鱭屬魚類耳石形態學比較與短頜鱭物種有效性分析

楊凡，劉明智，欒會妮，廖傳松，王佳成，馮廣朋，蔣日進，徐漢祥

(1.浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，農業農村部重點漁場漁業資源科學觀測試驗站，浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021；2.威海海洋職業學院，山東榮成 264300；3.中國科學院水生生物研究所，湖北武漢 430072；4.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090)

生物體的形態特征在不同環境下表現不同，這通常是生物體對生活環境長期適應的結果[1]。目前，有關生物體形態學的差異性與環境的相互關系已然成為生物學界研究的熱點話題之一[2-3]。對水生動物而言，耳石形態常用于不同種群間的比較研究，如東太平洋不同海區莖柔魚Dosidicus gigas耳石形態及生長研究[4]，嘉陵江不同流域蛇鮈Saurogobio dabryi耳石形態特征及差異等[5]。這些研究都在嘗試解釋耳石形態與環境相互適應的關系。魚類耳石形態特征通常取決于多種因素，如遺傳、環境因素等。在特定的水域環境條件下，同一種魚類耳石形態特征因其相同的環境條件和生境履歷特征而表現出較高的同質性[6]，而在不同水域環境，為了更好地適應不同水溫、水流速度等環境因素其耳石形態則會表現出異質性[5]。

耳石作為一種硬骨魚類最早鈣化的組織，記錄著魚類的年齡以及生活環境等相關信息，常用來鑒定魚類年齡[7]和重塑魚類生活史[8]等。近些年來，如許氏平鲉Sebastes schlegelii、弧帶鸚嘴魚Scarus dimidiatus耳石形態特征被國內外學者用作群體劃分的依據[9-10]。通常認為，在群體識別與劃分研究中，相較于星耳石和微耳石，矢耳石更適合[11]。目前常用于表征耳石形態的參數主要有2 種：耳石尺寸參數和耳石形狀指標，前者通常是對耳石進行幾何測量如：長、寬、周長、面積和質量等；后者是通過耳石大小變量經過數學轉換來表征耳石形狀的某一方面信息，如形態因子，矩形趨近率、面密度等。尺寸參數與形狀指標的結合能更好地表征不同種類的耳石特征，從而能更好地劃分不同群體。

近些年來，耳石形態在長江中下游、長江口以及鄰近海域鱭屬魚類如刀鱭Coilia nasus、短頜鱭C.brachygnathus和湖鱭C.ectenestaihuensis的研究中已取得一定的進展。這些研究通常采用框架法和地標點法的手段對不同魚類的耳石形態特征進行比較[12-13]，這些分析方法易受人為因素影響，無法準確全面地反映耳石形態的真實情況，但耳石的尺寸參數與形狀指標可以較好地反映耳石形態特征，此外根據耳石尺寸參數和形狀指標進行差異系數檢驗、均數差異顯著性檢驗等一系列分析可以有效地識別物種有效性，鑒別近緣種。這在湖鱭物種有效性等方面已經有一定研究[14]，但是對于爭議較大的短頜鱭物種有效性卻未見報道。為此，本研究以楠溪江、甌江、香溪河水域的3 種鱭屬魚類：刀鱭、鳳鱭C.mystus和短頜鱭為研究對象，利用耳石尺寸參數和形狀指標劃分不同群體。一方面以期能更好地表征耳石形態，為鱭屬魚類的群體劃分提供科學的參考，另一方面豐富不同流域鱭屬魚類耳石形態學數據，為更好地區分和保護不同區域鱭屬魚類提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究共采集98 尾鱭屬魚類。其中刀鱭32 尾，來自永嘉楠溪江；鳳鱭31 尾，來自溫州甌江；短頜鱭35 尾，來自秭歸香溪河。具體信息如表1 所示。樣本經過冷凍保存后，送回實驗室進行生物學測定(體長、體質量)。

表1 刀鱭、鳳鱭和短頜鱭的采樣信息Tab.1 Sampling information for C.nasus, C.mystus and C.brachygnathus

1.2 耳石處理

取出樣本的1 對矢耳石，分別裝入離心管內并用蒸餾水浸泡1 h，后在JP-030 型超聲波清洗機(深圳潔盟，中國)中洗滌30 min，除去耳石黏液與雜質。清洗結束后，按照標號順序依次置于培養皿內，室溫下干燥。

1.3 耳石形態學參數與形態指標

刀鱭耳石形態學參數包括耳石尺寸參數和形狀指標。尺寸參數利用Mettler Toledo PL403 電子天平(梅特勒托利多，瑞士)對耳石進行稱重(精確至0.000 1 g)。利用Nikon SMZ-2000 解剖顯微鏡(尼康，日本)對左、右矢耳石拍照，如圖1 所示，利用Image-Pro Plus 6.0 軟件測量耳石形態學參數(精確至1 mm)；形狀指標利用尺寸參數計算得出，如表2 所示。

圖1 3 種鱭屬魚類矢耳石照片Fig.1 The sagittal otolith of three Coilia spp.

表2 鱭屬魚類耳石尺寸參數與形狀指標Tab.2 Size dimension parameters and shape indices of otolith used to describe the three Coilia spp.

A1：面密度(surface density)：耳石單位面積的質量。表征耳石的薄厚程度，可以反映耳石的三維特征；A2：環率(circularity)：耳石周長與耳石面積平方的比值；A3：橢圓率(ellipticity)：耳石長與寬的差與和的比值，指的是外緣點到長軸的距離的比例；A4：圓度(roundness)：耳石橫截面接近圓的程度，環率與圓度表征耳石趨近于圓的程度，二者呈負相關；A5：幅形比(aspect ratio)：耳石長與耳石寬的比值，表征耳石軸間的差異程度；A6：矩形趨近率(rectangularity)：耳石面積與其最小外切矩形面積的比值，描述了耳石輪廓與耳石最小外接矩形的關系；A7：形態因子(form-factor)：4 倍耳石面積和圓周率的乘積與耳石周長平方的比值，反映耳石輪廓的規則程度[15]。上述耳石形狀指標在一定程度上可以避免耳石形態分析誤差，如耳石大小、形狀等客觀因素。

1.4 數據分析

對左右耳石尺寸參數和耳石形狀指標分別進行差異系數檢驗、均數差異顯著性檢驗和配對樣本t檢驗，對7 個形態指標分別進行主成分分析和判別分析。

(1) 差異系數檢驗

差異系數(C.D)：用于檢驗群體間某一相同性狀的差異程度，通常用于區分亞種。根據MAYR,et al[16]提出的識別和劃分亞種的75%規則，公式如下：

式中：M1和M2為2 個群體某一相同形態性狀平均值；S1和S2為對應標準差；C.D 為判斷亞種和種水平的臨界值，大于臨界值(1.28)差異性達到亞種水平，相反則屬于種間差異。

(2)均數差異顯著性檢驗

均數差異顯著性(Mdiff)：分析群體間某一相同性狀的差異程度的t檢驗方法。公式如下[17]：

式中：ni和nj為群體樣本數；Mi和Mj為某一性狀平均值；mi和mj為對應性狀的標準誤差；概率水準為P=0.05，以t＞2.58 為差異顯著的檢驗標準。

(3)配對樣本t檢驗

分析左右耳石尺寸參數和耳石形狀指標，以檢驗左右耳石是否存在差異。

(4)主成分分析

計算形態指標特征值，選擇大于1 的主成分因子。利用第一、二主成分得分繪制成分載荷圖。

(5)判別分析

根據Fisher’s 準則[17]對耳石形狀指標進行逐步判別分析，建立3 種鱭屬魚類的線性判別函數方程，以便查明樣本的歸屬情況。

上述所有分析運用SPSS 24.0 軟件，制圖使用Origin 2022 軟件。

2 結果

2.1 差異系數檢驗

差異系數檢驗如表3 所示，刀鱭和短頜鱭的7 個耳石尺寸參數在2 個種間的差異系數均小于1.28，根據MAYR,et al[16]的規則判定刀鱭與短頜鱭在耳石形態上的差異未達亞種水平，二者為同種下的不同生態型群體。

表3 刀鱭和短頜鱭耳石尺寸參數的差異系數和均數差異顯著性Tab.3 Mdiff and C.D of otolith measurement characteristic of C.nasus,and C.brachygnathus

2.2 均數差異顯著性檢驗

通過對刀鱭和短頜鱭耳石的7 個尺寸參數的均數差異顯著性檢驗，發現僅耳石周長的均數差異顯著性值小于2.58，其余的6 個參數均數差異顯著性值均大于2.58。均數差異顯著性比例非常高，說明具有不同生活史的2 種鱭屬魚類在耳石形態方面已經存在明顯的種群差異特征。由于鳳鱭的分類地位較為明確，是單獨的物種。因此本文僅研究刀鱭與短頜鱭的差異系數與均數差異顯著性檢驗。

2.3 配對樣本t 檢驗

3 種鱭屬魚(以刀鱭為例，如表4 所示)的左右矢耳石參數與指標差異均不顯著(配對樣本t檢驗，P＞0.05)。因此，統一使用左耳石進行數據分析，若出現左耳石破損可用右耳石替代。

表4 刀鱭左右矢耳石的差異性分析Tab.4 The analysis of t-test for the left and right sagittae of C.nasus

2.4 主成分分析

主成分分析結果如表5 所示，3 種魚類中均有2 個形狀指標的特征值大于1，分別記作第一主成分和第二主成分。第一主成分分別解釋了約49%、44%、49%的變量信息。刀鱭的第一主成分中A4、A6具有較高的正載荷，A2、A7的載荷量較低；鳳鱭的第一主成分中A3、A5具有較高的正載荷，A2、A7的載荷量較低；短頜鱭的第一主成分中A1、A6具有較高的正載荷，A4的載荷量較低；第二主成分中，刀鱭的A1、鳳鱭的A3、A7、短頜鱭的A3、A5有著較高的載荷量，他們與第一主成分分別解釋了78%、81%和90%的變量信息。前2 個主成分散點圖顯示：3 個種群分布在4 個象限內，這種分布表現出一定的隨機性，各個群體之間存在明顯的交叉現象(圖2)。

圖2 3 種鱭屬魚類耳石形狀指標第一、二主成分分析散點圖Fig.2 Scatter plot scores based on the first two principal components for otolith shape indices of three Coilia spp.

表5 3 種鱭屬魚類耳石形狀指標主成分分析結果Tab.5 The result of principal component analysis for otolith shape indices of three Coilia spp.

2.5 判別分析

將3 種鱭屬魚類的7 種耳石形態指標數據輸入SPSS 軟件，利用逐步判別分析得到3 個耳石形狀指標(A1、A2、A7)，將這3 個形態指標納入判別分析的方程：

將各個體的耳石形狀指標依次代入以上3 個判別方程，每個個體得到3 個函數值，最大的函數值對應的判別函數表示的群體即為該個體所屬的群體。判別結果如表6 所示，可以看出判別正確率在90.3%～100%之間，綜合判別正確率為93.8%。

表6 3 種鱭魚判別分析結果Tab.6 Discriminant result of three Coilia spp.

圖3 是基于前2 個判別函數值繪制的散點圖，3 個群體之間各自呈區域性聚集，鳳鱭和短頜鱭有少部分重疊，刀鱭為單獨聚類。

圖3 判別函數散點圖Fig.3 Scatter plot based on the first two discriminant functions

3 討論

3.1 矢耳石形態指標識別刀鱭和短頜鱭物種地位的有效性

目前，對于短頜鱭的物種地位有效性存在很大爭議。短頜鱭最早被KREYENBERG 和PAPPENHEIM于1908 年確定為1 個物種，因其上頜骨和生活環境等特征不同于其他鱭屬魚類，因此被視為一個有效種[18]。但隨著調查的深入，在一些江湖連通的水域中也發現了短頜鱭的蹤影，上頜骨這一明顯鑒別刀鱭和短頜鱭的特征變得模糊，一時間對于短頜鱭物種有效性引起了許多學者的廣泛討論[19]。目前關于這二者的分類地位存在不同觀點：在21 世紀初期，許多研究認為短頜鱭物種地位是無效的，唐文喬等[20]基于線粒體控制區全序列計算短頜鱭與刀鱭之間平均K2-P 遺傳距離僅為0.017，認為短頜鱭是刀鱭的淡水生態型群體。周曉犢等[21]利用線粒體COⅠ基因作為DNA 條形碼，再次證明了短頜鱭未達到種或亞種的分化水平。近幾年，XUAN Zhongya,et al[22]利用分子生物學與耳石微化學學科相結合的手段，對刀鱭與短頜鱭進行了群體遺傳分析，認為二者應作為2 個獨立的鱭屬魚類，這與本世紀初其他研究結果不同。本文利用差異系數檢驗分析刀鱭與短頜鱭耳石形態特征，根據MAYR,et al[16]的差異系數計算法則，所檢驗的7 個參數均小于1.28，表明刀鱭與短頜鱭之間的差異并未達到亞種水平，支持2 種魚類為同一物種的結論。均數差異顯著性檢驗結果顯示二者在耳石形態方面存在較大的差異。從結果不難看出，刀鱭與短頜鱭之間分化水平較低，由于長期生活在不同的水域環境中，導致不同耳石形態有明顯的種群差異性。在不同魚類群體之間，耳石形態特征主要由遺傳因素決定[23]，此外耳石形態還受到環境異質性等因素的影響，這一點在大西洋鱈Gadus morhua身上得到了很好的驗證，水溫對其耳石形態方面起到了重要的作用[24]。不同水域間，水體環境往往存在一定的差異。本文所研究的刀鱭和短頜鱭分別采自楠溪江與香溪河。楠溪江位于甌江下游，與甌江水體交換頻繁，并與東海連通；而香溪河是三峽庫區一級支流中距離三峽大壩最近的河流。三峽大壩竣工后，香溪河水體與長江水體交換速度緩慢。兩地存在巨大的地理差異，這也就造成二者耳石均數差異顯著，耳石形態存在明顯差異。這也再次證明不同水域環境對魚類耳石形態有著較大的影響。

3.2 3 種鱭屬魚類矢耳石多元統計分析比較

利用3 種鱭屬魚類耳石尺寸參數與形狀指標分別進行配對t檢驗，結果表明左右耳石各項指標差異均不顯著(P＞0.05)，再次驗證我國鱭屬魚類左右矢耳石無顯著性差異[25]?；谧笥沂付商娲?、個體大、易于觀察等優勢，其可靠性已然成為物種特征形態學分析的有利工具[26]。主成分分析可以較好地篩選重要變量，降低遺漏重要變量的風險，簡化分析統計過程[27]。本文主成分分析結果的累計貢獻率較好地解釋了總變異。在主成分分析散點圖中，3 種魚類耳石樣本相互交織在一起，進一步結合判別分析散點圖，可以較好地利用耳石形態區分3 種不同群體，顯示這3 種魚在耳石方面存在較大的區別，這也與上述結論相符合。在判別分析中，篩選得到A1(面密度)、A2(環率)、A7(形態因子)3 個形狀指標，這些指標可以作為今后開展鱭屬魚類耳石形態分析的主要候選指標，可以較大程度提高群體識別能力。此外，判別分析的綜合正確率為93.8%，證明耳石形態學是有效地識別這3 種魚的方法。因此，利用耳石形態學鑒別不同群體時，應盡可能地多收集樣本的大小變量(周長、直徑、面積等)和形狀指標(形態因子、橢圓率等)，綜合2 種角度對群體的識別效果更好[6]。在魚類群體識別中，除了運用種群生態學分析法如形態學法、生活史特征分析、寄生蟲標志法等，還常見到種群遺傳分析和耳石信息分析的方法。遺傳分析對于生活史高度重疊、遺傳差異性較小的魚類時，其鑒別效果會大打折扣。而耳石作為一種特異性高、群系特異性顯著的生物標志物[28]，用于區分魚類群體優勢(易于保存、受到外界影響小等)更加明顯。將不同的耳石信息分析方法相結合，能更好地劃分不同的魚類群體[29-30]。相信隨著耳石形態學研究工作的進一步深入，其在漁業資源相關領域的研究中會起到越來越重要的作用。

3.3 我國鱭屬魚類的分類

目前，我國鱭屬魚類包括刀鱭、鳳鱭、七絲鱭C.grayi3 種，這一觀點得到了絕大多數學者的支持[31-39]。鳳鱭在鱭屬魚類中，處于系統發育較為原始的位置，刀鱭和七絲鱭分別為適應寒冷與溫暖性氣候的分化的物種[20]。短頜鱭與湖鱭分別為刀鱭的2 個不同生態型群體，隨著時間的推移，在地理格局與水體環境等因素的綜合影響下，不排除短頜鱭與湖鱭分化為亞種的可能。如表7 所示，在鱭屬魚類的研究中，過去往往集中于長江中下游至長江口及其周圍湖泊水域，東海區也有部分研究，長江上游流域刀鱭耳石形態暫無報道。長江中上游有許多大型水利設施，形成天然的地理隔離，這些水利樞紐可能阻礙了上游與下游流域魚類基因的交流；相較于上游，中下游流域大型水利設施較少，魚類基因交流較為頻繁，中上游的短頜鱭群體保留了較為原始的鱭屬魚類特征，這可能是本研究與XUAN Zhongya,et al[22]研究結果不一致的原因。

表7 中國鱭屬魚類分類的研究現狀Tab.7 The research status of Coilia spp.classification in China

綜上所述，由于本文僅利用耳石形態對鱭屬魚類進行種間識別并對物種有效性進行分析，在討論鱭屬魚類種間識別與物種有效性問題時可能存在一些短板，今后應結合分子生物學等手段，對耳石形態學得出的相關結論進行驗證，進一步判斷耳石形態學在種間識別等問題研究中的科學性。此外，本文對短頜鱭物種進行有效性分析時，短頜鱭樣品收集僅選擇在長江上游(秭歸香溪河)，并未采集長江中游與下游流域的樣品，因此在討論物種有效性時，應豐富不同流域的樣本，因地制宜地對不同流域的種類分別進行討論，綜合研判，以此確定其有效地位。

致謝：本研究在耳石的形態學測量、照片拍攝等方面得到了自然資源部第二海洋研究所毛琴同學的大力幫助，特表謝忱！