Edam牦牛干酪工藝優化及成熟過程中微觀結構、揮發性風味物質的變化

張蘭俊，張巖，陳煉紅

(西南民族大學 食品科學與技術學院，四川，成都，610041)

牦牛是中國青藏高原特有的家畜，也是高原地區牧民重要的食物來源，獨特的高原生存環境造就了牦牛乳汁的特異性[1]。與普通牛乳相比，牦牛乳含有更豐富的營養素，具有較大利用價值和開發潛力[2]。

Edam干酪原產于荷蘭，具有獨特的紅色蠟封，又稱“紅波干酪”，其質地光滑、氣味溫和，咀嚼時有濃郁的乳香味[3]。Edam干酪屬于浸洗硬質干酪[4]，工藝上與其他干酪最大的區別在于需要浸泡和洗滌，通過浸泡排出乳清，并用熱水洗掉部分乳糖，從而減少乳酸的產生，使最終pH值在5.0～5.2[5]。Edam干酪的加工工藝在國外已經成熟，目前國內的研究中還沒有用牦牛乳制作Edam干酪的先例。

干酪成熟是一個微生物發酵的過程，涉及糖酵解、脂肪分解、蛋白質水解等生化反應[6]，這些反應賦予干酪特定的組織狀態、質地和風味[7]。干酪結構是由鈣磷酸鹽和副酪蛋白組織重疊交錯連接的副酪蛋白聚合體[8]，在成熟過程中，受酪蛋白-酪蛋白、酪蛋白-水和酪蛋白-脂肪相互作用等因素的影響[9]；隨著成熟時間的延長，蛋白質和脂肪發生不同程度的水解，產生一系列的風味物質，其中生成的醛、酮和醇形成了干酪特有的成熟風味[10]。成熟過程所產生的微生物菌群也可直接影響干酪風味組成[11]，任雪明等[12]優化干酪加工工藝，測定干酪揮發性風味物質主要有酮類、醇類、芳香類和烯烴類；NINGTYAS等[13]鑒定出干酪中揮發性化合物29種。

本研究采用青藏高原牦牛乳為原料，以發酵劑添加量、預酸化pH、浸洗溫度、鹽漬濃度作為實驗因素，通過正交試驗優化Edam牦牛硬質干酪工藝，表征成熟過程微觀結構的變化，并采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)分析Edam牦牛硬質干酪的揮發性風味物質，為牦牛乳開發新產品和風味分析提供理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳采自四川省紅原縣麥洼；干酪發酵劑，常州益菌加生物科技有限公司；小牛皺胃酶，丹麥Chr.Hansen公司；無水檸檬酸、CaCl2、NaCl、Na2SO4、25%戊二醛，均為食品純，廣州佳德樂生化科技有限公司。

LD1100-1R電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；8601手持pH計，衡欣科技股份有限公司；DZ-280/2SE小型真空封裝機，廣東省東莞市益健包裝機械有限公司；Sigma600場發射掃描電鏡，德國卡爾蔡司股份公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取探針，美國Supelco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Edam牦牛干酪制備工藝

原料乳→過濾→標準化→巴氏滅菌→冷卻→添加發酵劑→調節酸度→添加CaCl2→添加凝乳酶→凝乳→切割、熱縮→排出乳清→浸洗→排出乳清→壓榨成型→鹽漬→干燥→封蠟→成熟

1.2.2 正交試驗

在實驗室原有單因素試驗基礎上，以發酵劑添加量(質量分數)、預酸化pH、浸洗溫度、鹽漬濃度(質量分數)為實驗因素，采用L9(34)正交試驗確定其最佳工藝方案。干酪制成后，以干酪得率和感官評分為指標，對制作成型的干酪進行評價。正交因素水平如表1所示。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.2.2.1 干酪得率的測定

根據BONFATTI等[14]的方法。分別稱取9組試驗組所需原料乳記為m1，各組添加的CaCl2質量記為m2，凝乳酶質量記為m3，干酪壓縮成型后，稱其質量記為m，干酪得率(X)根據公式(1)計算。

(1)

1.2.2.2 感官評價標準

參考GB 5420—2010《食品安全國家標準干酪》感官要求制定檢驗方法和Edam干酪感官評價表(表2)，感官評價小組由10名來自食品科學學院受過專業訓練的學生組成，對9組正交試驗組分別進行評價。

表2 感官評分表Table 2 Sensory scoring table

1.2.3 Edam牦牛干酪成熟過程中微觀結構的變化

參考石永祺等[15]的方法。分別取3 g成熟第0、20、40、60、80天的干酪樣品，沿干酪纖維方向切成光滑薄片，用2.5%戊二醛溶液浸泡固定，脫水脫脂。在-80 ℃冰箱中放置2 h后進行冷凍干燥。將干燥后的樣品貼在實驗臺上，通過離子濺射進行鍍金。置于20.0 kV電壓下，在600倍電鏡下掃描。

1.2.3 Edam牦牛干酪成熟過程中揮發性風味物質變化

色譜條件：載氣He，流速1 mL/min，樣品通過DB-Wax(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛細管柱。色譜升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后5 ℃/min升到200 ℃，最后以10 ℃/min升到220 ℃，保持3 min。

質譜條件：電子電離(electron ionization，EI)源，電子能量70 eV，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描模式Scan，質量掃描范圍m/z40～650。

1.3 數據處理

采用SPSS 25.0對實驗因素A、B、C進行正交試驗方差分析，每組試驗重復3次，判定實驗變量對實驗結果的影響顯著性，用Excel 2010對Edam牦牛硬質干酪實驗數據進行分析。

2 結果分析

2.1 Edam牦牛干酪工藝優化結果分析

Edam牦牛硬質干酪工藝優化正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果極差分析Table 3 Analysis of orthogonal test results

根據表3正交分析結果可得，影響Edam干酪感官評分的因素主次順序為：發酵劑添加量>酸化pH>鹽漬濃度>浸洗溫度，感官評分最高的是5號干酪，為92.6分。影響Edam牦牛干酪得率的因素主次順序為：發酵劑添加量>浸洗溫度>酸化pH>鹽漬濃度，即發酵劑用量對Edam干酪產量的影響最大，而鹽漬濃度影響最小，干酪得率最高的是5號干酪，為19.41%。

由表4、表5的方差分析可知，發酵劑添加量、酸化pH、浸洗溫度、鹽漬濃度均具極顯著差異性(P<0.01)。對比正交試驗、極差分析和方差分析結果，正交試驗的最佳工藝組合為A2B2C3D1，根據感官評價極差、方差分析的最佳工藝組合為A2B3C2D1。根據干酪得率極差、方差分析得到最佳工藝組合為A2B3C3D2。

表4 正交試驗感官評分方差分析結果Table 4 Analysis of variance of sensory score of orthogonal test

驗證試驗：將極差、方差分析得到的最優組合即A2B3C2D1和A2B3C3D2，按照1.2.1的工藝制作干酪，計算干酪得率和感官評價。驗證試驗結果為：A2B3C2D1的干酪得率19.22%，感官評分86.3分；A2B3C3D2的干酪得率為19.18%，感官評分91.22分，均低于正交試驗組的5號，故5號干酪A2B2C3D1為最佳制作工藝方案，最佳工藝為發酵劑添加量0.006%、pH 5.6、浸洗溫度45 ℃、鹽漬濃度12%。

表5 正交試驗干酪得率方差分析結果Table 5 Variance analysis results of cheese yield rate in orthogonal test

2.2 Edam牦牛干酪成熟過程中微觀結構觀察

如圖1所示，第0天時，干酪的組織結構較緊湊，酪蛋白膠束較粗，膠束之間孔徑光滑且空間較??；

a-0 d;b-20 d;c-40 d;d-60 d;e-80 d圖1 Edam牦牛干酪發酵0～80 d的微觀結構Fig.1 Microstructure of Edam yak cheese fermentation from 0-80 d

第20天時干酪的孔徑較第0天已經變大；第40天初見網狀結構降解，第60天時孔徑數量增多，酪蛋白膠束明顯變細；第80天時酪蛋白結構分散，孔徑由小變大，干酪表面變得粗糙，蛋白質分解較明顯。

第0天時，干酪中的酪蛋白脂肪含量較高，且結合緊湊，所以干酪表面孔洞??；第20天時，干酪中的凝乳酶和微生物產生的酶較少，對蛋白質的降解有限；第40天時，干酪中的酪蛋白在殘留的各類酶和菌作用下被水解，導致干酪的蛋白質網狀結構逐漸分解，結構變得疏松，孔徑變大，和楊宇[17]的研究結果一致；第60天時，微生物代謝消耗大量營養物質，干酪中的大部分蛋白質被分解成小肽和氨基酸，第80天時孔徑明顯變大，蛋白質分解較明顯，脂類物質大量降解，干酪乳化性能變差，表面變粗糙。

2.3 Edam牦牛干酪揮發性風味物質結果分析

SPME-GC-MS技術對Edam牦牛硬質干酪不同成熟期(0、20、40、60、80 d)的揮發性風味成分進行檢測，離子色譜圖如圖2所示。NIST-MS-Search 2.0共搜索到75個化合物，主要為羧酸類、醇類、酮類、酯類和醛類化合物。各物質的含量及其相對峰面積見表6。

a-成熟0 d;b-成熟20 d;c-成熟40 d;d-成熟60 d;e-成熟80 d圖2 不同成熟時間的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram with different ripening time

表6 干酪成熟過程中揮發性成分的變化Table 6 Changes in volatile components during cheese ripening

續表6

續表6

從圖2和表6可以看出，0 d的干酪中檢測到44種風味物質，包括15種醇、15種酯、6種酮、5種醛、3種烷烴等化合物。在成熟20 d的干酪中，共檢測到35種風味物質，包括1種羧酸、13種醇、6種酯、6種酮、5種醛和4種烷烴。在成熟40 d的干酪中檢測到35種風味化合物，包括3種羧酸、14種醇、2種酯、7種酮、4種醛、5種烷烴等化合物。成熟60 d后，干酪中檢出30種風味物質，包括5種羧酸、9種醇、2種酯、7種酮、3種醛和4種烷烴。80 d干酪中檢出27種風味物質，包括5種酸、9種醇、1種酯、6種酮、3種醛、3種烷烴等化合物。

Edam牦牛干酪成熟期間各類化合物總含量及種類的變化如表7所示。利用SPME-GC-MS分析Edam牦牛干酪揮發性風味物質，不同成熟時間干酪樣品中的風味物質種類和含量存在一定的差異性。實驗數據顯示，隨成熟時間增加，揮發性化合物的種類由44種降到27種，第60天，酸類化合物含量最高，醇類化合物含量最低；第80天，酯類、酮類、醛類化合物種類及含量均下降到最低，這是由于干酪成熟過程中，蛋白質、脂肪、乳糖發生不同程度的分解同時產生不同的化合物，使得干酪的風味醇香濃厚。

表7 Edam牦牛干酪成熟期間各類化合物 總含量及種類的變化Table 7 Changes of total content and types of compounds during the ripening of Edam yak cheese

2.3.1 羧酸類化合物

干酪成熟過程中，檢出的羧酸類化合物有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸。隨著成熟時間的延長，酸類化合物的種類數量均增長；含量在第60天時達到最高值38.46%，到第80天降至26.21%，各階段含量差異性顯著(P<0.05)。這是因為干酪成熟過程中殘留的乳酸菌自溶產生的胞內脂肪酶和乳酸菌釋放的胞外脂肪酶共同作用生成游離脂肪酸，酪蛋白水解成多肽和氨基酸、乳糖發酵生成乳酸[18]。甲酸具有刺激性醋味，不利于干酪的風味形成[19]；乙酸和丙酸具有典型的醋酸味道；己酸具有輕微的干酪腐臭味；丁酸表現出干酪味和奶油味，但發酵過程中雜菌增多時丁酸產量升高會使干酪產生酸敗氣味。

2.3.2 醇類化合物

醇具有沸點低、極性低、閾值較高、對風味貢獻小等特點。隨著成熟時間的延長，醇類含量從68.83%降到第60天的16.90%，到第80天又升至49.6%。成熟前以丁醇為主，到第80天以苯乙醇為主。干酪中醇類物質有4種來源：乳糖代謝，甲基酮還原，氨基酸代謝以及亞油酸、亞麻酸降解。2-戊醇可表現出新鮮的干酪風味、堅果風味；己醇有椰子和漿果的味道；苯甲醇有微弱的芳香氣味[20]；成熟后含量最高的苯乙醇具有玫瑰香味，對于干酪的特殊香氣起到了一定作用，對干酪的風味是有利的。

2.3.3 酯類化合物

脂肪酸和醇的酯化在干酪成熟過程中起著重要作用。由于在乙酸、丁酸和己酸存在下的協同作用，酯的閾值比前體低10倍。丁酸甲酯具有蘋果風味，乙基酸有水果和冰淇淋的香氣，乙酸丁酯、乙酸正丙酯有一種特殊的水果香味，丁酸丙酯有香蕉和菠蘿香氣，己酸乙酯有菠蘿味、蠟味和香蕉味[21]。

2.3.4 酮類化合物

酮是干酪中最常見的風味成分之一，具有獨特的風味和較低的感知閾值。其中，最重要的揮發性成分是甲基酮。酮與原料乳的脂肪含量有關，它由多不飽和脂肪酸的氧化或熱降解、氨基酸降解或通過微生物的酯解作用形成[22]。由表7可知，酮類化合物種類變化相對穩定，含量呈先上升后下降的趨勢。丙酮具有特殊的辛辣氣味；2-丁酮、2-戊酮的氣味與丙酮類似，略帶辛辣味；2-庚酮、2-壬酮賦予干酪水果味、花香味及霉腐味；己二酮具有乳脂香氣。

2.3.5 醛類化合物

醛類是干酪水溶性成分中的主要揮發性化合物，也是各種氧化香精的來源。由于醛類組分化學性質相對比較活潑，很快還原成醇和相應的酸，因而醛類物質在干酪中的存留時間很短[23]。由表7可知，醛類物質種類相對穩定，含量處于動態變化中，隨著脂肪氧化而逐漸增多，又因被還原成醇或酸而減少。干酪中醛類物質的來源主要有2種[24]：一是脂肪酸代謝，主要生成直鏈醛類；二是氨基酸轉氨作用或Strecker降解，主要生成支鏈醛類。苯甲醛具有杏仁和堅果的風味，由色氨酸或苯丙氨酸轉化而來，對干酪形成良好的風味起著重要作用；3-甲基丁醛使干酪具有強烈的氣味；戊二醛和己醛具有草味和牛舍味，當含量超過一定閾值時，會產生難聞的氣味。

2.3.6 烷烴及其他

烷烴化合物在干酪中隨處可見。由于碳氫化合物的高閾值，風味活性較低，對干酪的呈味作用有限，其含量變化不明顯，對干酪的整體風味貢獻也較小。

3 結論

本試驗以發酵劑添加量、預酸化pH、浸洗溫度、鹽漬濃度作為因素，進行正交試驗，得出最佳加工工藝：發酵劑添加量0.006%、pH 5.6、浸洗溫度45 ℃、鹽漬濃度12%。在此工藝下制得的Edam牦牛硬質干酪成熟0～80 d，掃描電鏡結果表明，隨著發酵時間的延長，酪蛋白膠束變細，孔徑變大，孔洞數量逐漸變少，發酵至80 d時，干酪表面變得粗糙，蛋白質脂肪分解較明顯。利用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對Edam牦牛硬質干酪成熟各階段進行揮發性風味物質測定，結果表明，隨著成熟時間的延長，風味化合物的總量呈下降趨勢，酯類和醇類下降明顯，酸類化合物的數量先增后減，第80天的主要風味物質有羧酸類和醇類；其中，生成的關鍵風味物質有丁酸、乙酸、戊酸、己酸、1-丁醇、苯乙醇及2-戊酮，構成了干酪的主體風味。本研究可為Edam牦牛硬質干酪加工和產品開發提供一定的參考，但干酪的風味是由揮發性成分共同作用的結果其內在機理有待進一步研究。

致謝：感謝西南大學食品科學學院實驗中心張玉老師為本研究提供GC-MS檢測。