凡納濱對蝦幾丁質酶的活性分布及其短波紫外線照射激活作用

竇碧靜，潘燕平，JULIETH Majura，韓梅，曹文紅,2* ，陳忠琴,2， 鄭惠娜,2，高加龍,2

1(廣東海洋大學 食品科技學院，國家貝類加工技術研發分中心(湛江)，廣東省水產品加工與安全重點實驗室， 廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室， 廣東 湛江，524088)2(大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連，116034)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是世界上養殖最廣泛的甲殼類動物，2020年我國凡納濱對蝦產量為186多萬t[1]，占全世界對蝦養殖量的80%以上。對蝦加工需去除頭部和硬殼(占質量近40%～60%)[2]，產生大量廢物，給蝦類行業帶來環境污染。然而，蝦的生物廢棄物是生產幾丁質的良好來源。幾丁質，由β-(1-4)-聚-N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基通過氫鍵高度交聯的一種不溶性生物聚合物，是自然界中最豐富的有機化合物之一(僅次于纖維素)[3]。值得注意的是，幾丁質衍生物(如殼聚糖)具有良好的生物降解性、生物相容性和無毒性等功能特性，可廣泛應用于生物醫學、化妝品、廢水處理等領域[4]。但傳統化學提取幾丁質會產生大量的環境污染物并增加幾丁質的部分脫乙?；?。

而酶提取法由于其具有環保性越來越受歡迎，被廣泛認為是綠色提取方法之一。幾丁質酶在自然界中廣泛存在，是一組水解酶，具有幾丁質結合和催化結構域，可以水解幾丁質中的糖苷鍵。幾丁質酶可將幾丁質轉化為廢物管理、生物醫學和酶工業中的有用產品[5]。已有報道稱幾丁質酶存在于甲殼動物，例如南美白對蝦、中華絨螯蟹、斑節對蝦、脊尾白蝦[6]。來自海洋甲殼動物的幾丁質酶具有作為工業應用生物催化劑的潛能。然而，幾丁質酶商業應用因為酶產率低、生產成本高及酶穩定性差受到限制[3]。因此，探索提高幾丁質酶活性的途徑是一項必要的研究。

短波紫外線(ultraviolet-C，UV-C)照射是一種非熱技術[7]，具有操作簡單、安全性高、經濟、無污染、無化學殘留等優點。BHAT等[8]表明紫外線照射增加了魚糜凝膠強度，主要是由于紫外線照射引起魚蛋白空間結構發生變化。KRISTO等[9]觀察到紫外誘導的蛋白構象變化增加了乳清蛋白對胃蛋白酶水解的敏感性。另外，適度的UV-C照射可激活生物酶活性，紫外線照射后海參體壁酸性磷酸酶和組織蛋白酶的活性增加，表明紫外線照射在海參體壁“融化”過程中具有潛在的作用[10]。前期研究表明UV-C照射可激活凡納濱對蝦蝦頭幾丁質酶[11]，但尚未系統研究優化UV-C照射激活幾丁質酶的工藝。因此，本研究以凡納濱對蝦為研究對象，根據其不同組織部位幾丁質酶的分布，選擇幾丁質酶分布最集中的組織部位進行最優工藝的探討。使用正交實驗優化了UV-C照射參數，以開發一種更有效提高幾丁質酶活力的工藝。此外，探究了UV-C照射對幾丁質酶酶學性質影響，為UV-C照射提高凡納濱對蝦幾丁質酶活力提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的凡納濱對蝦，平均體質量：(13.99±0.92) g，平均體長：(13.92±0.58) cm，購自廣東省湛江市麻章區湖光市場，將凡納濱對蝦不同部位進行分離，分出頭殼、殼(來自蝦背部)、胃、肝臟、腸、肉、尾及蝦頭等組織部位。

幾丁質(試劑級)，美國Sigma公司；對二甲氨基苯甲醛(4-dimethylaminobenzaldehyde，DMAB)(分析純)，廣州化學試劑廠；蝸牛酶，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋，北京光明醫療儀器有限公司；LG20-W型臺式高速冷凍離心機，北京京立離心機有限公司；2-16KL型臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司；JYL-C012型榨汁攪拌機，九陽股份有限公司；FE28型實驗室pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；QL-905型旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Varioskan Flash型全自動酶標儀，美國Thermo公司；紫外燈(波長 253.7 nm，功率分別為 6、10、20、30、40 W)，廣東雪萊特光電科股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同組織部位幾丁質酶液制備

參照王賀等[11]的方法，稍作修改。將頭殼、殼、胃、肝臟、腸、肉、尾等組織部位按料液比1∶4(g∶mL)加入乙酸鈉緩沖液(20 mmol/L，pH 5)，再利用攪拌機得到不同組織部位的勻漿物。將勻漿物速凍到0 ℃，待解凍完全后，于4 ℃抽提1 h。隨后8 000 r/min離心15 min，得到的上清液即為頭殼、殼、胃、肝臟、腸、肉、尾的粗酶液。將酶液分裝后放在-80 ℃冰箱儲存。

1.3.2 幾丁質酶活力的測定

按照王婧[12]的方法，稍作修改，采用DMAB方法用酶標儀測定幾丁質酶活力。將乙酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 5.0)、1%膠體幾丁質及粗酶液各200 μL在37 ℃水浴反應2 h。將反應混合物以4 000 r/min離心10 min終止反應。取200 μL上清液，加入20 μL 10 g/L蝸牛酶溶液，于37 ℃水浴0.5 h。再加入100 μL飽和硼砂溶液，沸水浴7 min。待冷卻后，加入1 000 μL冰醋酸及500 μL 10 g/L DMAB溶液，于37 ℃下水浴15 min。然后在585 nm處測定其吸光度值，并使用不同濃度的N-乙酰葡萄糖胺繪制標準曲線。一個活性單位(U)定義為1 mL酶液每小時分解膠體幾丁質產生1 μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量。以20 min加熱滅活的酶為陰性對照。幾丁質酶比活力以原料鮮重計算，單位為U/g原料。

1.3.3 UV-C照射對蝦頭幾丁質酶的影響

參考CAO等[13]的方法，稍作修改。UV-C照射蝦頭幾丁質酶的固定條件為：照射功率30 W、照射時間20 min、照射高度20 cm。設置的各因素梯度分別為：照射功率10、20、30、40、50 W，照射時間10、15、20、25、30 min，照射高度10、15、20、25、30 cm。在實驗過程中，改變以上某種因素，其他條件不變。按照1.3.1得到蝦頭勻漿物，將其鋪在玻璃培養皿(直徑9 cm)，厚度大概為5 mm。將紫外燈(波長253.7 nm)放在培養皿正上方進行照射。按照1.3.1制備不同UV-C照射條件下的粗酶液，測定幾丁質酶活力。以未照射的蝦頭幾丁質酶液為對照組。

1.3.4 正交實驗設計

以UV-C照射功率、照射時間、照射高度為試驗因素，以幾丁質酶比活力為試驗指標，選擇3因素3水平進行正交試驗，試驗設計如表1所示。

表1 正交試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment design

1.3.5 凡納濱對蝦不同組織部位的激活

將各組織部位的勻漿物按照最優工藝參數進行UV-C照射，然后按照1.3.1制備UV-C照射條件下不同組織部位的粗酶液，來測定照射后各組織部位的幾丁質酶活力。以未照射的各組織部位粗酶液為對照。

1.3.6 UV-C照射前后蝦頭幾丁質酶酶學性質變化

1.3.6.1 溫度對幾丁質酶活力的影響

將UV-C照射的酶液與底物反應體系混合物在pH 5和20～60 ℃的溫度范圍內測定幾丁質酶活力，確定酶的最佳溫度。未經UV-C照射的為對照，同上操作。

1.3.6.2 pH對幾丁質酶活力的影響

在37 ℃下確定UV-C照射前后蝦頭幾丁質酶的最適pH。使用甘氨酸-HCl緩沖液(pH 2.2～3)、醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4～5)、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6～8)和Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9)作為50 mmol/L反應緩沖液測定不同pH值下UV-C照射前后幾丁質酶活力。

1.3.6.3 金屬離子對幾丁質酶活力的影響

加入Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L，pH 6.4)配制濃度為10 mmol/L金屬鹽溶液(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+)。將各種金屬離子添加到UV-C照射和未照射的幾丁質酶液中，然后測定幾丁質酶活力。

1.4 數據處理

所有實驗均做3次平行，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS 26.0、Origin 2018軟件分析數據及作圖。通過Duncan多重檢驗確定樣本之間差異的顯著性(P<0.05，差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 凡納濱對蝦不同組織部位幾丁質酶活力分布

如圖1-a所示，凡納濱對蝦肝臟、胃、腸、頭殼、殼、尾的幾丁質酶比活力分別為(72.84±2.54)、(33.54±1.31)、(27.25±0.91)、(21.40±1.25)、(10.74±0.48)、(5.22±0.05)U/g，說明凡納濱對蝦中幾丁質酶大部分存在于蝦頭。凡納濱對蝦不同組織部位幾丁質酶活力占比如圖1-b所示，肝臟最高，其次是胃、頭殼及殼，最后是腸及尾，這主要與各部位質量及酶活力相關。蝦頭部位(含肝臟、胃、頭殼)的幾丁質酶活力占比達到84.83%。因此選擇蝦頭做后續試驗。研究發現，南美白對蝦幾丁質酶在肝胰腺中高水平表達但在表皮組織中低水平表達[14]。斑節對蝦幾丁質酶在肝胰腺和腸道中表達，且參與了蛻皮時幾丁質的降解[15]?？芍?，幾丁質酶主要存在于凡納濱對蝦的一些消化吸收器官及表皮，這主要因為幾丁質酶可分解幾丁質及參與甲殼類動物蛻皮。幾丁質酶對于甲殼類動物來說是必不可少的，具有消化幾丁質食物、修飾腸道圍營養膜和降解幾丁質外骨骼的功能[16]。

a-幾丁質酶的比活力；b-幾丁質酶活力占比圖1 凡納濱對蝦不同組織部位幾丁質酶比活力 及酶活力占比Fig.1 Specific activity and proportion of the chitinase activity in different tissues of L.vannamei注：不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 UV-C照射對蝦頭幾丁質酶活力的影響

2.2.1 照射功率對幾丁質酶活力的影響

如圖2所示，不同照射功率下(6、10、20、30、40 W)的幾丁質酶比活力均高于未照射的，分別增加了27.32%、40.70%、33.26%、29.30%、17.48%，說明UV-C照射提高了幾丁質酶活力。隨著照射功率的增加，幾丁質酶比活力逐漸增大，在照射功率為10 W時最高，達到(37.75±1.35)U/g(P< 0.05)。當照射功率超過10 W后，酶比活力增加的趨勢逐漸減小。相比10 W時最高的幾丁質酶比活力，20、30、40 W時幾丁質酶比活力分別降低了5.29%、8.11%、16.51%。這些結果表明，低強度光處理可能會改變酶活性位點的構象，而不會損害其催化能力，但會導致整體活性增加。相比之下，UV-C更高強度處理與導致酶失活的不可逆結構變化有關。光會通過2條主要途徑改變蛋白質的結構，從而影響蛋白質的生物活性，一是蛋白質結構或發色團吸收輻射引起的直接光氧化，另一個是通過光敏劑能量轉移產生單線態氧形成的間接蛋白質氧化[17]。

圖2 不同照射功率下蝦頭幾丁質酶的比活力Fig.2 Specific activity of chitinase in shrimp heads under different irradiation powers注：不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.2 照射時間對幾丁質酶活力的影響

如圖3所示，相比未照射的樣品，幾丁質酶在10、15、20、25、30 min照射時間下均有不同程度的激活，分別提高了25.08%、65.36%、133.77%、96.81%、4.44%。由圖3可知，幾丁質酶隨著照射時間的增加而被激活，然后隨著處理時間的進一步延長而降低。當照射時間為20 min時，幾丁質酶比活力為(36.37±2.29)U/g(P<0.05)。當處理時間超過20 min時，幾丁質酶比活力顯著降低。相比20 min時的酶比活力，25、30 min下酶比活力分別降低了15.80%、55.33%。劉亮等[18]觀察到在照射功率20 W和照射距離10 cm的條件下，水蜜桃果汁中多酚氧化酶活性隨照射時間延長而降低，并在41.42 min時損失50%。ZHANG等[19]發現油桃中UV-C處理的幾丁質酶活力隨著時間的延長呈上升趨勢，并在24 h達到峰值，之后急劇下降。前期溫和的UV-C照射條件增強了幾丁質酶活力，但長時間的UV-C照射會破壞幾丁質酶蛋白的結構導致其活力降低。

圖3 不同照射時間下蝦頭幾丁質酶的比活力Fig.3 Specific activity of chitinase in shrimp heads at different irradiation time

2.2.3 照射高度對幾丁質酶活力的影響

如圖4所示，相比未處理的樣品，在照射高度為10、15、20、25、30 cm下照射處理的幾丁質酶有不同程度的激活，分別增加了36.64%、80.81%、62.21%、44.55%、9.14%。隨著照射高度的增加，幾丁質酶比活力增大，之后隨著照射高度的進一步增加而降低。在照射高度為15 cm下酶比活力最高，達到(26.07±0.83)U/g(P<0.05)。相比15 cm時酶比活力，在20、25、30 cm的照射高度下觀察到酶比活力的損失，分別為10.28%、20.05%、39.63%。BOYCE等[20]發現當微生物樣品表面距UV-C設備更遠的距離時，細菌對數減少量較低。劉亮等[19]發現在10、20、30 cm的照射距離下，多酚氧化酶活性隨照射距離的增加而逐漸上升。

圖4 不同照射高度下蝦頭幾丁質酶的比活力Fig.4 Specific activity of chitinase in shrimp heads under different irradiation heights

2.3 UV-C照射工藝的正交試驗優化

對照射功率、照射時間、照射高度，采用4因素3水平的正交表L9(34)，以幾丁質酶比活力為評價指標進行試驗，試驗方案及結果分析如表2所示。

表2 正交試驗設計及試驗結果Table 2 Design and results of the orthogonal experiment

表2的極差結果顯示，在UV-C照射幾丁質酶工藝條件中影響酶比活力的主次因素為B>C>A，即照射時間>照射高度>照射功率。UV-C照射幾丁質酶的最佳工藝為A2B3C1，即照射功率10 W，照射時間20 min，照射高度10 cm。得到的最佳工藝是試驗6號的組合，此時的酶活力也是9組試驗中最高的，為(27.06±0.10)U/g。因此，利用UV-C照射最佳工藝對接下來不同組織部位激活以及酶學性質進行探究。

2.4 UV-C照射對不同組織部位幾丁質酶的激活作用

UV-C照射可作為提高酶活力的有效手段，圖5結果顯示，UV-C照射對凡納濱對蝦肝臟、腸、胃、頭殼、殼、尾幾丁質酶有不同程度的激活，分別升高41.41%、157.81%、137.86%、64.12%、25.68%、16.61%。

圖5 UV-C照射對不同組織部位幾丁質酶激活作用Fig.5 Activation of the chitinase in different tissues by UV-C irradiation注：不同的大小寫字母分別表示0.05水平下UV-C照射 前后組間有顯著性差異(下同)

可見，UV-C照射可以顯著激活凡納濱對蝦不同組織部位的幾丁質酶。CAO等[13]利用30 W紫外燈照射蝦頭20 min，發現蛋白酶水解活性相對于未處理樣品增加了62%。鄭麗等[21]發現紫外線照射能提高扇貝加工廢棄物中自溶酶活力。UV-C照射可以通過改變氨基酸微環境來激活酶[22]，并可能改變芳香族殘基的修飾，導致結構變化，使芳香族氨基酸分子側鏈基團逐漸暴露于溶液中[23]。蛋白質空間結構的適度伸展使其能夠更好地與底物結合，從而提高其催化能力。UV-C照射技術可增大凡納濱對蝦廢棄物中幾丁質酶在幾丁質降解上的利用價值。

2.5 UV-C照射對幾丁質酶酶學性質的影響

2.5.1 溫度對幾丁質酶活力的影響

如圖6所示，pH 5.0時UV-C照射前后溫度對酶的影響趨勢一致，幾丁質酶最適溫度為40 ℃，說明UV-C照射對幾丁質酶的溫度沒有影響。照射前后蝦頭幾丁質酶最適溫度與脊尾白蝦[12]的最適溫度一致。而斑節對蝦幾丁質酶的最適溫度為55 ℃，這主要是因為不同品種蝦的生活環境不一樣[24]。此外，最適溫度下照射前后幾丁質酶活力由(37.22±0.77)U/g升高至(44.91±1.32)U/g，提高了20.67%，說明UV-C照射可提高幾丁質酶活力。在20～50 ℃的溫度范圍內，幾丁質酶顯示出較高的比活力。相反，當溫度>60 ℃后，照射前后酶活力損失均超過60%。這可能是由于熱變性所致。BEYGMORADI等[25]觀察到墨吉明對蝦中的幾丁質酶在高于60 ℃時酶活性損失超過 60%。因此，UV-C照射可作為提高凡納濱對蝦廢棄物中幾丁質酶在適溫條件下降解幾丁質的綠色技術。

圖6 UV-C照射前后不同溫度對幾丁質酶比活力的影響Fig.6 Effects of different temperatures on the chitinase specific activity before and after UV-C irradiation

2.5.2 pH對幾丁質酶活力的影響

UV-C照射前的幾丁質酶在pH 4.0具有最大的幾丁質分解活性(圖7)，接近斑節對蝦的最適pH[24]，這表明甲殼類幾丁質分解酶的最佳pH是酸性的。而UV-C照射的幾丁質酶在pH 5.0時酶活性最高?？芍?，UV-C增大了幾丁質酶的最適pH值，結果與王賀等[11]研究結果相似。在最適pH下，UV-C照射前后的幾丁質酶比活力分別為(37.08±1.17)、(29.71±0.55)U/g，提高24.83%。相反，在其他pH下，觀察到UV-C照射前后幾丁質酶活性有損失，而在pH 9下UV-C照射前后酶活性最大損失分別為63.74%、56.71%。酶活性的降低可能是由于蛋白質構象的變化[26]和酶不能正確地結合底物[27]所致。具有低pH值特性的凡納濱對蝦幾丁質酶是一類適用于消化酸性條件下含幾丁質食物的酶。

圖7 UV-C照射前后不同pH對幾丁質酶比活力的影響Fig.7 Effects of different pH on the chitinase specific activity before and after UV-C irradiation

2.5.3 金屬離子對幾丁質酶活力的影響

如圖8所示，Na+、Ca2+對照射前后的幾丁質酶有輕微的激活作用，K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+有不同程度抑制作用，說明UV-C照射沒有改變幾丁質酶對金屬離子的特性。K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+對未處理的酶分別抑制了7.93%、28.05%、24.38%、76.49%、38.14%，而對照射的酶分別抑制了2.75%、10.87%、35.25%、27.82%、49.14%。Cu2+對照射前后的酶完全抑制。OLIVEIRA等[28]發現Cu2+、Fe3+、Zn2+顯著降低了腰果中幾丁質酶活性。在不同金屬離子的作用下，經UV-C照射的幾丁質酶活力均比未照射的顯著提高。Zn2+、Fe3+、Cu2+能引起幾丁質酶的失活是因為其與組氨酸或半胱氨酸結合而導致酶蛋白構象的變化[29]。據推測，金屬離子與關鍵催化殘基的側鏈羧酸鹽基團的相互作用固定了它們的構象，限制了它們的水解能力[30]。上述結果表明，蝦頭幾丁質酶可能是一種金屬酶，其活性依賴于陽離子的存在。

圖8 UV-C照射前后不同金屬離子對幾 丁質酶比活力的影響Fig.8 Effects of different metal ions on the specific activity of chitinase before and after UV-C irradiation

3 結論

凡納濱對蝦肝臟、胃、腸、頭殼、殼、尾的幾丁質酶比活力分別為(72.84±2.54)、(33.54±1.31)、(27.25±0.91)、(21.40±1.25)、(10.74±0.48)、(5.22±0.05)U/g原料。幾丁質酶主要分布在蝦頭部位(含肝臟、胃、頭殼)，占比達84.83%。UV-C照射可顯著激活幾丁質酶。正交優化UV-C照射激活蝦頭幾丁質酶工藝為：照射功率10 W，照射時間25 min，照射高度10 cm，此時幾丁質酶活力為(27.06±0.10)U/g原料。在最優照射條件下，UV-C照射顯著激活對蝦各組織部位中幾丁質酶且對幾丁質酶酶學性質無顯著影響。適度UV-C照射使幾丁質酶蛋白質空間結構伸展，形成了利于其與底物結合的空間結構。有關UV-C照射幾丁質酶的分子機制有待后續深入研究。