、降低血脂、促進微量元素吸收和調節腸道菌群等功能[6-8]，這與其不易被胃和小腸消化吸收，能夠進入結腸被結腸微生物發酵利用有關。WANG等[9]使用抗性麥芽糊精干預潰瘍性結腸炎小鼠，發現抗性麥芽糊精可降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-1β(interleukin -1β，IL-1β)和IL-17的水平并減輕腸道炎癥。然而關于抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠腸黏膜屏障及腸道菌群影響的研究較少。

本研究以雄性C57BL/6 J小鼠為對象，采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導建立急性潰瘍性結腸炎小鼠模型，探討抗性糊精對小鼠腸道損傷的保護作用，并從腸道菌群的角度分析可能的機制。旨在為IBD的防治提供營養學思路，為進一步拓寬抗性糊精應用范圍提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

抗性糊精，由山東百龍創園生物科技股份有限公司提供，其主要組分如下：膳食纖維92.8%，蛋白質0.8%，脂肪1.8%，水分4.6%；DSS(分子質量36～50 kDa)，美國MP；糞便隱血檢測試劑盒(聯苯胺法)，北京雷根生物；小鼠血清TNF-α、IL-6、IL -1β檢測試劑盒，北京索萊寶；多聚甲醛組織固定液、蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色試劑盒和免疫組化檢測試劑盒，武漢賽維爾生物；兔抗黏蛋白2(mucin 2，MUC2)、閉鎖蛋白(Occludin)、閉合蛋白-1(Claudin-1)和閉鎖小帶-1(zonula occludens-1，ZO-1)，武漢三鷹；山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標記的二抗，北京中杉金橋。

1.2 主要儀器與設備

BSA224S-CW 電子天平，北京賽多利斯；5430R 離心機，德國Eppendorf；AS全自動組織脫水機、AS自動切片染色機，美國Thermo Fisher Scientific；EC350-1包埋機、HM325切片機，德國Microm；光學顯微鏡，日本Olympus；Infinite M200Pro多功能酶標儀，瑞士TECAN。

1.3 實驗動物

30只7周齡的無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級C57BL/6 J雄性小鼠，北京維通利華實驗動物技術有限公司。生產許可證號：SCXK(京)2021-0006。所有小鼠飼養在溫度20～25 ℃、相對濕度55%～65%、12 h光照/12 h黑暗循環的環境中。本動物實驗過程均嚴格遵守山東大學公共衛生學院倫理委員會相關規定。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型的建立與處理

適應性喂養7 d后，將小鼠隨機分為3組(n=10)：對照組，模型組(DSS)和抗性糊精組(DSS_RD)。對照組小鼠自由飲無菌水，模型組和抗性糊精組小鼠自由飲3% DSS水；同時，對照組和模型組每天灌胃生理鹽水(10 mL/kg體重)，抗性糊精組灌胃RD水溶液(根據人適宜攝入量，按小鼠與人體表面積比等效劑量換算比率計算得到，即3.25 g/kg體重)，持續7 d。實驗期間觀察小鼠活動情況、毛色變化、大便性狀、顏色及有無出血等情況，于第8 天麻醉處死小鼠，內眥取血后，取出結腸，拍照并測量長度，收集結腸內容物，取脾臟并稱重。

1.4.2 疾病活動指數(disease activity index，DAI)

每日記錄小鼠的體重，根據小鼠糞便隱血試劑盒說明書的操作步驟檢測小鼠糞便隱血情況和觀察小鼠的糞便性狀，給每只小鼠計分。參考STEVCEVA等[10]報道的計分規則，DAI評分為3項分數的加和。

1.4.3 H&E染色及病理損傷評價

取小段固定于多聚甲醛固定液中的結腸組織，經脫水、包埋、切片和烘片等步驟制成4 μm厚的石蠟切片，經H&E染色后于光學顯微鏡下觀察。每組選擇3 張切片拍照，采用盲法，參考CHASSAING等[11]方法，對小鼠結腸病理組織損傷進行評分。

1.4.4 酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

內眥取血于1.5 mL EP管中靜置2 h，后于4 ℃下，3 000 r/min離心15 min，收集上清液。按照ELISA檢測試劑盒說明書的實驗步驟，分別檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.4.5 免疫組織化學

將小鼠結腸組織石蠟切片脫蠟至水后，使用檸檬酸緩沖液進行抗原修復。隨后將切片放入3% 過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶。封閉后，孵育MUC2、Occludin、Claudin-1和ZO-1一抗，4 ℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗；滴加顯色液，在顯微鏡下控制顯色時間。終止顯色后，蘇木素復染細胞核，脫水封片，顯微鏡下觀察切片。

1.4.6 16S rRNA高通量分析

小鼠結腸內容物16S rRNA基因測序分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行。使用FastDNA Spin試劑盒提取結腸內容物細菌DNA，對V3～V4區域基因序列的主要PCR產物進行電泳、染色、純化和定量，在Illumina MiSeq平臺上進行測序。使用QIIME2 dada2或Vsearch軟件的分析流程進行序列去噪，將相似度在97%以上的基因測序數據歸為操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。采用未加權UniFrac主成分分析、未加權 UniFrac組間差異比較分析，在QIIME和R軟件中進行分析和作圖。

1.5 數據處理與分析

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析，實驗數據用平均值±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，LSD或Dunnett’s法作多重比較檢驗。P<0.05時，差異具有統計學意義。GraphPad Prism 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠疾病癥狀的影響

體重下降，精神萎靡，DAI評分升高，結腸縮短，脾臟腫大是潰瘍性結腸炎小鼠的典型癥狀。實驗期間，對照組小鼠毛色光亮，精神狀態良好，糞便顆粒分明；模型組小鼠精神不振，食欲下降、腹瀉，隱血試驗陽性；抗性糊精組小鼠糞便變軟，活動范圍變小，食欲略下降。體重變化如圖1-a所示，對照組小鼠體重平穩增加，模型組和抗性糊精組小鼠在3% DSS誘導的前4 d，并未觀察到體重下降。但第4天后，模型組小鼠體重急劇下降，而抗性糊精組小鼠體重下降較緩慢；第7 天，抗性糊精組小鼠體重[(20.35±0.738) g]明顯高于模型組[(18.78±0.601) g]。如圖1-b所示，DSS造模后，小鼠的DAI呈上升趨勢。模型組小鼠的DAI評分較高，第4～5天快速增高，但給予抗性糊精干預的小鼠實驗期間的DAI評分緩慢上升，第7 天DAI評分顯著低于模型組(P<0.05)。如圖1-c和1-d所示，與模型組相比，給予抗性糊精干預可顯著恢復小鼠的結腸長度(P<0.05)?？剐院M小鼠脾臟質量[(0.094±0.016)g]顯著低于模型組[(0.114±0.011)g](圖1-e)。綜上所述，抗性糊精可緩解急性UC小鼠體重下降、DAI評分升高、結腸縮短和脾臟腫大等疾病癥狀。

a-體重；b-DAI；c-結腸大體圖；c-結腸長度；e-脾臟質量圖1 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠疾病癥狀的影響Fig.1 Effects of resistant dextrin on symptoms of ulcerative colitis mice注：*, P<0.05；**, P<0.01;***, P<0.001(下同)

2.2 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠結腸病理的影響

小鼠結腸組織切片H&E染色結果如圖2-a所示，相應的病理組織學評分如圖2-b所示。對照組結腸黏膜完整，隱窩正常，無炎性細胞浸潤；模型組結腸結構模糊，隱窩變形或消失，杯狀細胞遭破壞、數量減少，黏膜固有層有炎性細胞浸潤；抗性糊精組與模型組相比，可見清晰的結腸組織結構，隱窩結構可見，杯狀細胞破壞程度較輕，黏膜固有層炎性細胞浸潤較少。與模型組比，抗性糊精組的病理組織學評分顯著下降(P<0.05)，即抗性糊精可減輕潰瘍性結腸炎小鼠的結腸組織炎性損傷。

2.3 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠血清炎癥因子的影響

采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清炎癥因子的水平，結果如圖3所示。經DSS誘導后，小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.05)。而給予抗性糊精干預的小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平較模型組相比，均有一定程度的下降且差異具有統計學意義。因此，抗性糊精對小鼠血清促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平有顯著的下調作用。

a-H&E染色(400×)；b-病理組織學評分圖2 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠結腸病理損傷的影響Fig.2 Effects of resistant dextrin on colonic histological of ulcerative colitis mice

a-TNF-α;b-IL-1β;c-IL-6圖3 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠血清炎癥因子的影響Fig.3 Effects of resistant dextrin on serum inflammatory cytokines levels of ulcerative colitis mice

2.4 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠結腸黏膜屏障的影響

腸道黏膜屏障的完整性和通透性的改變是UC發展的關鍵環節。利用免疫組織化學法分析了各組小鼠結腸組織MUC2和緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin和Claudin-1)的表達情況(圖4)。經DSS誘導后，小鼠結腸組織的MUC2、Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達均下降，即UC小鼠的化學屏障、物理屏障被破壞；給予抗性糊精干預后表達顯著增加，在一定程度上保護了小鼠腸道化學和物理屏障。

圖4 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠腸道屏障的 影響(400×)Fig.4 Effects of resistant dextrin on intestinal barrier of ulcerative colitis mice

2.5 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群的影響

RD是一種低分子水溶性膳食纖維，腸道微生物在降解膳食纖維和維持腸道穩態方面發揮著關鍵作用，因此分析了3組小鼠腸道菌群的組成及改變來探索抗性糊精發揮保護UC作用的可能機制。分別在3組隨機選擇5個小鼠結腸內容物樣本做16S rRNA高通量測序分析。物種豐度等級曲線(圖5-a)長且平滑，證實本研究中的樣本物種豐富度高，且分布均勻。菌群多樣性方面，α多樣性指標、Chao1指數、Simpson指數、Shannon指數和Observed species指數，在3組間均無顯著差異(P>0.05)(圖5-b)，即經DSS誘導和抗性糊精干預后，并未影響小鼠整體細菌豐富度和群落多樣性。本實驗評估了抗性糊精對腸道微生物群落組成的影響，主成分分析(principal component analysis，PCA)如圖5-c所示，對照組與模型組和抗性糊精組的微生物群落明顯分離，表明潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群群落明顯改變；模型組與抗性糊精組的腸道微生物群落有分離但不明顯，提示抗性糊精在一定程度上調節了小鼠腸道菌群的群落組成。韋恩圖(圖5-d)顯示3組共有的OTU數目為700，對照組與模型組共有的OTU數目為501，對照組與抗性糊精組共有的OTU數目為403。

為了直觀表現各組小鼠腸道微生物的組成和差異，分析了各組腸道微生物在門和屬水平上的相對豐度。如圖6-a所示，小鼠腸道菌群主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、TM7和Actinobacteria組成，其中Firmicutes和Bacteroidetes是各組小鼠的優勢菌門。模型組小鼠的Verrucomicrobia的相對豐富度增高，抗性糊精組未見該現象。在菌屬水平上，與對照組相比，模型組小鼠腸道微生物的豐富度顯著下降，抗性糊精干預可部分恢復小鼠腸道微生物豐富度(圖6-b)。模型組和抗性糊精組小鼠腸道Ruminococcus水平均下調，模型組小鼠的Turicibacter、Oscillospira、Odoribacter和Akkermansia豐度增加，Allobaculum和Coprococcus豐度降低?？剐院M小鼠的Turicibacter、Oscillospira和Akkermansia豐度下降，Lactobacillus豐度明顯增多且高于對照組。腸道微生物在菌屬水平的相對豐度用聚類熱圖表示(圖6-c)。為了尋找各組小鼠的特征腸道微生物，對結腸內容物微生物進行LEfSe(linear discriminant analysis effect size)聚類和評分。各組小鼠腸道菌群進化分支圖(圖6-d)顯示各組具有不同的微生物標記物；在菌屬水平上，LEfSe分析(圖6-e)顯示對照組、模型組和抗性糊精組的顯著差異物種分別是Ruminococcus、Turicibacter和Lactobacillus。上述結果表明，抗性糊精改變了DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠腸道微生物組成和結構。

a-物種豐度等級曲線；b-α-多樣性；c-主成分分析；d-韋恩圖圖5 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠腸道微生物的影響Fig.5 Effects of resistant dextrin on gut microbiota of ulcerative colitis mice

a-門水平；b-屬水平；c-聚類熱圖；d-進化分支圖；e-線性判別效應分析評分柱狀圖圖6 抗性糊精對潰瘍性結腸炎小鼠腸道微生物組成的影響Fig.6 Effects of resistant dextrin on gut microbiota composition of ulcerative colitis mice

3 討論與結論

飲食因素在UC的發生、發展和管理過程中非常重要。隨著UC的發病率逐年增加，且發病年齡多為青中年、病死率低、病程反復，藥物治療副作用大，疾病負擔增加，已成為發達國家和發展中國家的重要公共衛生問題[12]?？剐院哂辛己玫睦砘匦院凸δ芴匦?，且2012年我國衛生部的第16號公告將其列為普通食品，可按需要量添加使用[13]。因此，研究抗性糊精對潰瘍性結腸炎的影響，評價其保護腸道健康功能特性，對于UC的防治和飲食管理有重要意義。

本研究利用DSS誘導建立急性UC模型，小鼠體重減輕，DAI評分顯著升高，結腸明顯縮短，脾臟腫大，結腸組織病理顯示杯狀細胞數量減少、腺體破壞、有炎性細胞浸潤，表明結腸炎造模成功。而同時給予抗性糊精灌胃組小鼠的疾病癥狀有明顯的緩解，提示抗性糊精可保護腸道健康。

在潰瘍性結腸炎發病過程中，腸腔內容物進入機體激活大量免疫細胞，產生的炎性細胞因子協同參與免疫細胞介導的免疫反應，進一步加重炎癥的發展[3,14]。為了觀察抗性糊精對機體炎癥反應的影響，本研究檢測了各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。TNF-α是主要由巨噬細胞釋放的內源性炎癥介質，生理水平下可發揮有益作用(如免疫細胞活化)，但過度表達和分泌會破壞免疫平衡，促進機體炎癥的發生發展[15]。IL-6和IL-1β在結腸炎癥的進展中起重要作用，IL-6主要作用于黏膜病變，而IL-1β在初始階段介導炎癥反應[16]。本研究發現，抗性糊精可降低促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，改善機體的炎癥狀態。

腸道黏膜屏障破壞是UC發病機制中的關鍵環節。腸上皮細胞通過緊密連接蛋白整合形成物理屏障，限制腸道內容物和微生物自由進出[17]。杯狀細胞分泌的MUC2是腸道化學屏障的重要組成部分，MUC2 缺乏可導致腸道炎癥并加重結腸炎[18]。與之前的報道[19]一致，本研究免疫組化結果發現DSS誘導的結腸炎小鼠腸道MUC2和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1表達下降，而抗性糊精對它們的表達有恢復作用，即抗性糊精有利于保護腸道黏膜屏障的完整性。

既往研究認為UC患者腸道菌群改變，表現為腸道共生菌和有益菌減少，致病菌和條件致病菌增加[20]?？剐院鳛橐环N新型膳食纖維，有著益生元特性，可調節菌群及其代謝產物的組成。本研究結果表明，DSS誘導的結腸炎小鼠腸道微生物群落組成改變，Proteobacteria和Verrucomicrobia菌門豐度增加。Proteobacteria包含多種致病微生物群，如Helicobacter，Salmonella和E.coli，它們被認為是腸道微生物群紊亂的生物標志物[21]；Verrucomicrobia與腸道炎癥呈正相關[20]?？剐院种屏薞errucomicrobia的增加，但沒有逆轉Proteobacteria的變化。

從菌屬水平的結果分析發現，模型組小鼠腸道Turicibacter，Oscillospira，Odoribacter和Akkermansia豐度增加，Ruminococcus和Lactobacillus豐度顯著下降；抗性糊精組較模型組的Turicibacter，Odoribacter和Akkermansia豐度降低，Lactobacillus和Flexispira豐度明顯增加。值得注意的是，先前的研究表明在UC患者和結腸炎動物模型中，Akkermansia的相對豐度顯著降低[22-23]。Akkermansia是一種有效的抗炎腸道細菌，可通過促進MUC2產生增加黏液層厚度來降低腸道通透性[24]。然而，TIAN等[25]發現結腸炎小鼠中Akkermansia的豐度增加，且與DAI評分、病理組織損傷程度和促炎因子水平呈高度正相關。其他研究也發現Akkermansia在結腸炎動物模型和結腸直腸癌患者中升高，且與UC的嚴重程度呈正相關[26-27]?？赡蹵kkermansia在正常豐度條件下對腸道穩態有益，但過度增殖的Akkermansia可從有益菌轉變成致病菌，進而破壞腸黏膜屏障[28]。Akkermansia在DSS誘導的結腸炎中增加，抗性糊精可以抑制其過度增殖。此外，抗性糊精組Lactobacillus水平顯著增加，Lactobacillus已被廣泛認為是腸道內重要的益生菌。上述結果均表明，抗性糊精可調節腸道微生物的組成，這可能與其發揮保護潰瘍性結腸炎作用有關。

綜上，本研究結果表明，補充抗性糊精可顯著緩解DSS誘導的結腸炎?？剐院@著改善急性UC小鼠的體重減輕、脾臟腫大、結腸縮短、血清促炎因子水平升高和腸道黏膜屏障損傷，其潛在的機制可能與調節腸道微生物，促進腸道有益菌增殖、抑制條件致病菌和有害菌的過度生長有關。