低溫對黑斑側褶蛙變態和植物血凝素反應的影響

李諾，伍亮，張志強

（安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036）

溫度是影響兩棲動物變態發育時長的主要環境因素之一，高溫可促進蝌蚪生長發育，縮短變態時長，低溫則延遲發育進程，延長變態時長[1-5]。黑斑側褶蛙（Pelophylax nigromaculatus）是有重要經濟價值的兩棲動物，也是稻蛙綜合種養的主要蛙種之一[6]。變態前后，蝌蚪的規格、對植物血凝素（PHA-P）的反應，受高溫[3-5]、微塑料污染[7]和發育階段[8]等多種因素影響。目前，關于低溫條件下延遲蝌蚪發育的生理效應方面的研究報道較少[3]。

植物血凝素抗原（PHA-P 抗原）是一種有絲分裂原，能促進淋巴細胞增殖，通過評估被注射PHA-P 抗原部位皮膚組織的增厚程度，可整合反映兩棲動物等不同類群脊椎動物的免疫功能[9-11]?，F于2021 年6 月上旬，在安徽農業大學動物生理生態實驗室，模擬黑斑側褶蛙蝌蚪可能經歷的極端低溫環境，將發育至37 期的黑斑側褶蛙蝌蚪，于8 ℃條件下分別處理5 和10 d 后，再轉移至25 ℃條件下，繼續飼養至變態完成期（46 期）幼蛙，以始終在25 ℃條件下飼養的蝌蚪為對照組，比較46 期幼蛙的存活率、變態時長、身體大小、PHA-P 的反應模式和最大反應值的出現時間，從免疫功能整合性變化的角度揭示低溫延遲發育的機理，為提高黑斑側褶蛙變態存活率、實現健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

從合肥大圩鎮捕獲的黑斑側褶蛙卵帶，于60 L的塑料桶中飼養，加入曝氣24 h 以上的自來水，2 d更換一次。用加熱棒控制水溫在（25±1）℃。每日用煮熟的青菜葉飼喂，直至發育至37 期蝌蚪。蝌蚪分期鑒定采用Gosner 提供的方法[12]。

1.2 飼料、試劑和設備

主要有蝌蚪飼料、PHA-P 抗原（Sigma L-8754,Sigma-Aldrich 公司產品）、塑料箱、加熱棒、冰箱、電子數顯卡尺、微量進樣器和電子天平等。

1.3 試驗設計

從60 L 塑料桶中隨機選取發育至37 期的黑斑側褶蛙蝌蚪210 只，用電子天平稱量其體質量，數顯卡尺測其體長、尾長，取規格相似的35 只蝌蚪，于塑料箱（34 cm×24 cm×18 cm）中，每箱35 只，共6 箱，蝌蚪的密度為3.2 只/L。其中，3 箱始終在水溫（25±1）℃、水深13.5 cm 的環境下飼養，為A 組；剩余3 箱移入溫度為（8±1）℃的冰箱內飼養，至第5 d 時，3 箱中分別取出一半蝌蚪，將其置于水溫為（25±1）℃的條件下繼續飼養，為B 組；剩余的蝌蚪繼續在溫度為（8±1）℃的冰箱內再飼養5 d，至第10 d時，再將3 箱中存活的蝌蚪置于水溫為（25±1）℃的條件下繼續飼養，為C 組。飼養期間，每2 d 根據3.2 只/L 的固定密度更換一次水體，每天定時喂食蝌蚪飼料，以塑料板和紗布制作成浮床，營造登陸環境，飼養至變態完成期46 期幼蛙為止。

1.4 指標測定

1.4.1 變態存活率和變態時長

統計A、B 和C 組每箱中從37 期蝌蚪發育至變態完成期46 期幼蛙的個體數，計算變態存活率和變態時長。

變態存活率（%）=發育至46 期幼蛙的個體數量×100%/初始時的蝌蚪數量；

變態時長（d）=發育至變態完成期46 期幼蛙的天數－37 期蝌蚪的處理天數。

1.4.2 體質量與體長

A、B 和C 組個體發育至46 期幼蛙時，每組每箱中分別取4、3 和2 只個體，用電子天平稱量其體質量，數顯卡尺測其體長。

1.4.3 對PHA-P 的反應

測A、B 和C 組每一只個體對PHA-P 的反應，以其平均值代表該箱的狀態，以3 箱的平均值代表該組的狀態。采用微量進樣器，注射劑量為20 μL、質量濃度為2.5 g/L 的PHA-P 抗原溶液于46 期幼蛙大腿根部，以數顯卡尺測量未注射時（0 h）大腿根部的厚度為基準值，此后在注射后每間隔1 h 測定被注射部位的厚度，每個間隔時間點連續測定3 次，取平均值，直至9 h。

對PHA-P 的反應（%）=（Xh 被注射部位的厚度－0 h 時該部位的厚度）×100%/0 h 時該部位的厚度。

1.5 數據處理與統計分析

用SPSS 19.0 進行數據處理和統計分析。用單因素方差分析比較不同延遲發育天數組黑斑側褶蛙變態完成期幼蛙變態時長、體質量和體長，以及PHA-P 最大反應值的差異。同一處理組內，以注射前（0 h）和注射后9 h 內逐小時的測量時間點為組內因子，用重復測量方差分析比較不同測量時間點間PHA-P 反應的差異。結果均以（平均值±標準誤）（Mean±SE）表示，P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 變態存活率、變態時長和身體大小

經統計得出，A、B 和C 組原分別有105、41 和43 只蝌蚪，至變態完成期46 期幼蛙時，A、B 和C組存活的總幼蛙數分別為92、18 和12 只?？傻肁、B和C 組的蝌蚪變態存活率分別為87.62%、43.90%和27.91%，呈下降趨勢。低溫對黑斑側褶蛙變態時長、體質量和體長的影響見表1。由表1 可見，A—C組變態時長呈顯著上升趨勢（P<0.05），但體質量（P>0.05）、體長（P>0.05）均無明顯的組間差異。

表1 低溫對黑斑側褶蛙變態時長、體質量和體長的影響①

①同列數據上標字母不同表示組間差異顯著性（P<0.05）；字母相同表示組間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 PHA-P 反應

低溫對黑斑側褶蛙46 期幼蛙植物血凝素反應模式的影響見表2。由表2 可見，A 組注射后3 h，對PHA-P 的反應值最高，2 與3 h 時接近，均顯著高于0 h 及6~9 h（P<0.05）；B 組注射后3 h 最高，與2 h時接近，均顯著高于0 和1 h 及6~9 h（P<0.05）；C 組注射后4 h 最高，與3 h 時接近，均顯著高于0 及7~9 h（P<0.05）。A、B 和C 組的PHA-P 最大反應值分別出現在注射后3，3 和4 h，但無明顯的組間差異（P>0.05）。

表2 低溫對黑斑側褶蛙46 期幼蛙植物血凝素反應模式的影響①%

3 討論

在安徽合肥地區，黑斑側褶蛙通常在3 月底—4 月初孵化，經過2~3 個月，完成變態發育成幼蛙。蝌蚪常見于靜水池塘、稻田等處，4—5 月份是蝌蚪發育的關鍵時間節點，也是水溫劇烈波動的時間段，不但會經歷熱浪侵襲，而且可能面臨低溫脅迫[8]。隨著低溫處理天數增加，黑斑側褶蛙變態完成期幼蛙的體質量、體長變化不明顯，但存活率從延遲0 d 的87.62%下降至延遲5 d 的43.90%、延遲10 d 的27.91%，變態時間顯著延長，從29.8 d 升至49.9 和58.3 d。說明低溫脅迫天數的增加，顯著影響了幼蛙的存活能力及發育至變態完成期幼蛙的個體數量，發育時間顯著延長。幼蛙A、B 和C 組的體質量先降后升，體長呈下降趨勢，但均無顯著改變，說明被延長的發育期不利于其未來存活。

同時，隨著低溫脅迫天數的增加，存活下來的個體對PHA-P 的最大反應值無明顯的組間差異，但C 組對PHA-P 的最大反應值出現在注射后4 h，而A 組和B 組均出現在注射后3 h，說明較長時間的低溫脅迫，使變態完成期幼蛙對外界環境刺激的反應時間延長。幼蛙面對多變的陸地環境，被捕食的風險加大，不利于其未來存活。此前，關于黑斑側褶蛙蝌蚪或幼蛙對PHA-P 反應模式和最大反應值的測定，常選用注射前（0 h）和注射后3，6，9 和12 h 測量時間點，發現37~43 期、44~46 期蝌蚪分別在注射后3 和6 h 達到最大反應值[8]，而在21~27 ℃飼養條件下，27 ℃飼養縮短了其變態時長，但PHA-P 最大反應值無組間差異[5]。然而，與低溫處理延遲孵化12 d 的田野林蛙（Rana arvalis）蝌蚪相比，常溫組蝌蚪對PHA-P 的反應的最高值高于延遲孵化組[3]，但該研究也只測定了預設的PHA-P達到高峰值時的時間點，即注射后2 d。

蝌蚪對PHA-P 抗原刺激的反應強度和峰值延遲或提前，被認為與免疫能力有關[11]。因此，能否精準界定PHA-P 最大反應值發生的時間點，是確定PHA-P 最大反應值出現時間的前提[13]。理論上，測量時間點間隔越小，準確度越高，但也意味著測量工作量和手握應激的次數也會增加[7]。本研究表明，每間隔1 h 測量1 次，所得的結果更為準確，也不會對幼蛙造成額外傷害，值得加以推廣應用。

4 結論

低溫誘導的延遲發育，顯著降低了變態完成期幼蛙的存活率，延長了變態時長，對PHA-P 的反應有所后延，不利于幼蛙的未來存活。