小黃魚中殺香魚假單胞菌實時熒光定量PCR 檢測技術的建立

沈寧遠，韓明明，陳琳，詹煒，劉峰，謝慶平，徐萬土，陳黎明，樓寶

(1.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022；2.浙江省農業科學院水生生物研究所，浙江杭州 310021；3.寧波市象山縣水產技術推廣站，浙江象山 315702；4.象山港灣水產苗種有限公司，浙江象山 315702)

小黃魚Larimichthys polyactis是我國傳統“四大海產”之一，歷來是重要的捕撈魚類[1]。自2015 年首次實現全人工育種以來，小黃魚的各項養殖技術獲得了長足發展[2]，但在養殖過程中發現該魚存在易染病、易死亡的特點[3]。其中，內臟白點病是小黃魚養殖過程中的一種常見疾病，染病后在肝、腎、脾等內臟部位出現大量白色結節而魚體表面并無明顯病狀，因而不易被及時發現。該病感染率很高并能在短時間內造成大規模死亡，加之目前尚沒有有效治療藥物，因此一旦發病往往給養殖企業造成重大經濟損失。在發病時間上，以往該病主要在每年的4——5 月以及11——12 月、水溫為16～21 ℃時發生，流行規律調查顯示目前已經有發病地區擴大、發病時期延長的趨勢。

作為內臟白點病的致病菌，殺香魚假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida最早在在日本香魚Plecoglossus altivelis中分離而來[4]。從分類上該菌屬細菌界，變形菌門，γ-變形菌綱，假單胞菌目，假單胞菌科，假單胞菌屬，惡臭假單胞菌組，為革蘭氏陰性桿狀需氧菌，具有極性鞭毛[5]。近年來由該菌引起的魚類疾病的研究已有相關報道，例如，AKAYLI,et al[6]在人工養殖的虹鱒Oncorhynchus mykiss幼體中發現一種新的假單胞菌：殺香魚假單胞菌；ZHANG,et al[7]通過對養殖大黃魚內臟白點病進行研究證明了該病是由細菌性病原殺香魚假單胞菌引起；MAO Zhijuan,et al[8]則對大黃魚Larimichthys crocea內臟白點病的病原殺香魚假單胞菌株完成了菌株鑒定工作。

目前針對魚類病原的快速檢測方法主要有16S rDNA 檢測技術、核酸雜交技術、普通PCR 檢測技術、多重PCR 技術和熒光定量PCR 技術等。其中熒光定量PCR 技術在高效、快速和靈敏度高的基礎上，還具有對病原定量的優勢，因此具有重要的發展前景。在對殺香魚假單胞菌定性檢測方面，IZUMI,et al[9]以殺香魚假單胞菌中DNA 回旋酶B 亞基基因(gyrB)的一段大小為520 bp 的特異片段為模板建立了對該菌的套式PCR 檢測技術；袁雪梅等[10]根據rpoD基因序列設計特異性引物建立了LAMP 檢測方法。定量檢測方面，周濤等[11]根據該菌rpoD的基因序列設計特異引物并建立了SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR 方法，經驗證該方法檢測殺香魚假單胞菌的靈敏度為1.9×103copies·μL-1。崔曉瑩等[12]基于抗病育種選育，利用殺香魚假單胞菌的gyrB基因與大黃魚DNA 回旋酶B 亞基基因(gdf-8) 設計引物和實時熒光定量PCR 技術，實現了對脾臟中該病菌進行相對定量。

養殖水體是殺香魚假單胞菌的主要來源，以養殖水體中該菌的含量變化為研究對象，建立針對小黃魚殺香魚假單胞菌的快速定量檢測技術對實現內臟白點病有效預警、采取預防措施、降低死亡率和實現小黃魚規?；B殖具有重要意義。為實現這一目的，本研究將在前人的研究基礎上，利用從小黃魚中分離獲得的殺香魚假單胞菌菌種來構建質粒標準品，設計特異引物并建立熒光定量PCR 檢測方法，力圖通過對養殖水體和病魚中殺香魚假單胞菌進行定量檢測來實現對內臟白點病的有效預警。

1 材料與方法

1.1 菌株分離及鑒定

1.1.1 菌種分離

實驗所用菌株從小黃魚內臟白點病病魚中分離得到。在無菌條件下，用無菌的解剖刀將有白色結節的肝臟劃開后，用無菌接種環在其內部劃線，并在28 ℃條件下于TSA 固體培養基(表1)上培養24 h，之后，挑取單菌落并于28 ℃、200 r·min-1條件下在TSA 液體培養基(表1)中繼續進行搖床過夜培養。

1.1.2 菌種鑒定

搖床培養結束后，吸取1 mL 菌液加入1.5 mL 無菌的離心管中，在3 000 r·min-1下離心10 min，去掉上清液，按照提取試劑盒說明書(愛基因，寧波)提取細菌DNA，利用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，進行16S rDNA PCR 擴增反應，具體步驟按照PCR 反應試劑盒(諾唯贊，南京)進行(表2)。PCR 反應完成后對PCR 擴增產物進行測序，然后通過NCBI 數據庫進行Blast 比對，確定該菌株種類。

表2 16S rDNA PCR 反應體系及條件Tab.2 The reaction system and conditions of 16S rDNA PCR

1.2 熒光定量PCR 引物設計

利用NCBI 中“pick primers”工具對1.1 所得序列設計熒光定量PCR 反應引物，并委托擎科生物有限公司(杭州，中國)進行引物合成。

1.3 熒光定量PCR 技術體系建立

1.3.1 殺香魚假單胞菌標準品的構建

參照IZUMI，et al[9]的方法對實驗所得的殺香魚假單胞菌DNA 進行套氏PCR 反應，反應體系組成如下：(1) PCR 1：Prime STAR Max Premix(2x) (Takara，日本) 25 μL；PL-G1F 和PL-G1R 各1 μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 21 μL。(2) PCR 2：Prime STAR Max Premix (2x) 25 μL；PL-G2F 和PL-G2R 各1 μL；PCR 1產物2 μL；ddH2O 21 μL。兩步PCR 反應條件均為94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；66 ℃，20 s；72 ℃，5 s；35 個循環；72 ℃，2 min；16 ℃，10 min。利用“AxyPrepTM PCR clean up kit”(Axygen，美國)試劑盒對PCR 2 產物進行純化，并按照“pClone007 Blunt Simple Vector Kit”質粒連接試劑盒(擎科生物，北京)操作說明進行連接。

具體如下：

(1)連接：按照純化后的PCR 產物1 μL、pClone007 Blunt Simple 1 μL 和10x Tope Mix 1 μL 進行混勻，并用ddH2O 補足到10 μL，在室溫下反應5 min。

(2)轉染：取100 μL 在冰浴上融化的大腸桿菌感受態細胞，加入(1)的連接產物，輕輕混勻，冰上靜置25 min。42 ℃水浴90 s，迅速轉移到冰浴中靜置2 min。

(3)向離心管中加入500 μL LB 液體培養基，于37 ℃、200 r·min-1條件下復蘇1 h 后8 000 r·min-1離心1 min，將200 μL 上清與沉淀再次混勻后均勻涂布到含AMP 的LB 固體培養基上，將平板倒置并于37 ℃下過夜培養。

(4)鑒定：將從(3)中的培養基上挑取8 個單菌落加入到10 μL 無菌水中，取2 μL 作為模板，并按照Izumi 的方法進行PCR 反應。反應完成后進行序列測定。

鑒定成功后，將剩余的8 μL 菌液加入到LB(AMP+)液體培養基進行選擇培養，并隨后進行菌種保存。

1.3.2 殺香魚假單胞菌熒光定量標準曲線建立與反應體系優化

將1.3.1 中保存的含有表達殺香魚假單胞菌特異片段質粒的大腸桿菌進行復蘇和搖床培養，并使用Axyprep Plasmid miniprep kit 試劑盒(Axygen，美國)提取質粒。測定質粒濃度并根據公式：質?？截悢?copies·μL-1)=質粒濃度(ng·μL-1)×6×1014/(660×堿基數)[13]進行拷貝數換算。用ddH2O 對質粒逐級進行10 倍稀釋，共8 個梯度。以稀釋后各濃度梯度的質粒為模板按如下程序進行熒光定量PCR 反應并生成標準曲線(n=3)(QIAquant96 2plex，QIAGEN，德國)：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火和延伸45 s。根據反應結果，調整引物和模板的加入量，摸索退火和延伸步驟的溫度和時間，優化擴增條件。

1.3.3 引物特異性檢測

利用實驗室前期采集到的感染刺激隱核蟲Cryptocaryon irritans、哈維氏弧菌Vibrio harveyi和虹彩病毒Iridovirus的小黃魚病魚材料，分別參照SC/T 7217-2014、CONEJERO,et al[14]和GB/T 36191-2018 提供的檢測方法獲得3 個病原的目的片段。

利用1.2 中合成的引物，分別以1.3.1 中提取到的質粒和獲得的刺激隱核蟲、哈維氏弧菌和虹彩病毒特異片段為模板進行熒光定量PCR 反應，通過比較上述4 種病原的擴增情況確定所設計引物的特異性。

1.4 熒光定量PCR 反應技術體系質量檢測

1.4.1 重復性檢測

比較1.3.2 中8 個稀釋梯度下標準品的Ct 值的組內重復性和組間重復性。組內重復性包括每個稀釋梯度下Ct 值的平均值、標準差和變異系數。組間重復性主要包括間隔1 d 后用相同的方法對同一樣品進行再次檢測時各Ct 值的平均值、標準差和變異系數。

1.4.2 靈敏性和準確性檢測

將1.3.2 中的質粒標準品按10 倍數量逐級稀釋10 個梯度，以每個梯度的質粒DNA 為模板分別進行熒光定量PCR 反應，通過有效Ct 值來確定可以有效檢測到的最小拷貝數，并將擴增產物進行測序和BLAST 比對分析，以對熒光定量PCR 反應體系的準確性進行檢測。

另外，以小黃魚養殖水體DNA 為模板，使用ddH2O 對DNA 進行10 倍數量級共8 個梯度的稀釋，以各梯度的DNA 為模板分別進行熒光定量PCR 和普通PCR 套式反應并對兩者的PCR 產物分別進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，通過比較條帶亮度對熒光定量PCR 方法和普通PCR 方法的靈敏度進行比較。

1.4.3 有效性檢測

在2021.11.1——2021.12.1 階段內，對小黃魚養殖區域水體進行逐天采樣，使用采水器采取魚排內養殖水體，水樣存放于15 mL 無菌離心管中且于-20 ℃保存，使用DNA 提取試劑盒(愛基因，寧波)提取水體DNA，并利用已建立的熒光定量PCR 方法對水樣中殺香魚假單胞菌含量進行定量檢測。

2 結果

2.1 菌種鑒定

通過測序獲得序列片段為：

通過BLAST 對比結果如圖1 所示，通過比對分析確定從小黃魚中分離到的菌種為殺香魚假單胞菌。

圖1 菌種blast 對比結果Fig.1 Blast comparison results of strain

2.2 引物設計結果

利用NCBI 中“pick primers”工具對1.1 所得序列設計熒光定量PCR 反應引物，并委托相關生物公司進行引物合成，引物結果如表3 所示。

表3 殺香魚假單胞菌熒光定量PCR 引物序列Tab.3 The list of primers sequences of P.plecoglossicida for real-time PCR

2.3 引物特異性檢測

參照SC/T 7217-2014、CONEJERO，et al[14]和GB/T 36191-2018 分別對小黃魚來源的刺激隱核蟲、哈維氏弧菌和虹彩病毒進行檢測和序列鑒定，獲得的上述3 種病原的特定序列和比對結果如下。

其中刺激隱核蟲的序列和比對結果如圖2 所示。

圖2 刺激隱核蟲的序列和比對結果Fig.2 Sequence and alignment of the C.irritans Brown

哈維氏弧菌的序列和比對結果如圖3 所示。

圖3 哈維氏弧菌的序列和比對結果Fig.3 Sequence and alignment of the V.harveyi

虹彩病毒的序列和比對結果如圖4 所示。

圖4 虹彩病毒的序列和比對結果Fig.4 Sequence and alignment of the iridescent virus

分別以上述3 種病原的和1.3.2 中提取到的質粒DNA 為模板，利用設計合成的引物進行熒光定量PCR 反應結果如圖5 所示，結果顯示只有殺香魚假單胞菌標準品質粒(A)存在有效熒光信號，其余3 種病原(B，C，D)均無有效熒光信號，表明該引物有很好的特異性。

圖5 SYBR Green I 熒光定量PCR 方法的特異性測定Fig.5 Specificity determination of SYBR Green I fluorescence quantitative PCR

2.4 殺香魚假單胞菌重組質粒構建結果

送測序列結果與基因庫殺香魚假單胞菌序列比對一致，證明標準品構建完成。

“殺香魚假單胞菌-pClone007 simple vector”重組質粒目的片段序列比對結果如圖6 所示。

圖6 “殺香魚假單胞菌-pClone007 simple vector”重組質粒目的片段序列比對結果Fig.6 The sequences comparison results for target fragments of recombinant plasmids of"P.plecoglossicida-pClone007 simple vector"

2.5 熒光定量PCR 反應體系構建結果

2.5.1 標準曲線繪制與反應體系優化結果

稀釋后的8 個濃度梯度的標準品反應擴增曲線如圖7(a)所示。以標準品質粒起始拷貝數的對數為橫坐標，以Ct 值為縱坐標，繪制標準曲線，其相關數據如圖7(b，c)，其斜率為-3.17，截距為34.64，相關系數R2=0.995 51。對各稀釋梯度下PCR 擴增反應產物的溶解曲線進行分析，結果顯示各反應的溶解溫度均為86～87 ℃(圖7d)。

圖7 殺香魚假單胞菌SYBR Green I 熒光定量PCR 的標準曲線及相關參數Fig.7 The standard curve of SYBR Green I fluorescence quantitative PCR for P.plecoglossicida and relative parameters

通過多次實驗結果比較，發現退火和延伸溫度為60 ℃、延伸時間為45 s，引物0.3 μL 時(濃度為10 μmol·L-1)時反應的特異性及擴增效率最佳。最佳反應條件為：(1)預變性：95 ℃，30 s；(2)變性：95 ℃，10 s；(3)退火和延伸：60 ℃，45 s，35 個循環。PCR 儀默認融解曲線條件：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。

2.5.2 熒光定量PCR 反應體系的重復性檢測結果

通過用建立的SYBR Green I 熒光定量PCR 方法對濃度為101，102，103，104，105，106，107，108copies·μL-1的標準品質粒進行檢測(n=3)，擴增反應曲線如圖8 所示，結果表明建立的SYBR Green I 熒光定量PCR 組內變異系數為0.08%～0.82%。隔天用同樣的方法對同一批樣品進行檢測，得出組間變異系數為0.08%～0.8%(表4)。

圖8 SYBR Green I 熒光定量PCR 方法的重復性檢測Fig.8 Repeatability test of SYBR Green I fluorescence quantitative PCR method

表4 SYBR Green I 熒光定量PCR 方法的重復性檢測Tab.4 Repeatability test of SYBR Green I fluorescence quantitative PCR

2.5.3 熒光定量PCR 反應體系的準確性和靈敏性檢測結果

以10-1，100，101，102，103，104，105，106，107，108copies·μL-1的質粒標準品為模板進行熒光定量PCR 反應，并對PCR 產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示能檢測出質粒的最小濃度為10 copies·μL-1(圖9)。進一步通過對熒光定量PCR 反應產物進行測序，測序結果如下：

圖9 不同濃度下質粒標準品熒光定量PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.9 The Agarose gel electrophoresis results of fluorescence quantitative PCR products of plasmid standard at different concentrations

圖10 熒光定量PCR 反應產物BLAST 比對結果Fig.10 BLAST comparison results of fluorescence quantitative PCR reaction products

以小黃魚養殖水體DNA 為模板，使用ddH2O 對DNA 逐級進行10 倍稀釋，共8 個梯度，以各梯度的DNA 為模板分別進行SYBR Green I 熒光定量PCR 和普通PCR，結果顯示100 倍稀釋條件下，SYBR Green I 熒光定量PCR 方法仍能對水體DNA 進行有效檢測(圖11a)，而普通PCR 無法檢測出任意稀釋梯度的DNA(圖11b)。

圖11 SYBR Green I 熒光定量PCR(a)和普通PCR 方法(b)的靈敏度比較Fig.11 Comparison of sensitivity between SYBR Green I fluorescence quantitative PCR and conventional PCR

2.5.4 有效性檢測結果

利用本研究建立的熒光定量檢測技術對2021 年11 月寧波象山港小黃魚養殖區域水樣中的殺香魚假單胞菌進行定量檢測，結果如圖12 所示，發現該月份內養殖水體中殺香魚假單胞菌的濃度在256～8 078 copies·μL-1范圍內波動，但也存在極端情況，如在11.14、11.21 和11.27 的濃度分別為2.16×104、1.36×104和2.86×104copies·μL-1。

圖12 小黃魚養殖水域水體殺香魚假單胞菌含量變化Fig.12 Content variation of P.plecoglossicida in the aquiculture waters of L.polyactis

3 討論

近年來，隨著養殖密度的增加和養殖水質惡化，病害對魚類養殖的威脅依然嚴峻，例如，根據2020 年漁業統計年鑒，2019 年全國水產品養殖總量為50 790 728 t，水產苗種總產值為6 584 904.54 萬元，而由病害造成的經濟損失高達231 119.62 萬元。小黃魚是我國重要的養殖新興魚類，自2015 年首次實現全人工養殖以來各項養殖技術不斷完善[3,14]，并且成功結束養殖中試階段，開始進入產業化推廣階段。養殖成活率的高低對后續能否實現產業化發展至關重要，養殖中發現體外白點病、體內白點病和弧菌病是小黃魚養殖中的主要疾病，其中相比體外白點病和弧菌病有明顯的發病癥狀，體內白點在外觀上無明顯癥狀，養殖中因此也往往不能及時采取預防措施。針對上述現狀，建立病害快速檢測技術及開發預警系統對減少由病害造成的經濟損失具有重要促進作用。

殺香魚假單胞菌在分類上屬于惡臭假單胞菌屬[6,15]，研究已經發現該菌對多種魚類如香魚Plecoglossus altivelis[4]、虹鱒[6]和大黃魚中均存在致病現象[8,16]。大黃魚感染會導致病魚的脾臟、腎臟和肝臟出現白色結節，并導致高死亡率。本實驗室根據殺香魚假單胞菌中DNA 回旋酶B 亞基基因(gyrB)的一段大小為520 bp 的特異片段設計特異性引物，建立了殺香魚假單胞菌的熒光定量PCR 檢測方法[9]。經過檢驗，該方法與常見小黃魚其他常見疾病病原無交叉反應，具有較強的特異性，靈敏度達到10 copies·μL-1。標準曲線顯示出良好的線性相關性，相關系數可達0.996，擴增效率為107%，組內和組間變異系數均小于0.82%，重復性好。實際應用驗證方面，我們發現運用本研究建立的技術在對2021 年11 月份水體中殺香魚假單胞菌定量時能檢測到256 copies·μL-1的濃度水平，說明了與周濤等[11]針對該菌所建立的熒光定量PCR 檢測方法能達到的1.9×103copies·μL-1最低水平相比，我們建立的方法具有更高的靈敏度，能有效實現對特定月份下水體中殺香魚假單胞菌濃度較低時的有效定量檢測，為后期實驗中完成染病小黃魚體內的帶菌量定量檢測、水質參數與病菌的含量變化之間的相關性分析并最終建立小黃魚內臟白點病預警模型提供了有力的技術支撐。

4 結論

本研究利用殺香魚假單胞菌DNA 回旋酶B 亞基基因(gyrB)中某一特異分子片段構建質粒標準品，通過設計特異性引物，建立了殺香魚假單胞菌實時熒光定量PCR 檢測技術，經重復性分析，該方法的組內和組間變異系數均小于0.82%，其靈敏度達到10 copies·μL-1。通過實際應用驗證，本研究建立的方法與前人研究相比進一步擴大了水體中殺香魚假單胞菌的有效定量檢測范圍，能夠較精確地體現出該菌在養殖水體及魚體內的季節性變化。