基于頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜和主成分分析法研究不同發酵原料對草莓酒香氣成分的影響

李濤，周穎，張軍，楊梅，馮翰杰，張順屹，杜晴云

(天津農學院 食品科學與生物工程學院，天津，300392)

草莓是薔薇科多年生草本植物，果實呈鮮紅色，香氣濃郁，富含維生素、花色苷和酚類物質，具有防便秘、抗氧化及預防心腦血管疾病等功效，被譽為“水果皇后”[1-2]。果酒是以水果為原料，經調整成分，酒精發酵等工藝釀制而成，其營養豐富、色澤誘人，適量飲用有助于身體健康[3]。以草莓為原料釀造的草莓果酒，既可以豐富果酒市場，提高草莓的利用率和附加值，也可以解決草莓不耐儲藏、貨架期短等問題。目前國外關于草莓酒的研究少有報道，而國內對草莓酒的研究主要集中在釀造工藝的優化[4]和酵母菌種的篩選[5]等方面。跟葡萄酒相比，草莓酒的發酵工藝還不成熟，市面上草莓酒的種類較少。不同發酵工藝對果酒的香氣品質有很大的影響。周雪艷等[6]發現不同發酵方式(清汁發酵、濁汁發酵、帶渣發酵、加酶帶渣發酵)對鴨梨酒的香氣成分種類及其含量具有顯著影響，青汁發酵的鴨梨酒品質更優。傅力等[7]以賽買提杏為原料，采用杏汁和杏漿2種不同發酵方式進行發酵，結果表明杏汁發酵的杏酒酒體柔和豐滿，感官品質較好，而杏漿發酵的酒口感較粗糙。

頂空固相微萃取(head space solid-phase micro-extraction，HS-SPME)技術作為樣品前處理方法，具有操作簡單、高效、成本低等優點[8]，該技術常與GC-MS聯用，用于快速分析物質中的揮發性成分，目前在生命科學、食品、藥品、化工、香精油等方面具有廣泛應用[9]。香氣是評價果酒感官品質的重要指標，決定著產品的風格與典型性，其受原料品種、發酵方式、酵母種類、澄清工藝、儲藏條件等因素影響[10]。葉文斌等[11]采用HS-SPME-GC-MS對東方草莓酒揮發性香味成分進行分離和鑒定,共鑒定出32種香氣物質，其中異戊醇、2-甲基丙醇、正丙醇、乙縮醛二乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯等物質為草莓酒的主要香氣成分。時寬芹[12]通過HS-SPME-GC-MS方法分析了法蘭地草莓酒的揮發性成分及含量，樣品中共檢測出78種香氣物質，其中酯類和醇類含量最多，乙酸異戊酯、乙酸己酯、辛酸乙酯和乙醛的氣味活性值較高，對草莓酒風味有重要貢獻。

本研究以紅顏草莓為原料，采用HS-SPME-GC-MS和主成分分析方法對草莓汁及草莓酒進行香氣成分分析，研究2種不同發酵原料(去梗草莓和帶梗草莓)對草莓酒基本理化指標、香氣成分和感官特性的影響，以期為進一步研究草莓酒的工藝優化及香氣成分分析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓，2021年4月中旬采于北京欣寶萊科技有限公司，總糖質量濃度為108 g/L，總酸質量濃度為6.25 g/L(以酒石酸計)，挑選成熟度好、無污染無破損的新鮮紅顏品種草莓為原料。

果膠酶(食品級)、DL-酒石酸，河南萬邦實業有限公司；F15酵母、焦亞硫酸鉀(食品級)，法國Laffort公司；白砂糖，北京糖業煙酒集團有限公司；福林-酚試劑，天津市光復精細化工研究所；2-辛醇(色譜純)，上海泰坦科技股份有限公司；NaCl、NaOH、HCl、葡萄糖等試劑均為國產分析純，上海國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-7890氣相色譜質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司；HH系列數顯型恒溫水浴鍋，江蘇科研儀器有限公司；HPX-250生化培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；雷磁pHS-25型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；L4紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；手動破碎機，宜仟家釀酒設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵工藝流程及操作要點

草莓→清洗→輕度破碎→草莓果漿→調整成分→接種酵母→酒精發酵→皮渣分離→清汁發酵→結束發酵→倒灌澄清→除菌過濾→裝瓶→測定指標

草莓果漿的制備：挑選成熟度好、無污染無破損的新鮮草莓，清水沖洗，去梗發酵先去除草莓果梗及萼片，帶梗發酵直接破碎入罐，得到草莓果漿。

調整成分：添加100 mg/L焦亞硫酸鉀防止氧化，30 min后加入40 mg/L果膠酶，用白砂糖調整總糖質量濃度為200 g/L，酒石酸調整總酸質量濃度為7.5 g/L(以酒石酸計)。

接種酵母：酵母的接種量為0.2 g/L。將稱量好的酵母按料液比1∶10(g∶mL)加入蒸餾水，在37 ℃恒溫水浴鍋中活化25 min，然后倒入發酵罐中攪拌均勻。

酒精發酵：發酵溫度為18 ℃，每隔24 h測一次溫度和比重(相對密度)，當果肉接近無色時，皮渣分離。

清汁發酵：分離完皮渣的草莓清汁繼續酒精發酵，當連續2次比重不再變化時，發酵結束。

倒罐澄清：倒罐，去除酒泥，加入100 mg/L焦亞硫酸鉀終止發酵，4 ℃條件下自然澄清，1個月后過濾裝瓶。

1.3.2 基本理化指標的測定

總酸(以酒石酸計)采用指示劑法測定；揮發酸(以乙酸計)采用滴定法測定；pH值采用pH計測定；游離及總SO2采用直接碘量法測定；還原糖(以葡萄糖計)采用斐林試劑法測定；乙醇體積分數采用密度瓶法測定；總酚采用福林酚比色法測定[13]。所有指標均重復測定3次。

1.3.3 揮發性香氣成分的測定[14]

香氣成分萃?。悍謩e吸取10 mL酒樣放于20 mL頂空瓶中，加入2 g NaCl(可促進揮發性香氣成分揮發)和10 μL 2-辛醇內標(質量濃度為500 μg/L)，置于恒溫磁力攪拌加熱平臺上，45 ℃預熱10 min。待頂空瓶中樣品香氣達到飽和之后，將萃取頭伸入頂空瓶中，45 ℃吸附40 min后拔出，插入氣相色譜進樣口，230 ℃熱解析3 min。最后進行數據采集分析。

色譜條件：色譜柱為DB-WAX毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(純度為99.999%)，流速為1 mL/min；手動進樣；進樣口溫度230 ℃；升溫程序：起始柱溫35 ℃(保持3 min)，以6 ℃/min升溫至150 ℃(保持1 min)，再以12 ℃/min升溫至230 ℃(保持3 min)。

質譜條件：電子電離源(electron ionization,EI)，電子能量70 eV；掃描范圍m/z20～550；離子源溫度230 ℃；接口溫度230 ℃。

草莓汁揮發性香氣成分的測定方法同草莓酒。

1.3.4 香氣成分分析[15]

定性：通過查閱相關文獻和計算機譜庫(NIST/Wiley)檢索，對GC-MS分析得到的質譜數據進行定性(匹配度>800，最大值為1 000)。

定量：采用半定量法，以2-辛醇(質量濃度為500 μg/L)作為內標物，對草莓酒和草莓汁樣品中各香氣成分進行定量，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρX，各香氣物質的質量濃度，μg/L；A，酒樣中測得香氣物質的峰面積；ρ，2-辛醇的質量濃度，μg/L；A0，2-辛醇的峰面積。

1.3.5 感官評價

在標準品嘗室中，由7名經過專業培訓的品嘗員組成感官分析品嘗小組，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對草莓酒進行感官分析。

1.4 數據處理

用SPSS 26.0進行顯著性和主成分分析，Excel 2021和Origin 2021進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 發酵原料對草莓酒理化指標的影響

由表1可知，2種不同原料釀造的草莓酒還原糖質量濃度均小于4 g/L，按照GB/T 15037—2006《葡萄酒》理化指標規定，屬于干型果酒。酒樣中總酸質量濃度均大于8 g/L，pH在3.4～3.6，帶梗發酵草莓酒中總酸含量較高，pH值較低，可能是由發酵過程中草莓果梗及萼片中的酸類物質釋放到酒中所致。起始糖度一樣，而帶梗發酵草莓酒中的酒精體積分數顯著高于去梗發酵草莓酒，可能是果梗的加入提高了乙醇的轉化率所致。從總酚質量濃度來看，帶梗發酵草莓酒中含量較高，為(272.5±0.01)mg/L，是去梗發酵草莓酒的1.34倍，據報道，酚類物質主要存在于果梗、果皮和種子中，隨著酒精發酵的進行會進入果酒中，賦予果酒收斂感和苦澀味[16]。乙酸對果酒風味品質的影響是負面的，研究發現，乙酸質量濃度在200～700 mg/L較為適宜，而高于700 mg/L時，會使果酒產生酸敗感和溶劑味[17]。如表1所示，2種草莓酒中揮發酸質量濃度(以乙酸計)均小于1.2 g/L，符合國標GB/T 15037—2006《葡萄酒》要求，總SO2含量和游離SO2含量也符合GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》限量要求。

表1 草莓酒的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of strawberry wines

2.2 發酵原料對草莓酒香氣成分的影響

香氣是評價果酒品質的重要指標[10]，實驗采用HS-SPME-GC-MS技術，對草莓汁及2種草莓酒進行揮發性香氣成分測定，結果如表2所示，草莓酒中共檢測出40種香氣物質，包括醇類7種、酯類18種、酸類3種、醛酮類1種、萜烯類8種、烷類2種和其他類1種，占香氣總量的42.43%、49.57%、0.51%、0.28%、5.14%、1.48%和0.59%，其中酯類物質種類最多，含量最高。

2種不同原料釀造的草莓酒樣品中，分別檢測出35種和29種香氣物質，占酒樣香氣總量的62.32%和37.68%，可見去梗發酵草莓酒中無論是香氣種類還是香氣總量均高于帶梗發酵草莓酒。

表2 草莓汁及草莓酒香氣化合物的組成及含量Table 2 Composition and content of aroma compounds in strawberry juice and strawberry wines

醇類物質是構成果酒酒味特征的基本香氣化合物，能賦予果酒復雜感，醇類物質一部分來源于果實自身無氧代謝，另一部分來源于酵母菌酒精發酵過程中氨基酸代謝或糖代謝[18-20]。由表2可知，草莓酒樣品中共檢測出7種醇類物質，有4種為共有物質。醇類物質在帶梗發酵草莓酒中含量最高，為68.80%，是其主要香氣成分。其中異戊醇是草莓酒中含量最高的醇類物質，賦予草莓酒白蘭地香氣或辛辣味，特別是在帶梗發酵草莓酒中，含量達到了63.12%，研究報道，異戊醇含量過高對果酒的風味會產生不良影響[21]。此外，苯乙醇、2-戊醇在酒樣中均檢出，它們賦予草莓酒玫瑰香、花香和蜜香[8]。酒樣中的正己醇主要來源于草莓果實，在草莓汁樣品中也被檢出，賦予酒體青草味[21]。

酯類物質是構成果酒的重要香氣物質，主要產生于酒精發酵，能賦予果酒濃郁的花香和果香[22]。由表2可知，2種酒樣中分別檢測出17種和12種酯類物質，有11種為草莓酒中共有，其中去梗發酵草莓酒中酯類物質含量最高，為65.35%，而帶梗發酵草莓酒中僅占23.47%，酯類物質是去梗發酵草莓酒中的主要香氣物質。辛酸乙酯、癸酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯和肉桂酸乙酯在2種酒樣中均檢出，且含量均較高，賦予草莓酒青蘋果、草莓、菠蘿、梨、花香、果香和脂肪味[23]，其中肉桂酸乙酯和丁酸乙酯主要來源于草莓果實，在草莓汁中均檢出。乙酸己酯、丁酸芳樟酯、乙酸苯乙酯、5-甲基-壬酸乙酯、癸酸異戊酯和十四酸乙酯僅在去梗發酵草莓酒樣品中檢出，是該樣品的特有香氣成分，賦予酒體梨、櫻桃、香蕉等清甜水果香[8,21]。

萜烯類物質是一系列萜類化合物的總稱，廣泛存在于植物體內，具有濃郁的水果香和花香,是水果香氣成分中的主要貢獻者[24]。如表2所示，萜烯類物質在草莓汁樣品中含量最高，為32.61%，而在去梗和帶梗發酵草莓酒中含量較低，僅為5.73%和4.15%，萜烯類化合物是草莓汁中的主要香氣物質。其中苯乙烯和(+)-α-松油醇僅在去梗發酵草莓酒中檢出，是其特有成分，順-α-紅沒藥烯和α-松油醇是帶梗發酵草莓酒中的特有成分，賦予了草莓酒丁香香氣。芳樟醇、(Z,E)-A-法尼烯、(E)-β-金合歡烯和紅沒藥醇在2種草莓酒樣品中均檢出，這些物質主要來自于草莓果實，賦予草莓酒花香和薰衣草香[21]。

除此之外，2種酒樣中還檢測到酸類、醛酮類、烷類和其他類揮發性香氣物質，這些揮發性物質在草莓酒樣品中含量較低，對草莓酒的香氣起著重要的補充和修飾作用[25]，如圖1所示。

圖1 各類香氣物質的總量Fig.1 The total amount of various aromatic substances

2.3 主成分分析

按照主成分選取標準，通常把累計貢獻率超過85%的主成分提取出來，如表3所示，3個樣品中共提取了2個主成分，其中第1主成分貢獻率為70.47%，第2主成分貢獻率為29.53%，二者累計方差貢獻率為100%，可以解釋原變量所有的變異信息[21]。

表3 主成分分析中解釋的總方差Table 3 The total variance explained in PCA

如表4所示，3種樣品中因子載荷量>0.750的物質共有63種。第1主成分有41種，其中31種物質來自草莓汁樣品，而在去梗和帶梗發酵草莓酒中只有19種和18種，芳樟醇和異戊醇為主成分1的主要香氣物質，芳樟醇在草莓汁樣品中含量最高，為15.57%，異戊醇在帶梗發酵草莓酒中含量最高，為63.12%，且未在草莓汁樣品中檢出；第2主成分有22種，有16種物質來自去梗發酵草莓酒中，11種物質來自帶梗發酵草莓酒中，而草莓汁樣品中只有7種，辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和乙酸異戊酯為主成分2的主要香氣成分，在去梗發酵草莓酒中含量最高，為49.12%，而在帶梗發酵草莓酒中只占5.86%，且未在草莓汁樣品中檢出。由此可以推出，第1主成分主要由草莓香和醇香共同組成，第2主成分主要為發酵香，其主成分的分布見圖2。

表4 成分矩陣Table 4 Component matrix

從圖2可以看出，3種樣品得到了較好的區分，草莓汁主要分布于主成分1的正半軸，去梗發酵草莓酒主要分布于主成分2的正半軸，帶梗發酵草莓酒主要分布于主成分1和主成分2的負半軸。具體來說，草莓汁位于第一象限，與芳樟醇、紅沒藥醇、正己醇、肉桂酸乙酯、己酸甲酯、乙二醇二丁酸酯、丁酸甲酯、乙酸己酯靠近，是草莓汁的主要香氣成分，具有甜橙、梨、香蕉、葡萄、玫瑰花、紫丁香等香氣。去梗發酵草莓酒位于第二象限，與辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯靠近，辛酸乙酯具有菠蘿、梨和花香[23]，癸酸乙酯和月桂酸乙酯具有花香、果香和脂肪香味，正己酸乙酯、乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯具有水果香、玫瑰和茉莉花香[26]。帶梗發酵草莓酒位于第三象限，與異戊醇、苯乙醇、α-松油醇靠近，它們給酒體帶來雜醇、苦杏仁和辛辣味。

圖2 草莓汁及草莓酒香氣化合物主成分樣品 分布圖和因子載荷圖Fig.2 PCA distribution and loading plot of aroma components in strawberry juice and strawberry wines

2.4 感官評價

由表5可知，去梗發酵草莓酒感官評分最高，為(88.62±1.37)分，口感和香氣均優于帶梗發酵草莓酒。在外觀方面，跟草莓汁相比，2種草莓酒的顏色均變淺，去梗發酵草莓酒酒體澄清透亮有光澤，而帶梗發酵草莓酒酒體澄清但沒有光澤。在口感方面，去梗發酵草莓酒酒體輕盈、口感清爽、酸澀適中、結構感強，而帶梗發酵草莓酒總酸和酚類物質含量較高，酒體飽滿、口感略粗糙、生青感較重、有苦澀味。研究發現，總酸賦予果酒骨架感和結構感，一般酸度為6.5～8.5 g/L時最為適宜，當酸度>8.5 g/L時，果酒會產生苦澀味，而<6.5 g/L時，口感較淡、酒體較薄[27-28]。在香氣方面，去梗發酵草莓酒果香細膩優雅，草莓香氣突出，具有較好的典型性，而帶梗發酵草莓酒醇香濃郁，草莓香氣明顯，花香和果香較為平淡。

表5 草莓酒的感官評分Table 5 Sensory scores of strawberry wines

3 結論

本實驗對2種不同原料釀造的草莓酒進行比較，發現兩者理化指標、香氣成分和感官品質有顯著影響。2種草莓酒的理化指標均符合國標要求，帶梗發酵草莓酒中的總酸和總酚含量較高且差異顯著。草莓酒中共檢測出40種香氣化合物，其中共有成分24種，酯類物質在去梗發酵草莓酒中含量最高，為65.35%，是其主要香氣成分；醇類物質在帶梗發酵草莓酒中含量最高，為68.80%，是其主要香氣成分。為了更準確地確定草莓酒中的關鍵香氣化合物，有必要采用外標法對草莓酒的香氣成分進行準確定量，計算氣味活度值，并結合氣相色譜-嗅味計或電子鼻等氣味分析儀進一步論證。主成分分析表明，2種不同原料釀造的草莓酒香氣風格差異區分明顯，辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯和正己酸乙酯是去梗發酵草莓酒的主要香氣成分；異戊醇和苯乙醇是帶梗發酵草莓酒的主要香氣成分。去梗發酵草莓酒，酯類物質含量較高，以草莓香和果香為主，酒體輕盈、口感清爽，而帶梗發酵草莓酒，總酸和總酚含量較高，香氣復雜、酒體略粗糙、有苦澀味。在相同的發酵條件下，去梗發酵更加適合高品質草莓酒的釀造。