解凍方式對雞腿肉蛋白氧化特性的影響

梁詩惠，馮鈺敏，鄧華榮，劉巧瑜，白衛東，吳俊師，陳海光*

1(仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室， 農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，現代農業工程創新研究院， 廣東 廣州，510225)2(深圳市金谷園實業發展有限公司，廣東 深圳，518000)

冷凍肉不僅作為國家調節肉類食品市場的重要產品，也是肉制品在國內運輸及進出口貿易的主要形態[1]。但是肉品在冷凍解凍過程中會引起蛋白質和脂質氧化，最終影響食用品質。肌原纖維蛋白氧化是指肉類肌肉中的主要結構蛋白及功能性蛋白發生了由活性氧、活性氮直接誘導的，或氧化生成的次級產物間接誘導的一些共價修飾。這些共價修飾會使蛋白質發生一些不可逆改變，如蛋白變性、結構損傷等，最終影響食品的食用品質[2]。

近年來，關于解凍方式對肉類蛋白質氧化的研究很多。王琳琳等[3]主要研究5種不同解凍方式對牦牛肉蛋白氧化功能特性及新鮮度的影響，研究發現牦牛肉經空氣解凍后，其肌原纖維蛋白氧化程度最大，具體表現為羰基含量、表面疏水性指數最高，巰基含量和Ca2+-ATPase活性最低。蔡璐昀等[4]研究不同超聲輔助解凍對海鱸魚肌原纖維蛋白理化性質的影響，發現超聲微波解凍方式對海鱸魚蛋白質的降解程度影響較小，該方式可以更好地維持海鱸魚蛋白質結構。劉磊等[5]用不同解凍方式(低溫解凍、流水解凍和微波解凍)對鵝腿肉進行解凍，以拉曼光譜的測定結果表征蛋白質二級結構的變化，發現低溫解凍對蛋白質二級結構的影響較小，流水解凍的影響較大。

本文以冷凍雞腿肉為研究對象，在前期研究基礎上，探究室溫解凍、流水解凍、冷藏解凍、微波解凍4種解凍方式對蛋白質氧化程度、蛋白質聚集或降解情況、蛋白質結構以及組織學特性方面進行研究，探討不同解凍方式對冷凍雞腿肉肌原纖維蛋白的影響，以明確不同解凍方式對雞肉品質影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍雞腿肉(厚度為1 cm的雞腿塊)，深圳市金谷園實業發展有限公司；三氯乙酸、無水乙醇(均為分析純)，天津市百世化工有限公司；2,4-二硝基苯肼、鹽酸胍(均為分析純)，南京圣比奧生物科技公司；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl 緩沖液)，上海麥克林生化科技有限公司；超微量Ca2+-ATPase試劑盒，南京建成生物工程研究所；雙縮脲試劑盒，上海源葉生物科技有限公司。

JY600C電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；RT—6000酶標分析儀，深圳雷社生命科學股份有限公司；XploRA PLUS共聚焦拉曼光譜儀，堀場(中國)貿易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 解凍方式

(1)室溫解凍(A)。將冷凍雞腿肉樣品(20±0.5) ℃的室溫下解凍，用數字溫度計測得雞腿肉中心溫度為0 ℃即可。

(2)流水解凍(B)。將冷凍雞腿肉樣品置于流水下進行解凍，保持流速恒定。用數字溫度計測得雞腿肉中心溫度為0 ℃即可。

(3)冷藏解凍(C)。將冷凍雞腿肉樣品放入冰箱中進行4 ℃冷藏解凍，用數字溫度計測得雞腿肉中心溫度為0 ℃即可。

(4)微波解凍(D)。將冷凍雞腿肉樣品用保鮮袋裝好后放入微波爐中進行解凍，用數字溫度計測得雞腿肉中心溫度為0 ℃即可。

1.2.2 肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)的提取

參考LIU等[6]的方法并稍作修改，從雞腿肉中分離提取MP。將雞腿肉和預冷的Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L KCl溶液和20 mmol/L Tris-HCl溶液，pH 7.0)按料液比1∶4(g∶mL)用高速勻漿機以10 000 r/min的速度勻漿3次。用20目篩網過濾后離心(5 000 r/min，4 ℃，離心15 min)。上清液倒出，將顆粒收集為粗MP。重復上述步驟4次，獲得高質量的MP。整個過程均在4 ℃下進行。

1.2.3 羰基含量的測定

測定羰基的方法按照LEVINE等[7]方法進行修改，方法如下：準確稱取質量0.1 g雞肉糜加入0.9 mL的勻漿介質進行勻漿后離心(2 500 r/min，10 min)，使用雙縮脲法測定上清液的蛋白濃度。同時取0.45 mL蛋白溶液與0.05 mL的緩沖溶液混勻后離心(11 000 r/min，10 min)。取0.1 mL上清液，加入0.4 mL 2, 4-二硝基苯肼的鹽酸溶液(空白樣品反應液中不含2, 4-二硝基苯肼)，37 ℃下避光反應30 min，加入0.5 mL質量分數20%的三氯乙酸，振蕩后離心(12 000 r/min，10 min)。將蛋白沉淀用1 mL的V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1溶液洗滌4次，加1 mL鹽酸胍溶液(6 mol/L)，在37 ℃下水浴15 min溶解沉淀，離心(12 000 r/min，15 min)。取上清液于370 nm處測定吸光值，使用摩爾吸光系數計算。

1.2.4 巰基含量的測定

參考BEVERIDGE等[8]的Ellman試劑分析方法并稍加改動測定MP總巰基，將提取好的MP用20 mmol/L pH 6的磷酸鹽緩沖液稀釋至質量濃度為5 mg/mL的MP溶液。吸取10 μL肌原纖維蛋白溶液和150 μL Ellman試劑到酶標板孔中，劇烈振蕩使其反應完全，以不加2-硝基苯甲酸[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]組為對照，在405 nm處測定吸光值，計算蛋白總巰基含量。

1.2.5 表面疏水性的測定

參照CHELH等[9]的方法稍作修改，取5 mL MP溶液(5 mg/mL)與1 mL溴酚藍溶液(1 mg/mL)混合均勻后2 000 r/min離心15 min。以無MP的磷酸鹽緩沖液為空白對照，上清液稀釋10倍后在595 nm處測定吸光度。以溴酚藍結合量來計算，如公式(1)所示：

(1)

1.2.6 Ca2+-ATPase活性的測定

Ca2+-ATPase活性按試劑盒說明進行測定。

1.2.7 SDS-PAGE分析

將提取好的MP用緩沖液稀釋至質量濃度為40 mg/mL的MP溶液。采用MARINO等[10]的方法進行試驗，使用4%濃縮膠和12%分離膠來分析解凍后樣品的蛋白質變化。

1.2.8 組織學特性

參考JIANG等[11]的方法并進行修改：將樣品切成小塊后用4%多聚甲醛浸泡24 h，再用70%～95%乙醇溶液梯度脫水1 h，經二甲苯透明處理后再包埋、染色。用CaseViewer軟件進行分析。使用10×的物鏡倍數，截取片段，以及隨機選取5個點測量其肌纖維間隙，每點共測量10組肌纖維直徑的數據。

1.2.9 肌原纖維蛋白二級結構測定

參考袁麗等[12]的方法稍作修改，將MP均勻涂抹在載玻片上，采用激發波長532 nm，曝光時間8 s，循環15次，衰減程度25%，波數為400～2 000 cm-1測定參數隨機選取的3個位置進行測定。

1.3 數據處理與分析

所有試驗重復3次，結果以平均值±標準偏差表示。用IBM SPSS Statistics 19軟件進行顯著性分析，用Origin 2018制圖。

2 結果與分析

2.1 不同解凍方式對雞腿肉羰基含量的影響

羰基是肽鍵斷裂和氨基酸側鏈被自由基氧化生成的主要產物之一，是判斷肌原纖維蛋白氧化程度的重要指標之一[13]。蛋白氧化會使包裹在蛋白質分子內部的氨基酸暴露，使羰基化合物的生成量增多[14]。由圖1可知，室溫解凍雞腿肉中羰基含量最高(3.63 nmol/mg)，微波解凍次之(3.24 nmol/mg)，二者之間差異并不顯著(P>0.05)。這與侯曉榮等[15]的研究結果相似，其研究發現中國對蝦在微波解凍時因溫度較高從而導致羰基化合物的生成量偏大。冷藏解凍的羰基含量較低(2.04 nmol/mg)，也可能是因為低溫抑制了蛋白酶活性。流水解凍方式下的羰基含量最低(p<0.05)，為0.97 nmol/mg，說明流水解凍方式下生成的羰基化合物較少，氧化程度較輕。

圖1 不同解凍方式對雞腿肉羰基含量的影響Fig.1 Effect of different thawing methods on the carbonyl content of chicken thigh meat注：不同小寫字母代表顯著性差異(P<0.05)下同

2.2 不同解凍方式對雞腿肉巰基含量的影響

研究表明，冷凍解凍過程中，巰基容易發生氧化生成二硫鍵以及生成相應的共價化合物，從而導致巰基含量降低[16]。由圖2可知，冷藏解凍的巰基含量(285.23 μmol/g)顯著高于其他3種解凍方式(P<0.05)，說明低溫解凍方式對雞腿肉的總巰基損失影響較小，這與崔燕等[17]提出的低溫高濕解凍可以有效降低鯧魚巰基的氧化速度的研究結果一致。流水解凍的疏基含量次之，為188.31 μmol/g,氧化程度相對較低。室溫解凍的巰基含量最低(110.55 μmol/g)，可能原因是解凍溫度較高且解凍時間較長，導致該組樣品的肌球蛋白頭部結構發生變化，巰基間的相互作用導致蛋白質的聚集作用更加強烈[18]。就巰基含量這一指標而言，冷藏解凍方式優于其他3種解凍方式。

圖2 不同解凍方式對雞腿肉巰基含量的影響Fig.2 Effect of different thawing methods on the sulfhydryl content of chicken thigh meat

2.3 不同解凍方式對雞腿肉表面疏水性的影響

表面疏水性表征的是蛋白質分子表面疏水性氨基酸的相對含量，是評估蛋白構象穩定性的重要指標之一[19]。不同解凍方式對冷凍雞腿肉表面疏水性的影響如圖3所示，微波解凍的表面疏水性(16.43 μg)，顯著高于其他3種解凍方式(P<0.05)，這說明微波解凍會改變肌原纖維蛋白的構象，使蛋白質發生降解作用及變性作用，蛋白質內部的疏水基團大量暴露，最終導致表面疏水性含量增高[20]。流水解凍的表面疏水性最低，為10.36 μg(P<0.05)，說明流水解凍方式下的雞腿肉的蛋白構象變化較小。冷藏解凍由于解凍溫度低，能夠有效抑制微生物的生長，抑制蛋白的變性程度，因此其表面疏水性較低(12.86 μg)，這與陳勝[21]的研究結果相似。

圖3 不同解凍方式對雞腿肉表面疏水性的影響Fig.3 Effect of different thawing methods on the surface hydrophobicity of chicken thigh meat

2.4 不同解凍方式對雞腿肉Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase活性主要源自肌球蛋白，Ca2+-ATPase活性的降低可能是因為肌球蛋白的球狀頭部結構發生改變以及蛋白質分子的聚集[22]。由圖4可知，室溫解凍對雞腿肉的Ca2+-ATPase活性影響程度最大，Ca2+-ATPase活性為0.72 U/mg，說明室溫解凍與其他3種解凍方式相比，酶活性損失較大，該種解凍方式對肌球蛋白的影響較大，肌球蛋白變性程度嚴重。有學者認為，Ca2+-ATPase活性與巰基的變化有關，肌球蛋白頭部巰基的氧化會使Ca2+-ATPase活性下降[23]。研究發現室溫解凍的巰基含量最低，這可能是導致室溫解凍組Ca2+-ATPase活性較低的原因。

圖4 不同解凍方式對雞腿肉Ca2+-ATPase活性的影響Fig.4 Effect of different thawing methods on the Ca2+-ATPase activity of chicken thigh meat

2.5 不同解凍方式對雞腿肉SDS-PAGE的影響

SDS-PAGE分析可以反映蛋白是否發生氧化，其蛋白亞基是否發生降解或聚集反應[24]。不同解凍方式對雞腿肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響如圖5所示。通過比對分子質量可以辨別出圖中由上到下依次為肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)、副肌球蛋白(paramyosin)、肌動蛋白(actin)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)，其中MHC和actin是主要的蛋白質條帶。在本研究中，4種解凍方式中MHC條帶邊緣模糊，蛋白有降解現象；actin條帶的變化差異并不明顯；MLC條帶則有明顯變化，有發生降解或聚集。MLC條帶中冷藏解凍條帶顏色變深，分子質量增大，發生了聚集；室溫解凍條帶顏色最弱，說明該組的肌原纖維蛋白降解程度較大。

圖5 不同解凍方式下雞腿肉的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE profiles of chicken thigh meat with different thawing methods

2.6 不同解凍方式對雞腿肉組織結構的影響

不同解凍方式對肌束膜的破壞有不同程度的影響，肌束膜一旦遭受破壞，其肌肉組織的完整性和致密結構也會受到影響[22]，具體表現為肌纖維間隙變大，肌肉保水性下降，汁液損失嚴重等。不同解凍方式雞腿肉的縱切面如圖6所示。結合表1數據可知，室溫解凍的肌纖維間隙較明顯，可能是因為雞腿肉暴露在空氣中的時間較長導致的蛋白變性，引起肌肉松弛，肌纖維間隙增大[22]。流水解凍后的雞腿肉的肌纖維間隙較小，肌束結合相對緊密，說明流水解凍方式的保水性較好。冷藏解凍的肌纖維間隙僅次于流水解凍，可能是低溫抑制了蛋白酶活性和肌纖維降解。微波解凍后的雞腿肉出現明顯的肌原纖維收縮斷裂的現象，這可能是因為微波解凍過程中樣品局部加熱導致部分肉熟化甚至過度脫水，從而導致其肌纖維間隙增大，組織結構的緊密性下降，結構破壞嚴重[25]。

a-室溫解凍；b-流水解凍；c-冷藏解凍；d-微波解凍圖6 不同解凍方式對雞腿肉組織結構的影響Fig.6 Effect of different thawing methods on the tissue structure of chicken thigh meat

表1 不同解凍方式對雞腿肉肌纖維間距的影響Table 1 Effect of different thawing methods on muscle fiber spacing of chicken thigh meat

2.7 不同解凍方式對肌原纖維蛋白二級結構的影響

酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)是反映蛋白質二級結構的主要譜帶[26]。包括β-折疊(1 615～1 637 cm-1)、無規則卷曲(1 640～1 648 cm-1)、α-螺旋(1 650～1 664 cm-1)、β-轉角(1 673～1 686 cm-1)[27]。

利用軟件PeakFit v 4.12對拉曼圖譜進行擬合分析得到圖7和圖8。如圖7所示，不同解凍方式對冷凍雞腿肉MP結構有顯著影響。就拉曼峰的相對強度來看，流水解凍組樣品的拉曼強度要高于其他3種解凍方式，室溫解凍組的拉曼強度最低。說明室溫解凍破壞了肌原纖維蛋白原有的二級結構，形成了新的蛋白質結構。由圖8可知，流水解凍組α-螺旋含量最高(58%)，表明蛋白質結構狀態良好，穩定性強[12]，由此說明流水解凍對蛋白質二級結構的影響最小。而微波解凍組α-螺旋含量最少(29%)，β-折疊含量相對較高(18%)，這可能是因為解凍過程中受熱不均，且局部熟化導致α-螺旋向其他結構轉化[20]，從而導致其蛋白質穩定性降低。雞腿肉經室溫解凍后，β-轉角含量(26%)和無規則卷曲含量(31%)相對較高，無規則卷曲含量越多，則說明蛋白質結構紊亂，蛋白質的變性程度大[12]，因此室溫解凍組的蛋白質二級結構的穩定性較差。

a-室溫解凍;b-流水解凍；c-冷藏解凍；d-微波解凍圖7 不同解凍方式對肌原纖維蛋白的拉曼光譜擬合曲線圖Fig.7 Raman spectrum fitting curve of myofibrillar protein by different thawing method

圖8 不同解凍方式對肌原纖維蛋白二級結構 分布比例的影響Fig.8 Effect of different thawing method on the distribution ratio of myofibrillar protein secondary structure

3 結論

試驗結果表明，室溫解凍的羰基含量(3.63 nmol/mg)、巰基含量(110.55 μmol/g)和Ca2+-ATPase活性(0.72 U/mg)最低，蛋白氧化最為嚴重；肌球蛋白輕鏈條帶模糊，有輕微降解現象；拉曼強度最低，且β-折疊和無規則卷曲含量相對較高，蛋白質結構的穩定性較差。流水解凍的羰基含量(0.97 nmol/mg)和表面疏水性最低(10.36 μg)， Ca2+-ATPase活性最高(2.95 U/mg)，其蛋白氧化程度較輕，組織結構緊密；拉曼強度和α-螺旋含量(58%)最高，蛋白質二級結構完整性較好。冷藏解凍的巰基含量最高(258.23 μmol/g)，巰基損失較??；肌球蛋白輕鏈條帶聚集；微波解凍的組織結構破壞嚴重，有肌纖維斷裂和肌纖維間隙增大等現象；蛋白質二級結構較紊亂，α-螺旋結構向其他無序結構轉化。綜上所述，流水解凍對冷凍雞腿肉的蛋白影響較小，是較為理想的解凍方式。