冬蟲夏草微滴式數字聚合酶鏈式反應定量檢測方法的建立及應用

潘映秋，夏慧麗，洪亮，李兆奎，盧啟寰，周晶瑩

臺州市藥品檢驗研究院·臺州市食品檢驗檢測中心 （浙江臺州 317700）

冬蟲夏草為麥角菌科冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上形成的幼蟲尸體及子座的復合體，為國家二級保護名貴藥材[1]。蟲草品類繁多，傳統中醫藥學中的冬蟲夏草特指分布于我國青藏高原及邊緣地區高寒草甸中的具有特殊藥用功效的冬蟲夏草菌，其寄主為蝠蛾幼蟲[2]。由于冬蟲夏草野生資源分布區域狹窄，人工培植技術尚不成熟，市場需求量大，價格節節攀升，供需嚴重失衡，昂貴的價格和稀缺的資源導致市場上的冬蟲夏草以次充好、摻假充真的現象屢禁不止，無法保證其臨床療效和食用安全。目前常用的性狀鑒別、顯微鑒別和化學鑒別方法易受外界因素及生物體發育階段的影響，特別是缺少對冬蟲夏草粉及制劑等因加工喪失外觀特性產品的有效監管手段[3]。

近年來，分子鑒別作為新興的中藥材鑒定手段，通過核酸或蛋白等大分子物質特征對冬蟲夏草進行鑒別，具有準確性高、重現性好等優點，在冬蟲夏草鑒別中的應用研究亦日益深入[4-6]。目前已有SN/T 3957-2014《冬蟲夏草真偽鑒別 實時熒光PCR方法》[7]鑒別標準，但其僅可作為定性檢測手段，無法對冬蟲夏草進行定量檢測。因此，亟需一種可靠的冬蟲夏草定量檢測方法對冬蟲夏草進行鑒別及摻偽檢測，以保證冬蟲夏草市場流通的規范性、食用的安全性和治療的有效性。

數字聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）作為第三代PCR 技術，可不依賴標準曲線進行絕對定量，在微生物豐度、病毒載量、罕見基因突變及食品源性成分定量檢測等方面均有應用研究[8]，但尚未見該方法在中藥鑒偽中的應用。本研究旨在探究基于微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術的冬蟲夏草絕對定量檢測方法，探尋一種精準、快速定量檢測冬蟲夏草及其制品的檢驗手段。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

QX200 微滴式數字PCR 儀（Bio-Rad）、ViiA7 熒光定量PCR 儀（ABI）、T100 PCR 擴增儀（Bio-Rad）、高通量組織研磨儀（Biotage Lysera）、Nanodrop One 超微量核酸蛋白測定儀（Thermo）、全自動核酸蛋白分析儀（Qsep100）、低溫冷凍離心機（Thermo ST8R）。

1.2 試劑

基因組DNA 提取試劑盒（Axgen）、引物與探針[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]、ddPCRTMSupermix for Probes（No dUTP）（Bio-Rad）、2×TaqMan Master Mix（Takara）、Ex Taq Hot Start Version（Takara）。

1.3 材料

冬蟲夏草（批號：121201-201103）和發酵冬蟲夏草菌粉（批號：121612-201402）均為國家藥品標準物質，購自中國食品藥品檢定研究院；偽品亞香棒蟲草、新疆蟲草、古尼蟲草、蛹蟲草和蟲草花均經臺州市藥品檢驗研究院鑒定，于室溫干燥環境下保存；市售西藏冬蟲夏草、青海冬蟲夏草、冬蟲夏草粉、金水寶膠囊、百令片、蟲草清肺膠囊、復方蟲草養血顆粒、復方蟲草口服液，均購自流通市場。

2 方法

2.1 DNA 提取

樣品前處理：對于對照藥材，直接稱取干燥粉末；對于蟲草樣品，稱取1.0 g 并用高通量組織研磨儀直接研磨為粉末，稱取干燥粉末；對于固體制劑樣品，稱取1.0 g并用20 ml雙蒸水混勻，以7 500 rpm 離心5 min，去上清液，同法清洗3 次后，用3.5 ml 無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）混勻清洗后樣品，吸取350 μl；對于液體制劑樣品，取2.0 ml，以7 500 rpm 離心5 min，去上清液；用20 ml 雙蒸水混勻后，以7 500 rpm 離心5 min，去上清液，同法清洗3 次后，用350 μl無菌PBS 混勻。

DNA 抽提：使用基因組DNA 提取試劑盒，按說明書要求提取總DNA，并使用Nanodrop One 超微量核酸蛋白測定儀測定其核酸濃度。

2.2 冬蟲夏草對照藥材及中藥材ITS 序列溯源分析

通過查閱文獻，應用通用內轉錄間隔區（internally transcribed spacer，ITS）引物[9]擴增冬蟲夏草標準物質、發酵冬蟲夏草菌粉標準物質、亞香棒蟲草、新疆蟲草、古尼蟲草、蛹蟲草和蟲草花的ITS 序列，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司對相關PCR 產物進行克隆測序，對于每個樣品的PCR 產物挑取3 個克隆子進行測序，并通過NCBI 網站BLAST 對樣品序列進行核酸比對溯源分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），以確定樣品來源，引物序列見表1。

表1 ITS 通用引物序列

2.3 ddPCR 檢測方法實施

選擇引物與探針開展ddPCR 檢測，引物及探針序列[7]見表2；調整退火溫度、引物濃度和探針濃度，摸索ddPCR 反應條件，確定ddPCR 檢測方法。其中，反應體系總體積為20 μl，包含ddPCRTMSupermix for Probes（No dUTP）10 μl，DNA 1 μl，5'端引物和3'端引物（20 μmol/L）各0.9 μl，探針（20 μmol/L）0.25 μl，用水補足至總體積20 μl。PCR 反應參數：95 ℃，10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃60 s，40 個循環；98 ℃，10 min。

表2 冬蟲夏草引物及探針序列

2.4 ddPCR 檢測方法特異性評估

采用ddPCR 方法檢測冬蟲夏草標準物質、發酵冬蟲夏草菌粉標準物質、亞香棒蟲草、新疆蟲草、古尼蟲草、蛹蟲草和蟲草花樣品，評估ddPCR 檢測方法的特異性。

2.5 質量與基因拷貝數換算公式確定

稱取6 個質量梯度的發酵冬蟲夏草菌粉標準物質（1、2、4、8、10、15 mg），記作ml；提取基因組DNA，使用Nanodrop One 超微量核酸蛋白測定儀測定DNA 含量，記作C1；每個梯度重復3 次，分析質量與DNA 含量的線性關系，計算相關系數R2。

將提取的發酵冬蟲夏草菌粉的DNA 進行系列稀釋后，分別以7 個DNA 質量濃度梯度（1、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0.0001 ng/μl）進行ddPCR檢測，分析DNA 含量與拷貝數的關系；每個梯度重復3 次，分析DNA 含量與拷貝數的線性關系，計算相關系數R2。

2.6 自制模擬混合樣品檢測

為驗證ddPCR 檢測方法的抗干擾性，以總質量為50 mg 的亞香棒蟲草為摻偽品，稱取8 個質量分數（10%、20%、30%、40%、50%、70%、90%、100%）的發酵冬蟲夏草菌粉，不足含量添加亞香棒蟲草，制成冬蟲夏草摻偽品；每個質量分數稱取10 mg，提取核酸DNA 后稀釋200 倍，取1 μl 進行ddPCR檢測及抗干擾實驗，每個質量分數重復3 次。

2.7 市售樣品檢測

按2.3 方法實施對冬蟲夏草標準物質及收集的市售西藏冬蟲夏草、青海冬蟲夏草、冬蟲夏草粉、金水寶膠囊、百令片、蟲草清肺膠囊、復方蟲草養血顆粒、復方蟲草口服液中的發酵冬蟲夏草菌粉進行定量檢測，驗證ddPCR 檢測方法的實際應用能力。

3 結果與分析

3.1 冬蟲夏草對照藥材及中藥材ITS 序列的溯源分析結果

冬蟲夏草及發酵冬蟲夏草菌粉標準物質、冬蟲夏草正品、西藏冬蟲夏草、青海冬蟲夏草及偽品亞香棒蟲草、新疆蟲草、古尼蟲草、蛹蟲草等的ITS基因PCR 產物克隆測序所得序列經溯源分析，確認樣品來源與前期判斷一致。

3.2 ddPCR 檢測方法的特異性評估結果

對冬蟲夏草及其偽品進行ddPCR 檢測，評估其方法的特異性，結果顯示，對于冬蟲夏草和發酵冬蟲夏草菌粉標準物質，分別檢出冬蟲夏草陽性微滴數12 712 個和12 956 個；對于蛹蟲草、古尼蟲草、新疆蟲草、亞香棒蟲草和蟲草花，檢出冬蟲夏草陽性微滴數均為0，見圖1，表明此方法對冬蟲夏草菌具有良好的檢測特異性。

圖1 冬蟲夏草及其常見偽品的ddPCR 檢測結果

3.3 質量與基因拷貝數換算公式的確定結果

分析發酵冬蟲夏草菌粉質量與DNA 濃度的關系，結果顯示，當發酵冬蟲夏草菌粉質量在1～15 mg 范圍內時，兩者成良好的線性關系，C1=7.4356m1+12.546，R2=0.9927，見圖2。

圖2 發酵冬蟲夏草菌粉質量與DNA 濃度的關系

分析發酵冬蟲夏草菌粉DNA 濃度與基因拷貝數的關系，結果顯示，當發酵冬蟲夏草菌粉DNA濃度在0.0001～1 ng/μl 范圍內時，兩者成良好的線性關系，y=11 526C1-46.701，R2=0.9991，見圖3。

圖3 發酵冬蟲夏草菌粉DNA 濃度與基因拷貝數的關系

根據以上兩個關系式，以DNA 濃度為中間換算量，可通過基因拷貝數計算得到發酵冬蟲夏草菌粉質量。

3.4 自制模擬樣品的檢測結果

通過對自制模擬樣品進行檢測，結果顯示，ddPCR 檢測所得的發酵冬蟲夏草菌粉實測含量在摻偽90%時偏差較大，在摻偽0%～70%范圍時，與真實含量基本一致，見表3，表明此方法對冬蟲夏草菌定量檢測的準確性高，可用于冬蟲夏草菌的定量檢測。

表3 自制模擬樣品中發酵冬蟲夏草菌粉成分含量的檢測結果

3.5 市售樣品中冬蟲夏草菌的定量檢測結果

應用ddPCR 檢測方法對冬蟲夏草標準物質、市售西藏冬蟲夏草、青海冬蟲夏草、冬蟲夏草粉、金水寶膠囊、百令片、蟲草清肺膠囊、復方蟲草養血顆粒、復方蟲草口服液中的冬蟲夏草菌進行定量檢測，每種樣品檢測3 次，除冬蟲夏草粉和金水寶膠囊未檢出冬蟲夏草菌外，其余產品均檢出冬蟲夏草菌，但蟲草清肺膠囊、復方蟲草養血顆粒和復方蟲草口服液中冬蟲夏草菌的含量均低于1%，見表4。

表4 市售樣品中冬蟲夏草菌成分的定量檢測結果

4 討論

冬蟲夏草為蟲菌結合體，成分復雜，其無性型鑒定在學術界仍存在爭議，本研究依據《中國藥典2020 年版（一部）》[1]，以冬蟲夏草菌含量作為定量檢測指標，探討對冬蟲夏草進行定量檢測的可行性。

本研究提出的ddPCR 檢測方法，特異性好，準確性高，通過此方法對市售樣品進行檢測，發現冬蟲夏草標準物質、西藏冬蟲夏草和青海冬蟲夏草的冬蟲夏草菌含量均超過100%，百令片作為冬蟲夏草制劑檢出7.6%的冬蟲夏草菌含量，表明此方法可較好地鑒別冬蟲夏草真偽，并可對其中的冬蟲夏草菌含量進行定量檢測；購買的冬蟲夏草粉未檢出相關成分，為偽品。本研究受方法學的限制，目前并未對冬蟲夏草相關制劑進行含量控制，ddPCR檢測方法檢測的蟲草清肺膠囊、復方蟲草養血顆粒和復方蟲草口服液均檢出冬蟲夏草菌，但實測含量低于1%，可能是由于制劑中含有較多添加劑，制備過程復雜，導致核酸提取不完全，也可能是由于冬蟲夏草價格高昂，相關制劑中冬蟲夏草添加量低?？蛇M一步模擬制劑工藝過程，對不同冬蟲夏草含量的模擬樣品開展檢測，深入探討ddPCR 檢測方法在不同制劑中定量檢測冬蟲夏草的可行性。

ddPCR 檢測方法主要針對冬蟲夏草菌開展冬蟲夏草的定量檢測，冬蟲夏草菌成分穩定，可將其作為冬蟲夏草含量的質控指標；但考慮到冬蟲夏草是蟲菌結合體，后續實驗可考慮進一步結合蟲體開展更全面的定量檢測方法的探索。

總之，本研究以冬蟲夏草菌含量為指標，提出了冬蟲夏草的ddPCR 檢測方法，不僅為冬蟲夏草及其制劑的質量控制提供了新方法，而且為ddPCR在中藥鑒偽中的應用提供了新思路。