頂空固相微萃取/氣質聯用技術結合電子鼻分析類干酪乳桿菌發酵豆渣飲料過程中風味特征

宋虹，李一雪，李然，張尊琴，許新月，楊立娜，王勝男，朱丹實，劉軍，霍達非，劉賀*

1(渤海大學 食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州，121013) 2(山東禹王生態食業有限公司，山東 禹城，251200)3(遼寧豆華天寶食品科技股份有限公司，遼寧 沈陽，110000)

豆渣是大豆加工過程中產生的副產物，富含蛋白質、膳食纖維等營養成分，還含有大豆異黃酮、大豆皂苷等活性物質，具有預防心腦血管疾病、減肥等生理功效，對人體健康具有促進作用[1-2]。豆渣原料廉價易得，是一種低脂低糖髙膳食纖維的食物資源，具有很好的開發應用前景。但是由于豆腥味和低聚糖等不良因素的存在，豆渣的消費一直受到限制[3-4]。傳統豆渣僅用于動物飼料，甚至會被丟棄，導致資源浪費和環境污染。豆渣制品中的豆腥味主要來源于各類鏈長比較短的醛、醇、酮等揮發性物質，這些物質是脂肪氧化酶催化的亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸形成的。因此，如何更有效地改善豆渣制品風味成為研究熱點。

豆渣加工再利用的方法中，微生物發酵法是一種可行的方法。豆渣中富含的多種營養物質為微生物的生長提供了良好的條件[5]。發酵豆渣中的大豆蛋白能被分解為氨基酸和寡肽，破壞豆渣中的胰蛋白酶抑制劑、脹氣因子等抗營養因子，更容易被人體吸收[6]。益生菌有較強的代謝碳水化合物產酸能力，可以改善豆渣制品的風味和質地，提高營養價值，并能降低或去除豆渣本身的豆腥味[3]。類干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)對酸、膽鹽具有良好的抵抗力，黏附性較強，能定殖于腸道，耐受人體消化系統的防御機制，是一株具有廣闊應用前景的潛在功能性益生菌[7]。熊濤等[8]通過體外細胞模型(人體結腸腺癌細胞系Caco-2細胞)測定副干酪乳桿菌NCU622的黏附性能，結果表明副干酪乳桿菌NCU622具有良好的耐酸耐膽鹽能力及較強的黏附性能，且對Caco-2細胞無裂解作用，符合微生態制劑和乳酸菌發酵功能食品的菌種要求。LIU等[9]采用酸米湯與副干酪乳桿菌和馬克斯克魯維酵母進行混合發酵，提高了酸米湯的產酸和香氣，縮短其發酵時間，風味和品質特性明顯得到改善。

目前針對益生菌發酵豆渣飲料的揮發性芳香物質的組成以及特征氣味分析的研究較少，且有關于豆渣的發酵研究多集中在其發酵前后的風味對比或是一些工藝的優化。因此，本研究選用類干酪乳桿菌為發酵菌種與豆渣混合發酵制成豆渣飲料，并對該豆渣飲料發酵過程中風味物質的組成與差異進行分析。旨在為豆渣的綜合利用以及益生菌發酵豆渣飲料的開發與生產提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮豆渣，盤錦宋大房豆制品廠；類干酪乳桿菌CICC 6244，中國工業微生物菌種保藏管理中心；白砂糖、無水檸檬酸、穩定劑(果膠、羧甲基纖維素鈉)、維生素C、菠蘿香精，廣東永信食品配料公司；環己酮，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

JM50膠體磨，上海貝工泵業制造有限公司；QDGX-18高精密濕法超細粉碎機，無錫輕大食品設備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH-250F生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9243BS-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海新苗醫療器械制造有限公司；CHROMA METER CR-400色彩色差計，日本Minolta公司；PEN3電子鼻，日本Insent公司；A7890氣相色譜-質譜聯用儀、P-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵豆渣飲料的制備

新鮮豆渣經過2%～4%食用堿處理后，90 ℃水浴加熱60 min，并用紗布濾去脫腥用堿，經清水清洗，最后采用食品級檸檬酸溶液中和過量堿，與水質量比為1∶10，過膠體磨和濕法粉碎機，制成豆渣原漿。加入8%白砂糖、0.15%檸檬酸、1%維生素C、0.2%菠蘿香精、0.3%穩定劑[m(果膠)∶m(羧甲基纖維素鈉)=1∶1]，均質20 min，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻之后接種，接種體積分數為3%菌液(108CFU/mL)的種子液，37 ℃發酵24 h，于4 ℃冰箱保藏。分別于發酵0、6、12、18、24 h取樣，以0 h代表未發酵豆渣飲料，作為對照組(CK)。

1.2.2 色差測定

豆渣飲料的色澤指標用全自動色彩色差計CR-400通過反射法進行測定。L*值表示亮度；a*值表示紅綠偏向；b*值表示黃藍偏向[10]。

1.2.3 不同發酵時間的豆渣飲料香氣成分檢測

1.2.3.1 感官評價

采用9點快感標度法[11]對發酵過程中豆渣飲料的感官品質進行評價，20名受試者對5種豆渣飲料進行感官評估，其中包括學生和教職員工(10名男性和10名女性)，對顏色、酸甜度、香氣、味道、體態、風味和整體接受性7個性質進行評價，評級范圍從極度不喜歡(1分)到極度喜歡(9分)。

1.2.3.2 電子鼻分析

樣品預處理：取10 mL樣品于50 mL樣品瓶中，用保鮮膜密封并蓋上瓶蓋。平衡20 min后進行檢測，每個樣品重復6次。

檢測條件：采用頂空抽樣的方法，不同傳感器的性能參考王當豐等[12]的描述如表1，電子鼻樣品準備時間5 s，清洗時間100 s，檢測時間120 s。分析樣品的風味成分信息，進行3次重復實驗。59～61 s數據較穩定，可進行分析。運用PEN3型電子鼻配套軟件WinMuster對數據進行主成分分析(principal component analysis，PCA)、負荷加載(loadings)分析和線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)。

表1 PEN3 便攜式標準傳感器陣列及性能Table 1 PEN3 portable standard sensor array and performance

1.2.3.3 GC-MS分析

樣品處理：樣品用量5.0 g、內標環己酮10 μg，加入15 mL帶聚四氟乙烯隔膜的頂空瓶中，在55 ℃水浴處理10 min，向該瓶中插入SPME手動進樣柄的針頭。讓其在空氣中進行萃取反應，30 min后將其插入氣相色譜-質譜進樣口，在250 ℃環境下解析5 min。

色譜條件：分離柱，HP-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；載氣為He；載氣流速0.8 mL/min；不分流進樣；采用程序升溫方式，柱箱初始溫度35 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至65 ℃，再以3 ℃/min升至110 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃保持5 min。

質譜條件：離子化模式，EI+；電子能70 eV；離子源溫度200 ℃；發射電流200 μA；傳輸溫度250 ℃；檢測氣壓350 V；數據采集，全掃描。

定性定量分析：利用質譜全離子掃描圖譜及NIST質譜數據庫，相似度≥80%初步判定為目標化合物，并根據C8～C20烷烴混合標準品的保留時間，用保留指數法(retention index，RI)對揮發性物質進行定性，揮發性組分采用加入內標物質進行半定量分析[13]。

1.3 數據處理

采用Origin 2018和SPSS 22.0進行圖像繪制及數據處理。平均值的差異性用單因素方差分析(ANOVA)中的最小顯著差異法(least significant difference，LSD)檢驗。除電子鼻外，所有試驗均重復3次，數值用平均值±標準差表示，P<0.05為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 色差分析

表2給出了不同發酵時間豆渣飲料的顏色分析結果，結合圖1可知，與CK組豆渣飲料相比，隨著發酵時間的延長，L*值、b*值逐漸升高，呈現出更飽和的淡黃色。a*值較穩定，高溫處理促進酶失活，這有助于維持特征顏色。

圖1 不同發酵時間的豆渣飲料Fig.1 Okara beverages with different fermentation times

表2 發酵豆渣飲料的色澤Table 2 Color of fermented okara beverages

2.2 不同發酵時間豆渣飲料的感官評價

由表3可知，5種豆渣飲料除體態指標差異不顯著外，其余均差異顯著(P<0.05)。CK組豆渣飲料呈現乳白色，隨著發酵時間的延長，顏色逐漸呈現淺黃色，更具感官吸引力，平均分高。酸甜度在喜好程度評分中得分最高的是18 h組(6.23±0.25)，CK組酸味明顯，導致得分較低(P<0.05)；香氣方面，發酵后有明顯的豆香味，18 h組得分較高(P<0.05)；味道方面，CK組豆渣飲料味道寡淡，有豆腥味，發酵24 h味道酸甜清爽且豆香味濃郁(P<0.05)；體態方面，所有樣品均在6分左右，無沉淀、穩定性較好；發酵組較未發酵組在風味方面得到明顯改善；整體接受性得分最高的是24 h組(P<0.05)。24 h組在顏色(6.33±0.25)、酸甜度(6.23±0.21)、香氣(6.03±0.15)得分處于中上等，味道(7.10±0.10)、風味(6.90±0.17)和整體(7.40±0.10)得分最高(P<0.05)。發酵24 h組在一定程度上改善了豆渣飲料的感官品質，使得豆渣飲料口感更佳。

表3 不同發酵時間豆渣飲料感官喜好程度評分結果Table 3 Score results of sensory preference of okara beverages at different fermentation times

2.3 電子鼻分析

5種樣品氣味差異的電子鼻分析見圖2。各樣品之間有一定的差異，W5S、W1W和W1S三個傳感器對每組豆渣飲料的信號值都較大，尤其是W5S(對氮氧化合物靈敏)和W1W(對硫化物靈敏)。發酵24 h組與CK組相比，W1W顯著降低，W1S有上升趨勢，W5S顯著增加。其他7個傳感器的信號值在不同種類之間基本是相似的，并且幾乎重疊，表明這7個傳感器檢測出的揮發性物質組成基本一致。硫化物在食品中含量很低，呈味閾值也極低，通過加工過程中發生的美拉德反應形成，對谷物加工做出很大貢獻，因此加入類干酪乳桿菌發酵可在一定程度上抑制美拉德反應[14]。

圖2 不同發酵時間豆渣飲料電子鼻分析雷達圖Fig.2 Electronic nose analysis radar of okara beverages at different fermentation times

圖3為5種樣品的電子鼻PCA圖。第1和第2主成分(PC1，PC2)的貢獻率分別為98.96%和0.75%，總貢獻率為99.71%。不同樣品之間位置較分散，不同樣品之間互不重疊，氣味差異較大且從右到左呈現一定的變化趨勢。發酵24 h組與CK、0、6、12、18 h組均距離較遠，說明發酵24 h組與其他4組豆渣飲料風味各不相同，均存在顯著性差異。其原因是類干酪乳桿菌在發酵6 h后進入對數生長期，在此階段，豆渣飲料中的碳水化合物和蛋白質被大量分解，產生各種揮發性化合物[15]。隨著發酵時間的延長，在嗅覺上呈現一定的變化規律。由圖2可知，與氣味變化最密切相關的是氮氧化合物，整個發酵過程中其含量明顯增加，其次是無機硫化物含量顯著降低，而其他類別化合物含量并無明顯變化。

圖3 不同發酵時間豆渣飲料PCA圖Fig.3 PCA plot of okara beverages at different fermentation times

Loadings分析可區分出樣品中起主要作用的揮發性風味成分。由圖4可知，W5S傳感器對第1主成分貢獻率最大，其次是W1W，W1S傳感器對第2主成分貢獻率最大。參照各傳感器的性能特征可知，第1主成分主要對氮氧化物、硫化物敏感，第2主成分對碳氫化合物敏感[16]。

圖4 不同發酵時間豆渣飲料Loadings分析圖Fig.4 Loadings analysis of okara beverages at different fermentation times

不同發酵時間的豆渣飲料的LDA結果見圖5，第1主成分區分貢獻率為68.07%，第2主成分區分貢獻率為26.37%，主成分總的貢獻率達94.44%，5個樣品中，除了CK組和6 h組相距較近，其他樣品兩兩之間都相距較遠，可以在LDA完全區分開，這與感官審評結果一致，表明不同發酵時間對豆渣飲料香氣的改變差異較大。整體結果對比PCA較為相似，說明不同發酵時間豆渣飲料均可以被電子鼻顯著區分。

圖5 不同發酵時間豆渣飲料LDA圖Fig.5 LDA plot of okara beverages at different fermentation times

2.4 頂空固相微萃取/氣質聯用技術(solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry，SPME/GC-MS)分析不同發酵階段豆渣飲料揮發性成分

利用SPME/GC-MS對不同發酵階段的豆渣飲料揮發性物質進行分析，共檢測出87種揮發性風味物質，包括醇類24種、醛類8種、酸類10種、酮類7種、烴類14種、酯類17種和其他化合物7種(見電子增強出版附件1，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033142)。發酵24 h比CK組增加了20種揮發性風味物質，揮發性香氣成分的增加或生成是發酵豆渣飲料提升感官品質的重要因素。

2.4.1 醇類化合物

4組發酵豆渣飲料中醇類化合物種類及含量顯著增多。其中，1-壬醇有玫瑰和橙子香氣，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、玫瑰和干草香氣[17]，1-己醇具有水果香，1-庚醇具有土質、油質的風味[18]。在發酵6、12和24 h均檢測出α-松油醇，α-松油醇有紫丁香氣味，這些醇類賦予益生菌發酵豆渣飲料鮮香醇厚的特征香氣，對豆渣飲料香氣的形成具有促進作用[19]。其中，1-辛烯-3-醇被認為是豆腥味[20]，隨著發酵的進行逐漸消失。發酵期間檢測到1-己醇的含量分別為2.69、2.69、3.48、3.95和3.55 μg/g。1-壬醇的含量分別為3.23、3.37、2.02、2.62和2.31 μg/g。2，4-癸二烯-1-醇的含量分別為1.56、3.94和4.26 μg/g、0、0(具體數據見電子增強出版附件1)。

2.4.2 醛類化合物

醛類化合物是脂質降解產物，在揮發性成分中含量高且閾值較低，對樣品整體風味形成貢獻大，這也是豆渣飲料發酵過程中形成豆腥味的主要原因[21]。豆渣飲料發酵階段共檢測出8種醛類化合物，總含量隨發酵時間的延長顯著降低，其中CK組豆渣飲料中醛類化合物的總含量最高為17.87 μg/g，發酵24 h后的醛類化合物的含量顯著減少到5.44 μg/g(P<0.05)(圖6-a)。CK組豆渣飲料中含有(E)-2-己烯醛、壬醛、(E，E)-2，4-癸二烯醛3種被定義為豆腥味的物質[20]。4組發酵豆渣飲料中，以上3種醛類化合物均顯著降低或消失。這與前人結果一致，也解釋了發酵使豆渣飲料豆腥味減弱[22]?？啡┚哂锌嘈尤饰?、癸醛具有清爽的芳香味脂肪氣息、2，4-壬二烯醛具有柑橘味甜瓜和黃瓜味[23]，賦予豆渣飲料獨特的風味。

2.4.3 酸類化合物

己酸具有奶酪、辛辣的味道，辛酸具有腐敗、刺激氣味，己酸是含量較高的酸類化合物，分別為0.33、0.94、0.93、1.37、1.98 μg/g(見電子增強出版附件1)。己酸賦予發酵豆渣飲料爽口的酸味，是發酵豆渣飲料中重要的風味化合物。

2.4.4 酮類化合物

酮類化合物是由于多不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解或微生物代謝產生的[24]。在發酵12 h時其含量達到最大為0.67 μg/g(圖6-a)。在酮類物質中，2-壬酮呈水果、花、油脂和藥草似香氣，在豆渣飲料中的含量遠高于其他酮類化合物。

2.4.5 酯類化合物

酯類化合物具有水果香氣和甜香，其中，己酸己酯有水果味、熱帶風味清香，辛酸甲酯有甜橙味，庚酸烯丙酯有菠蘿香，這些酯類對豆渣飲料香氣有積極的影響。影響發酵豆渣飲料風味的最重要化合物是辛酸甲酯，檢測到的含量分別為2.84、4.93、4.82、5.26、5.70 μg/g(見電子增強出版附件1)。

2.4.6 烷烴類化合物

從豆渣飲料中共鑒定出14種烴類化合物，大部分烷烴類化合物閾值水平較高，對整體香氣幾乎沒有貢獻[25]。發酵18 h含量最高為3.75 μg/g(圖6-a)。

a-揮發性物質含量；b-豆腥味揮發性物質含量圖6 不同發酵時間豆渣飲料含量變化Fig.6 Content change of okara beverages at different fermentation times

2.4.7 其他化合物

豆渣飲料中還檢出呋喃類和苯酚類等7種化合物，這些化合物在發酵24 h后的種類和含量比發酵初期都有明顯的增加(圖6-a)。茴香腦具有獨特甘草風味，2-戊基呋喃呈豆腥味，隨著發酵時間的延長，2-戊基呋喃含量有降低趨勢(見電子增強出版附件1)。在后發酵階段醛、酮、酸類化合物揮發性風味物質總含量較低，卻是豆渣飲料風味中不可缺少的成分[26-27]。在后發酵階段酸類和醛類物質含量相差不大，但醛類物質香氣濃烈，以花果香味為主，微量的醛類的香味在豆渣飲料中起到調和作用[28]。

2.5 豆渣飲料致豆腥味揮發性物質分析

本研究豆渣飲料中檢測到的致豆腥味的物質有1-辛烯-3-醇、(E)-2-己烯醛、壬醛、(E，E)-2，4-癸二烯醛、2-戊基呋喃。圖6-b為各致豆腥味揮發性物質含量變化，其中決定豆腥味的揮發性物質(E，E)-2，4-癸二烯醛含量顯著降低(P<0.05)，發酵24 h組(2.81 μg/g)顯著低于CK組(17.87 μg/g)(P<0.05)；1-辛烯-3-醇、(E)-2-己烯醛、壬醛、2-戊基呋喃含量降低。此外，發酵過程中可能導致豆腥味難以消除的原因是風味物質能與大豆蛋白發生疏水結合，其結合常數隨碳鏈數的增加而增加[20, 29]。

2.6 不同發酵時間豆渣飲料樣品聚類分析

利用層次聚類作為一種初步方法，評估不同樣品的芳香圖譜之間的定量關系。由圖7所示，CK組與4組發酵豆渣飲料相比，揮發性氣味物質的差異變化顯著，與主成分分析結果相似。CK組中(E)-2-己烯醛、壬醛、(E，E)-2，4-癸二烯醛含量遠高于發酵豆渣飲料樣品，由此可知，發酵24 h組致豆腥味揮發性風味物質含量更低，與CK組差異顯著(P<0.05)。在所有樣品中，4-癸醇、3-羥基己酸乙酯、乙酸庚基酯、辛酸甲酯、壬酸、(Z)-2-庚烯醛、2，4-壬二烯醛、3-壬烯-1-醇、庚酸、1-癸醇、3-辛烯-2-酮、庚酸烯丙酯、2-庚烯-1-醇、2-十三烯酸、溴乙酸癸酯、氯乙酸含量差異最大，表明類干酪乳桿菌發酵參與了與豆渣飲料中揮發性香氣合成相關的代謝途徑，是影響豆渣飲料香氣特征的主要因素。

圖7 不同發酵時間豆渣飲料樣品聚類分析Fig.7 Cluster analysis of okara beverage samples at different fermentation times

3 結論

本研究應用SPME/GC-MS技術結合電子鼻檢測分析類干酪乳桿菌發酵豆渣飲料過程中的揮發性風味物質。SPME/GC-MS結果表明，5種豆渣飲料樣品在發酵過程中共檢測出87種揮發性成分，其中醇類24種、醛類8種、酸類10種、酮類7種、烴類14種、酯類17種和其他化合物7種，醛類和醇類揮發性物質對豆渣飲料風味的影響起關鍵作用，類干酪乳桿菌發酵使豆渣飲料形成新的風味。電子鼻對不同發酵時間豆渣飲料的揮發性物質進行檢測與分析，同時PCA、Loadings及LDA能有效區分不同發酵時間樣品的品質變化。綜合上述風味物質和氣味的變化，類干酪乳桿菌發酵豆渣飲料24 h趨于成熟，是品質最佳點。研究結果將為功能性谷物飲料的開發提供新的思路。