LncRNA XIST調節miR-545-3p/SMAD5軸對人成骨細胞增殖、遷移及成骨分化的影響

丁平 羅政

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性骨骼疾病,表現為骨量低、骨組織退化、骨結構受損[1]。該病會增加骨折和其他骨相關疾病的發生風險,導致全球死亡率和醫療保健成本增加[2]。據報道,骨組織中成骨細胞成骨能力降低是OP形成原因之一[3]。而骨形成涉及成骨細胞增殖、遷移及分化等過程。因此,探究成骨細胞增殖、遷移及分化相關的分子機制對于OP的治療具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度>200個核苷酸的非編碼RNA,研究表明,lncRNAs在多種疾病中異常表達[4]。X染色體失活特異轉錄本(X chromosome inactivation specific transcript,XIST)是一種lncRNA,已有研究報道,過表達XIST能促進人骨髓間充質干細胞的成骨分化[5]。而XIST對人成骨細胞增殖、遷移及分化的影響筆者所見鮮有報道。lncRNA通過海綿化miRNA來調控mRNA表達是近年來闡述lncRNA作用機制的常用方法[6]。本研究通過生物信息學分析發現,XIST與miR-545-3p存在調控關系,miR-545-3p與SMAD5可靶向結合。而筆者發現XIST能否通過調控miR-545-3p/SMAD5軸影響人成骨細胞增殖、遷移及分化尚不明確。因此,本研究主要探究XIST對人成骨細胞增殖、遷移及分化的影響以及其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人成骨細胞(human osteoblast,hOB)購自武漢原生原代生物公司。

1.2 主要試劑 CCK-8試劑盒(貨號:CK04)購自上海經科化學公司;細胞核蛋白提取試劑盒(貨號:KTP3002)購自亞科因(武漢)生物公司;兔源一抗SMAD5(貨號:ab40771)、p-SMAD5(貨號:ab92698)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)(貨號:ab229126)、Runt相關轉錄因子2(runt related transcription factor 2,Runx2)(貨號:ab236639)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)(貨號:ab133612)、GAPDH(貨號:ab8245)、Histone H3(簡稱H3,貨號:ab1791)及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(貨號:ab6721)均購自美國Abcam公司。

1.3 細胞培養及分化誘導 將hOB細胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的α-MEM培養基中,在37℃、5% CO2的潮濕環境中培養。每3天更換1次培養基。為誘導hOB細胞分化,將1×105個細胞接種在6孔板中,并在含有10 mmol/L β甘油磷酸鈉、50 μmol/L抗壞血酸的分化培養基中培養。每3天更換1次培養基。

1.4 細胞轉染 將對數生長期的hOB細胞分為ctrl組(正常培養的hOB細胞)、pcDNA組(轉染pcDNA3.1)、pcDNA-XIST組(轉染pcDNA3.1-XIST)、pcDNA-XIST+miR-NC組(pcDNA3.1-XIST和miR-NC共轉染)、pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組(pcDNA3.1-XIST和 miR-545-3p mimic共轉染)。對hOB細胞先進行上述轉染24 h,再在分化培養基中進行誘導分化培養7 d,然后進行后續實驗。

1.5 qRT-PCR檢測XIST、miR-545-3p表達 使用Trizol試劑提取細胞中的總RNA,將RNA逆轉錄為cDNA后,以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增。分別以GAPDH、U6為內參,使用2-ΔΔCt方法計算XIST、miR-545-3p的表達量。引物:XIST:正向5’-CATTGCTAGGCATTGGGGATG-3’;反向,5’-CCAGGAAGCATGTATCTTCTGG-3’;GAPDH:正向,5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’;反向,5’-AATGGTCGTTGAGGGCAATG-3’;miR-545-3p:正向,5’-TGGCTCAGTTCAGCAGGAAC-3’;反向,5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’;U6:正向,5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向,5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖 轉染的細胞以5×104個/孔接種到96孔板中。分別將細胞培養24、48、72 h后,棄去細胞上清液,且在指定的時間點向每個孔中加入含有10 μl CCK-8溶液的100 μl完全培養基。孵育2 h后,使用酶標儀在450 nm處監測吸光度。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移 細胞以5×105個/孔接種到6孔板中,使用100 μl移液器吸頭在約達到100%匯合細胞單層上進行劃痕。用倒置光學顯微鏡記錄0、48 h的劃痕面積為W0和W48。劃痕愈合率(%)=(1-W48/W0)/×100%。

1.8 Western blot檢測蛋白表達 利用細胞核蛋白提取試劑盒提取hOB細胞核蛋白,RIPA裂解緩沖液提取hOB細胞總蛋白。檢測hOB細胞總蛋白中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達,hOB細胞核蛋白中p-SMAD5蛋白表達。具體操作:將蛋白質進行定量、電泳、轉膜、封閉后,將膜與一抗SMAD5、ALP、Runx2、OCN、GAPDH、Histone H3在4℃下孵育過夜,再將膜與HRP偶聯的羊抗兔二抗在室溫下孵育2 h。加入ECL試劑觀察蛋白質印跡,Image J軟件評估蛋白的灰度值。

1.9 茜素紅S染色檢測礦化結節形成 將在分化培養基上誘導分化7 d的各轉染組細胞用PBS洗滌2次,并在室溫下用95%乙醇固定10 min。隨后,將固定的細胞在37℃下用1%茜素紅S溶液染色30 min,使用光學顯微鏡觀察礦化結節形成情況。通過使用Image J軟件來評估礦化結節形成率。

1.10 雙熒光素酶報告基因實驗 (1)構建XIST野生型質粒(XIST-WT)和突變型質粒(XIST-MUT),將XIST-WT和XIST-MUT分別與miR-NC或miR-545-3p mimic共轉染于hOB細胞,48 h后,檢測熒光素酶活性。(2)構建SMAD5野生型質粒(SMAD5-WT)和突變型質粒(SMAD5-MUT),將SMAD5-WT和SMAD5-MUT分別與miR-NC或miR-545-3p mimic共轉染于hOB細胞,48 h后,檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 5組hOB細胞中XIST及miR-545-3p表達比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細胞中XIST表達升高、miR-545-3p表達降低(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細胞中XIST表達差異無統計學意義(P>0.05),miR-545-3p表達升高(P<0.05)。見表1。

表1 5組hOB細胞中XIST、miR-545-3p表達比較

2.2 5組hOB細胞增殖能力比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細胞OD450值(48、72 h)升高(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細胞OD450值(48、72 h)降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組hOB細胞OD450值比較

2.3 5組hOB細胞遷移能力比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細胞劃痕愈合率升高(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細胞劃痕愈合率降低(P<0.05)。見圖1,表3。

圖1 劃痕實驗檢測hOB細胞遷移(×100)

表3 5組hOB細胞劃痕愈合率比較

2.4 5組hOB細胞中SMAD5及成骨分化標志蛋白ALP、Runx2、OCN表達比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達升高,細胞核中p-SMAD5蛋白表達升高(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達降低,細胞核中p-SMAD5蛋白表達降低(P<0.05)。見圖2、3,表4。

圖2 Western blot檢測hOB細胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達;A ctrl組;B pcDNA組;C pcDNA-XIST組;D pcDNA-XIST+miR-NC組;E pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組

圖3 Western blot檢測hOB細胞核中p-SMAD5蛋白表達;A ctrl組;B pcDNA組;C pcDNA-XIST組;D pcDNA-XIST+miR-NC組;E pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組

表4 5組hOB細胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達及細胞核中p-SMAD5蛋白表達比較

2.5 5組hOB細胞礦化結節形成比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細胞礦化結節形成增多(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細胞礦化結節形成減少(P<0.05)。見圖4,表5。

圖4 茜素紅S染色檢測hOB細胞礦化結節形成(×200)

表5 5組hOB細胞礦化結節形成率比較

2.6 雙熒光素酶報告基因檢測結果 分別利用Starbase、TargetScan網站預測XIST與miR-545-3p、miR-545-3p與SMAD5的結合位點。與miR-NC和XIST-WT共轉染組比較,miR-545-3p mimic和XIST-WT共轉染組熒光素酶活性降低(P<0.05);與miR-NC和XIST-MUT共轉染組比較,miR-545-3p mimic和XIST-MUT共轉染組熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。與miR-NC和SMAD5-WT共轉染組比較,miR-545-3p mimic和SMAD5-WT共轉染組的熒光素酶活性降低(P<0.05);與miR-NC和SMAD5-MUT共轉染組比較,miR-545-3p mimic和SMAD5-MUT共轉染組熒光素酶活性變化差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5、6,表6,7。

圖5 XIST與miR-545-3p的結合位點

圖6 miR-545-3p與SMAD5的結合位點

表6 熒光素酶活性比較

表7 熒光素酶活性比較

3 討論

作為一種慢性骨骼疾病,OP的特點是骨結構受損和骨量低,并且其發病時可以降低骨強度和增加骨折的易感性[7]。雙膦酸鹽是常見地用于治療OP的藥物,長期使用這些藥物可以降低OP患者骨折的風險[8]。然而,目前的藥物治療方案存在各種限制,包括治療效果緩慢和長期使用時不良事件風險增加等[9]。因此,開發新的治療策略來調節OP患者的骨形成至關重要。

證據表明,lncRNA參與骨重構以調節代謝性骨病,例如OP[10]。XIST是一種涉及X染色體失活的lncRNA[11]。有研究報道,沉默XIST抑制牙周膜干細胞的成骨分化[12]。而筆者發現XIST對人成骨細胞hOB的影響尚不完全清楚。成骨細胞的充分遷移對于維持骨的質量和數量都很重要,成骨細胞遷移障礙可能會降低骨強度,導致骨折風險增加[13]。此外,成骨細胞的增殖與成骨分化對于骨形成至關重要[14]。ALP、Runx2、OCN是成骨分化的標志蛋白,ALP為成骨分化早期的標志物,其在細胞內表達增高代表成骨的增加[15];OCN是一種成骨分化晚期的標志物,出現在成骨分化和礦化過程中[16];Runx2與成骨細胞特異性順式作用元件2結合,作為成骨細胞分化的關鍵轉錄調節因子發揮作用[4]。成骨分化還包括基質的沉積和礦化等過程[17]。本研究結果顯示,過表達XIST促進hOB細胞增殖、遷移,ALP、Runx2、OCN蛋白表達、礦化結節形成,提示過表達XIST可促進hOB細胞增殖、遷移及成骨分化。

研究證實lncRNA可以作為競爭性內源性RNA來下調miRNA[18]。本研究證實XIST是miR-545-3p的海綿。miR-545-3p是一種miRNA,已有研究發現miR-545-3p可阻礙成骨分化[19]。本研究結果與文獻[19]是一致的。本研究結果顯示,過表達XIST可靶向負調控miR-545-3p表達,且上調miR-545-3p減弱了過表達XIST對hOB細胞增殖、遷移及成骨分化的促進作用。提示過表達XIST可能通過下調miR-545-3p促進hOB細胞增殖、遷移及成骨分化。

此外,本研究表明,SMAD5是miR-545-3p的靶標。SMAD5是一種受體調節的SMAD蛋白,其是成骨分化的關鍵轉錄因子,在生理條件下,SMAD5主要位于細胞質中,當SMAD5被磷酸化時,它被導向細胞核,進而調節成骨基因的表達,誘導成骨分化[20]。據報道,抑制p-SMAD5的核轉位可以抑制骨髓間充質干細胞的成骨分化[21]。本研究表明,過表達XIST促進SMAD5蛋白及核p-SMAD5蛋白表達,上調miR-545-3p減弱了過表達XIST對SMAD5蛋白及核p-SMAD5蛋白表達的促進作用,且miR-545-3p靶向調控SMAD5表達,提示過表達XIST可能通過海綿化miR-545-3p并上調SMAD5促進hOB細胞增殖、遷移及成骨分化。

綜上所述,過表達XIST可能通過海綿化miR-545-3p并上調SMAD5促進hOB細胞增殖、遷移及成骨分化。XIST/miR-545-3p/SMAD5軸可能成為治療OP的一種新的靶點。然而本研究尚存在不足之處,僅僅在細胞水平上驗證了XIST/miR-545-3p/SMAD5軸對hOB細胞增殖、遷移及成骨分化的影響,并未在體內水平上進行探討,后續研究將會在體內水平上進行進一步探索。