原油對潮間帶泥蚶抗氧化酶活性影響初步探究

劉銘華，侯偉芬，陳帆，徐青霞，潘玉英,2，楊燦燦，林子涵，韋丹，楊金生

(1.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋漁業裝備技術研究重點實驗室，浙江舟山 316022；3.浙江海洋大學石油化工與環境學院，浙江舟山 316022)

隨著現今全球經濟快速發展，能源需求與日俱增，海洋石油開采和運輸也穩步增長，海洋石油污染也愈發嚴重[1]。海洋石油污染不僅給海洋漁業經濟帶來破壞性影響，也對海洋及潮間帶生物造成巨大危害。石油中的多種成分都能對生物產生一定的毒性，并且石油中的烴類還可以通過生物間營養級轉換達到毒性富集，因此這種發生在食物鏈上的積累性危害是難以預測的[2]。作為海洋生態系統的重要組成部分，潮間帶不僅對海洋漁業和河口生產力起著不可忽視的作用，還可以為大洋地區營養鹽提供重要補充[3]。由于潮間帶是海陸交匯部分，其生態平衡易受人類活動干擾，石油污染更會使潮間帶生態系統過度負擔[4]。石油污染生物降解作用與潮間帶地區的營養鹽和溶解氧含量有一定的相關性[5]，且沉積物中的石油污染物短期內不易去除[6]。因此，研究原油對潮間帶生物的毒理效應在評估海洋石油泄漏造成的潮間帶生態破壞方面具有重要的理論意義。

生物標志物是指示污染物危害效應的生物信號。由于抗氧化防御系統會參與清除機體中毒產生的物質，因此在研究污染物對生物的致毒效應方面通常都以抗氧化酶活性變化為標志物[7]。生物體內的抗氧化系統可以在機體中毒時第一個做出反應，在保護機體中扮演著重要角色。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是4 種常用的抗氧化酶生物標志物。近年來，前人在實驗和野外條件下，開展了一些污染物對生物抗氧化系統的影響的研究工作，其中也有污染物對貝類抗氧化酶活性影響變化的一些研究[8-13]。

泥蚶Tegillarca granosa一般較多聚集于內灣及河口附近的潮間帶上，其數量于潮間帶中、低潮區最多，埋藏棲息于淤泥之中。泥蚶生活習性對于潮間帶沉積物原油污染開展實驗十分契合，是開展實驗的優選對象。前人研究發現，生物體中位于鰓和肝臟中的靶細胞是石油污染引起抗氧化酶系統影響的主要部位[14]。鰓作為絕大部分海洋生物的呼吸器官，呼吸作用是原油等污染物進入生物體重要形式[15]；位于內臟團中的肝臟是生物體內解毒主要器官[16]，也常被選做生物毒性效應的實驗組織。泥蚶暴露于原油中，鰓和內臟團酶活性變化可作為描述石油污染下生物生理機能情況的重要生物標志物。通過研究泥蚶鰓和內臟團4 種酶活性(包括SOD、CAT、GST 和GPx)在其暴露于不同濃度原油中72 h 的變化趨勢，探討泥蚶暴露于原油中的毒性效應，探索是否可以將泥蚶鰓和內臟團抗氧化酶活性作為監測海洋早期原油污染的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

紫外-可見光分光光度計(上海美譜達儀器有限公司，UV-1100B 型)，高速離心機(寧波群安電子科技有限公司，JOANLAB MC-12Pro)，恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司，HWS-24)，旋渦混合器(常州越新儀器制造有限公司，XH-C)，移液槍(Eppendorf)，電子天平(上?；ǔ彪娖饔邢薰?，UTP-313)。

1.1.2 試劑

SOD、CAT、GST、GPx 和蛋白質測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，所用正己烷、無水乙醇等均為分析純。

1.2 實驗原油

實驗原油取自浙江省舟山市岙山島，原油成分如圖1 所示，其中生物標志物主要包括三環萜烷、降藿烷、升藿烷、奧利烷、膽甾烷、孕甾烷、伽馬蠟烷、莫烷等。

圖1 原油組成成分Fig.1 Composition of crude oil

1.3 海水與沉積物

實驗海水為天然海水過濾后備用，鹽度為23，預先由充氧泵充分充氧。

沉積物取自浙江省舟山長峙島潮間帶，風干后過1 mm 和2 mm標準篩按照質量比1：1 混合備用。

1.4 實驗設計

實驗裝置由6 個濃度(將6 個不同濃度區分為低、高2 個濃度組，其中低濃度組：0、500、1 000 和1 500 mg·kg-1；高濃度組：10 000 和15 000 mg·kg-1)，每個濃度3 個平行共計18 個海水和沉積物混合養殖箱組成，污染濃度為原油和沉積物干重質量比，其中0 mg·kg-1為空白對照組。用電子天平按照預設濃度準確稱量實驗原油，與養殖箱中5 kg 風干沉積物混勻，接著將5 kg 海水緩慢均勻地倒入養殖箱，靜置備用，并在每個框內配備25 W 功率充氧泵1 臺放在插置于沉積物中塑料瓶內，進行對實驗干擾較小的充氧過程，保證泥蚶成活率(圖2)。

圖2 模擬生境養殖箱示意圖Fig.2 Schematic diagram of the simulated habitat breeding box

實驗生物泥蚶購買于浙江省舟山市新城金島老街菜市場，平均殼長為(3.02±0.16) cm，平均殼寬(2.12±0.12) cm，平均殼高(2.32±0.14) cm，平均殼重為(10.36±0.13) g，將泥蚶放置在無原油環境養殖箱中進行為期5 d 暫養，每個箱內準確放入25 只泥蚶，暫養期間用微型充氧泵24 h 不停息充氧，每天1 次將養殖箱內海水換出50%以上(暫養期間更換海水均已用充氧泵充氧)，暫養期間不投喂，水溫基本恒定在18.8 ℃，鹽度為24.5。暫養結束后，將泥蚶轉移至上述準備養殖箱中。實驗期間，每2 天1 次將每個箱中海水換出50%以上，實驗期間條件與暫養期相同。

在污染暴露第72 h 取樣。每次每個養殖箱取泥蚶2 只，活體解剖，取出鰓和內臟團，經過冰純水和生理鹽水沖洗后，用鑷子小心夾取于吸水紙上吸干水分，稱量后迅速放入凍存管于液氮中進行冷凍，再將冷凍好的凍存管樣品放在冰箱里進行超低溫保存。測定時，從冰箱中取出樣品，置于冰上器皿內并加入準確計量的生理鹽水進行研磨操作，磨至無明顯大塊組織后裝入2 mL 離心管中，使用漩渦混勻器進行混勻，然后于離心機中進行轉速2 500 r·min-1離心。取上清液，用于酶活性測定。

1.5 酶活性測定

于1.4 中獲得上清酶液，按照考馬斯亮藍法測定蛋白濃度[17]；SOD、CAT、GST 和GPx 酶活性測定均按照試劑盒說明進行操作。

1.6 數據分析及誘導倍數計算

實驗數據使用SPSS 軟件進行統計學方法處理，通過單因素方差分析原油暴露引起的差異；采用t檢驗法對組間數據進行兩兩比較，P＜0.05，認為是差異顯著；所給出結果均為平均值±標準差。濃度組中酶活性大于其對照組酶活性，為誘導；反之，則為抑制。

由于原油濃度差異對生物組織酶活性也會出現不同程度抑制或者誘導，于是通過計算生物酶活性誘導倍數可以進一步探索泥蚶體內抗氧化酶活性在污染暴露過程中變化。

式中：I為誘導倍數；Ni和N分別為各濃度組和對照組酶活性。

2 結果

2.1 泥蚶鰓和內臟團4 種抗氧化酶活性差異

統計對照組泥蚶體內4 種抗氧化酶活性，如表1 所示。泥蚶鰓中SOD、CAT 和GST 酶活性高于內臟團，內臟團中GPx 酶活性則高于鰓。由于各組織結構和功能不同，且酶與酶間也存在著差異，使得同一種酶在不同組織中表現出酶活性差異。

表1 泥蚶鰓和內臟團中4 種抗氧化酶活性差異Tab.1 Differences in activities of four antioxidant enzymes in gills and viscera mass

2.2 不同濃度原油對泥蚶SOD 酶活性影響

如圖3a 所示，泥蚶鰓SOD 活性隨原油濃度增加呈升高——降低趨勢，且各污染組與對照組中SOD 酶活性差異均不顯著(P＞0.05)。其中，在500 和1 000 mg·kg-1實驗組時，SOD 酶活性被誘導高于對照組，分別是對照組的1.07 倍和1.06 倍，其中酶活性最大為500 mg·kg-1濃度組210.22 U·mgprot-1；而1 500、10 000和15 000 mg·kg-1濃度組SOD 酶活性則低于對照組，分別是對照組0.82 倍，0.83 倍和0.84 倍，其中酶活性最小值只有159.46 U·mgprot-1。

圖3 不同濃度原油對泥蚶鰓(a)和內臟團(b)SOD 酶活性影響Fig.3 Effects of different concentrations of crude oil on SOD enzyme activities in the gills (a) and visceral mass (b)of the T.granosa

如圖3b 所示，泥蚶內臟團中SOD 酶活性隨原油暴露濃度增加呈降低——升高——降低趨勢，且各污染暴露組與對照組中SOD 酶活性差異均不顯著(P＞0.05)。在500、1 500、10 000 和15 000 mg·kg-1濃度組時，SOD 酶活性均是受到抑制低于對照組，其中，15 000 mg·kg-1濃度組SOD 酶活性是最小值只有67.22 U·mg prot-1，是對照組0.82 倍；而1 000 mg·kg-1濃度組SOD 酶活性是最大值且高于對照組達到88.73 U·mgprot-1，是對照組1.08 倍。

2.3 不同濃度原油對泥蚶CAT 酶活性影響

如圖4a 所示，泥蚶鰓中CAT 活性隨原油濃度變化呈降低——升高——降低趨勢，且各污染組與對照組中酶活性差異均不顯著(P＞0.05)。其中，在500 mg·kg-1實驗組時，CAT 活性受到誘導高于對照組，是對照組1.01 倍；在1 000 和1 500 mg·kg-1污染組時，CAT 酶活性則低于對照組，分別是對照組0.94 倍和0.84 倍；在10 000 mg·kg-1原油污染組中，CAT 酶活性受到誘導達到最大值203.12 U·mgprot-1，且高于對照組，是對照組1.06 倍；而在15 000 mg·kg-1污染暴露組時CAT 酶活性又低于對照組，且達到最小值133.69 U·mgprot-1，是對照組0.7 倍。

圖4 不同濃度原油對泥蚶鰓(a)和內臟團(b)CAT 酶活性影響Fig.4 Effects of different concentrations of crude oil on CAT enzyme activities in the gill (a)and visceral mass (b)of the T.granosa

如圖4b 所示，泥蚶內臟團CAT 活性隨著原油濃度變化呈升高——降低趨勢，且各實驗組中CAT 活性均大于對照組，且無顯著差異(P＞0.05)。其中，在500、1 000、1 500 和10 000 mg·kg-1濃度組濃度變化時，CAT 酶活性逐漸增大，在10 000 mg·kg-1濃度組CAT 酶活性達到最大值72.01 U·mgprot-1，是對照組1.13倍；在濃度為15 000 mg·kg-1時，相較于10 000 mg·kg-1濃度組下降但仍高于對照組。

2.4 不同濃度原油對泥蚶GST 酶活性影響

如圖5a 所示，泥蚶鰓GST 酶活性隨原油暴露濃度增加呈升高——降低——升高趨勢，且各污染組中GST酶活性與對照組均無顯著差異(P＞0.05)。其中，在暴露原油濃度為500 mg·kg-1實驗組中，其GST 活性受到誘導高于對照組達到485.45 U·mgprot-1，為對照組1.26 倍；而在原油濃度為1 000、1 500 和15 000 mg·kg-1濃度組GST 酶活性都低于對照組，分別是對照組0.78 倍、0.53 倍和0.69 倍；在10 000 mg·kg-1濃度組時，泥蚶鰓GST 酶活性低于對照組達到最小值193.90 U·mgprot-1，是對照組0.5 倍。

圖5 不同濃度原油對泥蚶鰓(a)和內臟團(b)GST 酶活性影響Fig.5 Effects of different concentrations of crude oil on GST enzyme activity in gills (a) and visceral mass (b) of T.granosa

如圖5b 所示，泥蚶內臟團GST 酶活性隨原油暴露濃度變化呈降低——升高——降低趨勢。各個原油濃度組GST 活性都顯著低于對照組(P＜0.05)，其中500、1 000、1 500 和15 000 mg·kg-1濃度組分別是對照組0.49倍、0.64 倍、0.45 倍和0.46 倍，而原油濃度為10 000 mg·kg-1濃度組酶活性只有46.14 U·mgprot-1，是對照組0.15 倍。

2.5 不同濃度原油對泥蚶GPx 酶活性影響

如圖6a 所示，泥蚶鰓GPx 活性隨原油暴露濃度變化呈升高——降低——升高趨勢。泥蚶鰓暴露于500 mg·kg-1實驗組時，GPx 受到誘導，酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)，此時GPx 酶活性高達85.29 U·mgprot-1，為對照組2.76 倍；另外，10 000 mg·kg-1濃度組酶活性與對照組也表現出差異顯著性(P＜0.05)酶活性被誘導達到78.12 U·mgprot-1，為對照組2.53 倍。之后隨暴露組濃度增加，GPx 酶活性降低，在15 000 mg·kg-1濃度組時達到最低值56.40 U·mgprot-1，但各濃度組GPx 酶活性均高于對照組。

圖6 不同濃度原油對泥蚶鰓(a)和內臟團(b)GPx 酶活性影響Fig.6 Effects of different concentrations of crude oil on GPx enzyme activities in gills (a) and visceral mass (b) of the T.granosa

如圖6b 所示，在暴露72 h 之后，泥蚶內臟團中GPx 酶活性變化趨勢大致呈現為升高——降低——升高的趨勢，且各污染組中GPx 酶活性與對照組無顯著差異(P＞0.05)。其中，泥蚶內臟團暴露在1 000 mg·kg-1實驗組中時，GPx 酶活性受到誘導達到峰值44.11 U·mgprot-1，為對照組1.07 倍；剩余各污染組GPx 酶活性均低于對照組。

2.6 4 種酶最大誘導倍數差異

泥蚶鰓和內臟團中SOD、CAT、GST 和GPx 酶活性最大誘導倍數差異如表2 所示。內臟團SOD、CAT最大誘導倍數均高于鰓(P＞0.05)，而鰓GPx 最大誘導倍數顯著高于內臟團(P＜0.05)，另外，內臟團GST最大誘導倍數不存在。除了CAT 最大誘導倍數發生在較高濃度(10 000 mg·kg-1)，其余均產生在較低濃度(≤1 000 mg·kg-1)。

表2 泥蚶鰓和內臟團4 種酶活性最大誘導倍數差異Tab.2 The maximum induced multiple differences of the four enzymes in gills and visceral mass

3 討論

多個抗氧化酶構成的抗氧化系統作為生物重要防御體系，在生物體受到外部環境脅迫時，參與Ⅰ相和Ⅱ相反應催化污染物生成代謝物，并對機體內的異常量活性氧(ROS)自由基進行清除[18-19]。SOD 是一種能夠催化發生歧化反應將生物體內超氧化物轉化為氧氣和過氧化氫的酶，可以使得細胞免受氧化破壞[20]，已有報道將抗氧化酶作為魚類氧化脅迫的生物標志物[21-22]。有研究表明，在污染物濃度低的情況下SOD 活性會出現升高趨勢，而在污染物濃度較高時SOD 活性常會降低，這使得對生物體有害的活性氧會在機體內累積，對生物體造成傷害[23]。本實驗結果顯示泥蚶內臟團SOD 活性呈降低——升高——降低的趨勢；泥蚶鰓組織中各濃度組SOD 活性呈升高——降低趨勢，與前人實驗結果相同[23]，而內臟團在500 mg·kg-1濃度組酶活性抑制于對照組，鰓組織卻沒有出現這種情況，表明原油進入機體器官組織的先后順序會對不同組織某些酶活性產生不同結果。楊濤等[24]研究發現，污染時間與濃度不同，SOD 活性誘導存在差異性，反映了生物對有毒化合物響應存在明顯適應閾值。在低濃度組，SOD 活性隨著原油濃度變化而上升，說明泥蚶為減少原油污染物暴露造成的傷害，其機體應激反應產生了大量的SOD，來清除過量自由基。而1 500 mg·kg-1和高濃度組SOD 活性被抑制，可見1 500 mg·kg-1為其閾值濃度，而當生物體自身調節能力不足以適應原油污染作用時會出現中毒反應[25]。原油濃度高，產生自由基的速率遠超過了抗氧化酶自我清除的速率和最大限度，造成SOD 酶活性降低，導致機體細胞受到損傷[24]。

CAT 可以催化細胞中過氧化氫(H2O2)分解，具有防止機體細胞過氧化的作用。在外界污染壓力下，機體內自由基增多，使得細胞膜過氧化，進而造成細胞膜破壞和損傷[26]。本實驗研究發現，隨著原油濃度增大，泥蚶內臟團CAT 活性表現出先升高后降低變化趨勢，這可能是由于在低濃度原油影響下，為減少生物體內激增的自由基，CAT 活性開始升高，以催化細胞內過氧化氫分解，使得機體受損概率大幅減小。隨著暴露濃度增加，高濃度原油影響已經超過了CAT 可以調節的平衡限度，因而CAT 活性降低。高永剛等[27]在研究櫛孔扇貝Chlamys farreri也有相似結論，楊寶等[26]認為這可能和實驗過程中產生可以抑制CAT 活性的O2-有關。

GST 屬于Ⅱ相反應酶類，可以催化GSH 和某些外部污染性物質形成易排出體外的疏水性化合物，具有促進解毒作用[19]。在雙殼類生物體內，GST 酶活性較高，且在各個組織中都存在[26]。本實驗研究發現，泥蚶鰓GST 活性高于內臟團，陳榮等[28]發現僧帽水母Ostrea cucullata鰓GST 活性也會高于其他組織。有研究表明GST 活性隨著濃度變化呈升高——降低趨勢[28-29]。任加云等[30]將櫛孔扇貝暴露在多氯聯苯中，發現在低濃度處理下其GST 活性升高，高濃度影響下則降低。然而，也有研究和此結果不一致。前人發現銀鯽Carassius auratus gibelioGST 活性在暴露4 周時才被誘導[31]；陳家長等[19]研究表明羅非魚Oreochromis mossambicus暴露于BaP 中24、48 和96 h 其肝臟濃度組酶活性與對照組沒有顯著區別。本實驗顯示泥蚶鰓GST 活力首先被誘導升高隨著污染濃度增加而開始降低抑制，這與在苯并[a]芘B(a)P 污染條件下梭魚Mugil soiuyGST 活性均有先誘導后抑制相似變化趨勢[29]一致，在15 000 mg·kg-1濃度組雖有上升趨勢但酶活性依舊處在抑制階段。而泥蚶內臟團各濃度組均顯著抑制于對照組，各濃度組酶活性變化隨濃度增大呈升高——降低——升高的較不穩定趨勢，可以通過增加濃度梯度來進一步探索。王重剛等[29]猜測除了生物種類異同外，可能與污染物種類和濃度不同以及暴露時間有關。由于生物暴露于原油污染中各個器官組織接觸污染時間、濃度都大不相同，影響生物各部位組織酶活性自然會不同。因此，前人在探索GST 活性時，出現GST 活性誘導、抑制等多種情形，除了污染物種類等幾種變量不同之外，還可能和不同的器官組織有關。

GPx 是機體內重要的過氧化物分解酶，能夠清除異常量的過氧化物以保持機體平衡[32]。本實驗研究表明，泥蚶鰓和內臟團中GPx 酶活性在低濃度組中隨著原油濃度增大呈升高——降低趨勢，李傳慧等[33]在半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis幼魚原油暴露實驗中發現肝臟GPx 酶活性隨著濃度增加而先升高后降低；段美娜等[34]也在馬糞海膽Hemicentrotus pulcherrimus實驗中有類似發現。泥蚶鰓和內臟團GPx 酶活性暴露在500 和1 000 mg·kg-1濃度時上升，表明此時生物體內抗氧化酶開始對過量ROS 進行清除，使細胞免受損傷，從而維持機體正常代謝[35]；而隨著原油濃度增大，酶活性明顯下降，說明此時GPx 酶活性受到了抑制。本研究中泥蚶鰓和內臟團低濃度組GPx 活性呈先被誘導后被抑制趨勢，這與本研究中SOD 和CAT 活性變化規律一致，SOD、CAT 二者和GPx 之間可能存在相關性。楊濤等[24]認為SOD 歧化反應后的產物H2O2恰好是GPx 的作用底物，導致二者變化規律一致，而CAT 和GPx 活性提高以清除代謝中產生的H2O2，使生物體不受到較大氧化損傷。

觀察發現，鰓中4 種抗氧化酶活性及峰值均高于內臟團。對比最大誘導倍數(表2)，除了CAT 其余3種酶最大誘導倍數均產生于500 mg·kg-1濃度組，表明相較于內臟團，在外源性污染物存在的情況下鰓更容易出現酶活性誘導現象，這可能是原油中有機物通過鰓進入生物體內后，參與生物體代謝過程產生大量ROS，導致ROS 劇增而出現代謝失衡，以致機體受到氧化損傷。因此，GPx 誘導并通過催化作用與對機體有損傷的過氧化物反應，減少ROS 的產生量并將其清除，緩和細胞的氧化[35-36]。通過對比不同原油濃度對泥蚶鰓和內臟團酶活性變化的差異顯著性，發現僅鰓中GPx 酶活性發生顯著誘導現象(圖6a)，這說明泥蚶鰓GPx 對原油毒性效應更明顯?？傊?，鰓的4 種抗氧化酶活性均大于內臟團，泥蚶鰓組織GPx 酶活性表現出顯著誘導，且在各個酶的最大誘導倍數中鰓組織中的GPx 最大。因此，相較于其他酶，GPx 更適合作為監測原油污染的有效生物標志物。

4 結論

(1)暴露在原油72 h 內泥蚶鰓SOD、GST，內臟團CAT 和低濃度組GPx 酶活性隨著原油濃度增加總體表現為先升高后降低趨勢，并且存在一定劑量——效應關系。

(2)泥蚶鰓中SOD、CAT 和GST 酶活性高于內臟團，內臟團中GPx 酶活性則略高于鰓，且鰓GST 和GPx 酶活性最大誘導倍數比內臟團高，而SOD 和CAT 鰓和內臟團最大誘導倍數無較大差異，表明泥蚶鰓對原油污染更加敏感。

(3)結合酶活性及誘導倍數大小，泥蚶鰓GPx 酶活性更靈敏，可作為早期海洋原油污染監測的生物標志物。