山竹果皮提取物Garcinone E對鼻咽癌S18細胞遷移和侵襲的影響及相關機制研究

韋 丹, 張 菡, 尹富強, 劉 夏

鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜的上皮性癌,常見于咽隱窩[1]。鼻咽癌不同于其他頭頸部癌,它具有特定的地理分布,高發于我國和東南亞地區,具有較高的遠處轉移風險[2]。廣西的鼻咽癌發病率和病死率位居全國前列[3]。鼻咽癌早期治療以放療為主,但常規二維放療對于晚期患者并不理想,這類患者的5年總生存率低于60%[4]。另外,傳統的化療藥物可產生耐藥,同步放化療后晚期患者5年總生存率仍不理想,僅有70%左右[2]。因此,亟需尋找新的抗腫瘤化療藥物以提高晚期患者的生存率。氧雜蒽酮類化合物是一類含氧雜環單體化合物,已有研究表明其具有良好的抗腫瘤作用[5-6]。Garcinone E是從山竹(GarciniamangostanaL.)果皮提取的一種氧雜蒽酮類單體化合物,近期研究表明其在卵巢癌中具有阻斷細胞自噬等抗腫瘤作用[7]。Garcinone C與Garcinone E均為氧雜蒽酮類天然化合物,近期有研究報道Garcinone C可以通過抑制結直腸癌細胞侵襲而起到抗腫瘤的作用[8]。本研究旨在探討Garcinone E對人源鼻咽癌細胞S18的轉移、周期及自噬的影響,進一步闡明Garcinone E的抗腫瘤機制,以期為鼻咽癌的治療提供先導化合物。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑 鼻咽癌細胞株S18受贈于中山大學腫瘤防治中心錢朝南教授,本課題組實驗室保存使用。Garcinone E(分子式為C28H32O6)由深圳市中國科學院仙湖植物園管理處馮世秀博士從山竹(GarciniamangostanaL.)果皮中分離、提取、純化,并贈予本課題組進行科研用途[9]。DMEM高糖培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自加拿大WISENT公司。0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、結晶紫溶液購自北京索萊寶公司。CCK-8試劑盒購自北京蘭杰柯公司;BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司;ECL化學發光液購自美國Thermo Scientific公司。無基質膠Transwell小室、含基質膠Transwell小室購自美國Corning公司。一抗:組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1),組織金屬蛋白酶抑制劑2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2,TIMP2),基質金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP-2),基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9),細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,p21),周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2),周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6),周期蛋白依賴性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7),細胞周期蛋白B1(cyclin B1),微管相關蛋白1輕鏈3 β(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B),泛素結合蛋白p62(ubiquitin-binding proteinp62,SQSTM1/p62),芐氯素1(beclin-1),自噬相關蛋白3(autophagy-related 3,Atg3),均購自美國Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(anti-rabbit IgG),辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗(anti-mouse IgG)均購自美國Cell Signaling Technology公司。內參蛋白抗體:甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),微管蛋白β(microtubulin beta,β-tubulin)均購自杭州弗德公司。

1.2主要儀器 熒光倒置顯微鏡(日本,Olympus公司,型號:BX53),恒溫細胞培養箱(美國,Thermo Fisher Scientific公司,型號:3111),低溫高速離心機(德國,Eppendorf公司,型號:5424R),全波長酶標儀(美國,Thermo Scientific公司,型號:Multiskan GO),BD電泳儀(美國,Bio Rad公司,型號:PowerPac Basic),化學發光成像儀(中國賽智創業公司,型號:MiniChemi 610 Plus)。

1.3細胞培養 S18細胞使用含有10%FBS和1%的青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養基在37 ℃、5% CO2的飽和濕度恒溫細胞培養箱中進行培養,細胞長到75%～85%匯合度時進行傳代。

1.4細胞活力檢測 取對數生長期的S18細胞,以250 cells/孔種于96孔板中。設置Garcinone E濃度梯度:0、0.78、1.56、2.187、3.125、4.375、6.25、8.75、12.5、17.5 μmol/L,孵育96 h后撤去舊培養基,每個孔中分別加入100 μl新鮮的DMEM培養基和10 μl的CCK-8試劑,在37 ℃條件下避光孵育1 h后上機檢測450 nm處的OD值。相對細胞活力(%)=藥物處理組OD值/對照組(0 μmol/L Garcinone E)OD值×100%。

1.5S18細胞遷移實驗 使用不含基質凝膠的Transwell小室進行細胞遷移實驗,觀察細胞的遷移能力。在下室中加入750 μl DMEM完全培養基。將S18細胞培養至對數生長期,消化、離心后棄上清液,用未加FBS的DMEM培養基重懸,取500 μl細胞懸液接種到上室中,使用7.5 μmol/L的Garcinone E干預細胞。24 h后,棄去上室及下室舊液,用杜氏磷酸鹽緩沖鹽溶液(Dulbecco′s phosphate buffered saline,D-PBS)清洗2次,取750 μl的4%多聚甲醛于下室進行固定,20 min后棄舊液,用D-PBS清洗2次,取750 μl的0.1%結晶紫染液進行染色,20 min后棄舊液,用D-PBS洗2遍,用棉簽輕柔擦去上室中未遷移的細胞。在顯微鏡下觀察拍照,用Image J軟件統計遷移的細胞數。進行3次獨立重復實驗。細胞遷移率=Garcinone E干預組細胞遷移數/對照組細胞遷移數×100%。

1.6S18細胞侵襲實驗 使用含基質凝膠的Transwell小室模擬體內細胞外基質,進行細胞侵襲實驗,檢測細胞的侵襲能力。實驗方法與上述方法1.5類似,但在處理細胞前,需在含基質凝膠的上室及下室中分別加入500 μl和750 μl無FBS的DMEM培養基進行水化,在37 ℃恒溫條件下處理2 h,后將細胞接種于Transwell小室中。24 h后,先用無FBS的DMEM培養基濕潤棉簽,輕柔擦去上室中未穿過的細胞,再進行染色、固定。進行3次獨立重復實驗。細胞侵襲率=Garcinone E處理組細胞侵襲數/對照組細胞侵襲數×100%。

1.7Western blot檢測S18細胞轉移、周期和自噬相關蛋白表達水平 設置3個復孔,以不同濃度Garcinone E(0、5、7.5、10 μmol/L)干預S18細胞24 h后,用含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和EDTA的RIPA裂解液裂解細胞,用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。通過12%的SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h分離蛋白,90 V恒壓電壓轉膜3 h,5%脫脂奶粉封閉1 h,1×TBST洗膜后孵育一抗,4 ℃過夜。第2天室溫孵育二抗1 h,用ECL化學發光液孵育1 min后使用凝膠成像系統顯影,設置合適的曝光時間以獲取目的蛋白的條帶圖像。相對表達量(%)=藥物干預組內參歸一化的灰度值/對照組內參歸一化的灰度值×100%。

2 結果

2.1Garcinone E抑制S18細胞的增殖活性的實驗結果 細胞活力檢測實驗結果顯示,Garcinone E抑制S18細胞的增殖活性,S18細胞的細胞活力隨著藥物濃度的增加而降低,半抑制濃度(fifty percent inhibitory concentration,IC50)=(3.34±0.03)μmol/L。見圖1。

圖1 不同濃度Garcinone E下S18細胞的增殖活性圖

2.2Garcinone E抑制S18細胞的遷移能力的實驗結果 Transwell細胞遷移實驗結果顯示,與對照組相比,Garcinone E干預組細胞遷移率顯著下降(t=29.662,P<0.001),提示經Garcinone E干預后,S18細胞的遷移能力被抑制。見圖2。

圖2 兩組S18細胞遷移能力比較圖(結晶紫染色,×200)

2.3Garcinone E抑制S18細胞的侵襲能力的實驗結果 Transwell細胞侵襲實驗結果顯示,與對照組相比,Garcinone E干預組S18細胞侵襲率顯著下降(t=13.716,P<0.001)。提示經Garcinone E干預后,S18細胞的侵襲能力被抑制。見圖3。

圖3 兩組S18細胞侵襲能力比較圖(結晶紫染色,×200)

2.4Garcinone E對S18細胞轉移相關蛋白表達影響的實驗結果 Western blot實驗結果顯示,Garcinone E干預后S18細胞TIMP1和TIMP2蛋白表達水平上調(P<0.05),MMP-2和MMP-9蛋白表達水平下調(P<0.05),且呈一定的劑量依賴性。見圖4。

經單因素方差分析,與對照組比較,aP<0.05;與5 μmol/L組比較,bP<0.05;與7.5 μmol/L組比較,cP<0.05

2.5Garcinone E對S18細胞周期相關蛋白表達影響的實驗結果 Western blot實驗結果顯示,Garcinone E干預后S18細胞p21蛋白表達水平上調(P<0.05),CDK2、CDK6、CDK7和cyclin B1蛋白水平下調(P<0.05),且呈一定的劑量依賴性。見圖5。

經單因素方差分析,與對照組比較,aP<0.05;與5 μmol/L組比較,bP<0.05;與7.5 μmol/L組比較,cP<0.05

2.6Garcinone E對S18細胞自噬相關蛋白表達影響的實驗結果 Western blot實驗結果顯示,Garcinone E干預后S18細胞LC3B-Ⅱ、SQSTM1/p62、beclin-1和Atg3蛋白表達水平均上調(P<0.05),且呈一定的劑量依賴性。見圖6。

經單因素方差分析,與對照組比較,aP<0.05;與5 μmol/L組比較,bP<0.05;與7.5 μmol/L組比較,cP<0.05

3 討論

3.1在鼻咽癌的治療中,腫瘤的轉移和耐藥使得臨床治療極具挑戰性[10],因此亟需尋找新的抗腫瘤化療藥物。氧雜蒽酮是一大類化合物,具有多種生物活性,包括抗腫瘤[11]、抗炎癥[12]和抗真菌[13]等。近期的研究報道表明,其可通過抑制腫瘤細胞的轉移[6]、促進腫瘤細胞的凋亡[14]、抑制腫瘤細胞周期[15]以及阻斷腫瘤細胞自噬[7]等過程起到抗腫瘤作用。本研究結果顯示,Garcinone E可以抑制鼻咽癌S18細胞的增殖活性、轉移、細胞周期并阻滯細胞自噬。

3.2基質金屬蛋白酶家族(matrix metallopeptidases,MMPs)是一組組織重塑酶,主要功能是組織重塑和調節細胞外基質,在腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中發揮重要作用[16]。組織金屬蛋白酶抑制劑家族(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)的主要功能是對MMPs產生抑制作用,通過直接結合到催化性鋅元素輔因子,使MMPs不可逆地失活。TIMP1是MMP-9最有效的抑制劑,TIMP2在大部分組織中有表達,可抑制MMP-2和MMP-9,形成非活性的MMPs-TIMPs復合體[17]。MMP-2和MMP-9作為侵襲相關的標志蛋白,Garcinone C通過下調結直腸癌中的MMP-2和MMP-9蛋白水平起到抑制其侵襲的作用[8]。有研究顯示,積雪草酸和柚皮素聯合治療可以通過上調TIMP2和下調MMP-2蛋白表達抑制黑色素瘤和肺癌小鼠模型中腫瘤的侵襲和轉移[18]。骨化三醇(維生素D的活性形式)處理乳腺癌細胞后,TIMP1和TIMP2蛋白表達上調,MMP-2和MMP-9蛋白表達下調,顯著抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲[19]。本研究結果顯示,Garcinone E可以上調S18細胞TIMP1和TIMP2蛋白表達水平,下調MMP-2和MMP-9蛋白表達水平,提示Garcinone E可以通過下調MMP-2和MMP-9表達而抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲。

3.3細胞周期進程異常是腫瘤發生的基本機制之一,使得細胞周期機制的調節劑成為抗腫瘤治療靶點[20]。細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是真核細胞周期的主要調節劑,腫瘤抑制因子p21是CDKs的抑制劑,在細胞周期控制中發揮重要作用[21]。有研究顯示,白花丹素(Plumbagin)通過上調p53和p21的表達,下調CDKs阻斷子宮內膜癌Ishikawa細胞周期并抑制了細胞的增殖[22]。他汀類藥物通過上調p21和下調CDKs及細胞周期蛋白cyclins的表達阻滯口腔鱗狀細胞癌細胞周期[23]。本研究結果顯示,Garcinone E可以上調p21蛋白表達,下調CDK2、CDK6、CDK7和cyclin B1蛋白表達,抑制S18細胞增殖活性,提示Garcinone E具有阻滯鼻咽癌細胞周期的作用。

3.4細胞自噬是一種細胞內的自我降解機制,是對環境壓力或饑餓條件作出的反應,可以降解自身的大分子物質和受損的細胞器以維持細胞內穩態。越來越多的研究表明,自噬在腫瘤發生發展中具有重要作用。在腫瘤發展的晚期,自噬可能通過在營養受限或其他應激時提供能量底物來維持和刺激腫瘤的生長,自噬已成為對放療、化療和靶向藥物產生抗性的重要介質[24]。許多研究表明,阻斷細胞自噬可能成為治療腫瘤的有效策略[25-26]。LC3是自噬發生過程的標志蛋白,通常表現為從細胞質LC3-Ⅰ到脂質化的LC3-Ⅱ的分子形式轉化,被募集到吞噬體并停留在自噬體的內膜上,直到在自噬溶酶體中降解[27]。SQSTM1/p62會在自噬過程中降解,當自噬過程被阻斷時,LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62會累積。CA-5f是一種晚期自噬抑制劑,可以升高LC3B-Ⅱ和SQSTM1/p62的蛋白水平,阻滯非小細胞肺癌細胞的自噬通量[28]。本研究結果顯示,Garcinone E可以上調LC3B-Ⅱ和SQSTM1/p62水平,提示Garcinone E可以阻斷S18細胞自噬過程。

綜上所述,Garcinone E通過抑制MMP-2和MMP-9的表達,抑制鼻咽癌S18細胞的遷移和侵襲,同時可以阻滯細胞周期和細胞自噬的過程,從而發揮抗腫瘤作用,可作為鼻咽癌化療藥物研發的候選先導化合物。