蒼術素對非小細胞肺癌細胞上皮間質轉化的影響及機制研究

朱亞蘭 呂世文 曾晨欣 徐媛青

非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理類型，發病率與病死率較高，晚期NSCLC 患者多采取放療或化療的治療方式，但長期使用化療藥物的患者易發生耐藥性，影響患者預后，因此進一步尋找有效治療藥物對改善患者預后具有重要意義[1-2]。蒼術素（atractylodin，ATR）是從蒼術中提取的有效成分，具有降血糖、抗炎、促胃排空、利尿等作用，研究顯示，ATR 在肝癌、膽管癌中具有抗腫瘤活性，如通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR）通路和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信號通路抑制膽管癌細胞增殖并誘導膽管癌細胞自噬[3-4]。Janus 激酶2/信號轉導子與轉錄激活子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路在腫瘤的轉移與侵襲及腫瘤耐藥中發揮重要作用，抑制JAK2/STAT3 信號通路的激活可抑制肺癌細胞的增殖與侵襲[5-6]。目前，關于ATR 影響NSCLC 細胞耐藥及其機制的研究尚未見報道。本研究探索ATR 對NSCLC 細胞上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）的影響及可能的作用機制，為其用于NSCLC 的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及培養 人NSCLC 細胞HCC827（批號：CTCC-400-0172）購于浙江美森細胞科技有限公司；在含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM 培養基中常規培養，細胞融合至80%時，消化細胞并傳代培養。每2 d更新培養液。

1.1.2 主要試劑 ATR（純度≥98%）粉劑購自成都植標化純生物技術有限公司，批號：PCS0115，用二甲基亞砜溶解，配制成400.0 μmol/L 的母液，備用；CCK-8試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司，批號：E1008-1000；STAT3 激活劑Colivelin 購自MCE 公司，批號：HY-P1061A；兔抗人上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、鋅指蛋白轉錄因子（Snail）1 購自Santa Cruz 公司，批號分別為sc-71008、sc-59987、sc-393172）；RIPA 裂解液、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠配置試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，批號為P0013B 和P0012A；磷酸化JAK2（p-JAK2）、JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）、STAT3、β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自碧云天生物科技有限公司，批號分別為AF1486、AF1489、AF1495、AF1492 和AF5003。

1.2 方法

1.2.1 細胞存活率檢測 取對數生長期細胞以1×104/孔的密度接種于96 孔板中。分別加入10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L 的ATR 處理24、48、72 h，根據CCK-8 檢測試劑盒方法檢測細胞生長情況，測定450 nm 處吸光度值，并計算細胞存活率。

1.2.2 細胞處理及分組 將對數生長期細胞分為對照組、ATR 藥物低、中、高濃度組（ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組）、ATR+Colivelin 組，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組分別使用10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 處理24 h，ATR+Colivelin 組 使 用40.0 μmol/L 的ATR 與0.5 μmol/L 的Colivelin 共同處理24 h，對照組僅加入等量的二甲基亞砜。

1.2.3 細胞劃痕實驗 取各組細胞稀釋為1×105/ml的細胞懸液，取2 ml 加入6 孔板中，待細胞長滿培養皿，使用20 μl 移液槍頭在細胞層上進行劃痕，PBS 洗去不貼壁的細胞，更換無血清培養基培養24 h，顯微鏡下觀察并測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。

1.2.4 細胞侵襲實驗 取各組細胞使用無血清稀釋成2×105/ml 的細胞懸液，Transwell 小室鋪稀釋Matrigel 基質膠，待膠干后，上室加入100 μl 細胞懸液，下室加入含10%FBS的培養液，培養24 h。使用甲醛固定20 min，結晶紫染色，顯微鏡下隨機選取5 個視野，觀察侵襲細胞，計算平均每個視野的侵襲細胞數。

1.2.5 EMT 相關蛋白表達的檢測 采用Western blot法。收集各組細胞，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，檢測蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳分離蛋白并轉膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，分別加入E-cadherin、N-cadherin、Snail1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 和βactin 抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，顯影并拍照，以β-actin 為內參，Imge J 軟件分析蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 不同濃度ATR 處理對細胞存活率的影響 隨ATR 濃度升高，細胞存活率呈逐漸降低趨勢；培養24 h，HCC827 細胞培養半數抑制濃度為（63.51±1.15）μmol/L。因此選擇濃度為10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 進行后續實驗，見圖1。

圖1 不同濃度ATR 處理對細胞存活率的影響

2.2 ATR 對細胞遷移與侵襲的影響 與對照組比較，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組細胞劃痕愈合率顯著降低，侵襲細胞數顯著減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；隨ATR 濃度 升 高，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組細胞劃痕愈合率逐漸降低，侵襲細胞數逐漸減少，呈藥物濃度依賴性（P＜0.05）；與ATR-H 組比較，ATR+Colivelin 組細胞劃痕愈合率顯著升高，侵襲細胞數顯著增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 ATR 對細胞遷移及侵襲的影響

2.3 ATR 對細胞EMT 相關蛋白表達的影響 與對照組比較，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組E-cadherin 蛋白相對表達水平均顯著升高，N-cadherin、Snail1 蛋白相對表達水平均顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；隨ATR 濃度升 高，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組E-cadherin 蛋白相對表達水平逐漸升高，Ncadherin、Snail1 蛋白相對表達水平逐漸降低，呈藥物濃度依賴性（P＜0.05）；與ATR-H 組比較，ATR+Colivelin 組E-cadherin 蛋白相對表達水平顯著降低，Ncadherin、Snail1 蛋白相對表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 ATR 對細胞EMT 相關蛋白表達的影響（A：電泳圖；B：EMT 相關蛋白相對表達水平）

2.4 ATR 對細胞JAK2/STAT3 通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達水平均顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；隨ATR濃度 升高，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達水平逐漸降低，呈藥物濃度依賴性（P＜0.05）；與ATR-H 組比較，ATR+Colivelin 組 細 胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白相對表達水平均顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 ATR 對細胞JAK2/STAT3 通路相關蛋白表達的影響（A：電泳圖；B：JAK2/STAT3 通路相關蛋白相對表達水平）

3 討論

肺癌表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變陽性率較高[7-8]，吉非替尼為治療EGFR 基因突變肺癌的一線藥物，但患者易產生耐藥性，從而影響治療效果[9-10]。耐藥已成為NSCLC治療的主要難題，因此尋找新的治療藥物對于改善NSCLC 患者預后具有重要意義[11-12]。研究顯示NSCLC的耐藥與細胞EMT 有關，抑制EMT 可逆轉NSCLC 耐藥性[13-14]。

ATR 具有抗炎、抗菌、抗腫瘤和免疫調節等多種藥理活性[15-17]。研究顯示，ATR 可通過抑制P13K/Akt/mTOR 通路抑制乳腺癌細胞增殖，誘導氧化應激介導的細胞凋亡和自噬[18]。在肺癌中，ATR 通過調節活性氧介導的信號通路抑制肺癌細胞增殖、遷移，誘導細胞周期停滯與細胞凋亡[19]。以上研究表明ATR 對肺癌有一定抗腫瘤活性。本研究顯示，10.0～160.0 μmol/L的ATR 均可顯著抑制NSCLC HCC827 細胞增殖，與報道結果類似。NSCLC 細胞遷移和侵襲能力增加是腫瘤轉移及病情惡化的重要原因之一[20-21]，本研究顯示使用10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 處理HCC827 可顯著抑制細胞遷移與侵襲，且呈藥物濃度依賴性，表明ATR 在NSCLC 中表現為抗腫瘤性，與先前報道結果類似。E-cadherin、N-cadherin、Snail1 是EMT 標志物，Ecadherin 可維持細胞間黏附作用，N-cadherin 可促進細胞的遷移，發生EMT 時N-cadherin、Snail1 上調表達，E-cadherin 下調表達[22-23]。抑制NSCLC 細胞EMT 可顯著抑制腫瘤惡性進展與耐藥性[24]。本研究結果顯示，使用ATR 可顯著上調E-cadherin 表達，下調N-cadherin、Snail1 蛋白表達，提示ATR 可抑制NSCLC 細胞增殖、遷移、侵襲和EMT。

為進一步闡明ATR 抑制NSCLC 細胞增殖、遷移、侵襲的作用機制，本研究檢測JAK2/STAT3 通路相關蛋白磷酸化水平。JAK2/STAT3 信號通路在參與調節細胞增殖、凋亡方面發揮重要作用，與腫瘤發生、發展密切相關，同時該通路還參與免疫調節和炎性反應過程[25-26]。JAK2 的 活 化 可 促 進STAT3 磷 酸 化，JAK2/STAT3 通路的激活可促進腫瘤細胞遷移、侵襲與EMT[27-28]。JAK2/STAT3 通路還與腫瘤耐藥性有關，在肺癌中，β-欖香烯可能通過抑制JAK2/STAT3 信號通路激活，抑制腫瘤細胞增殖，誘導凋亡，降低肺癌細胞對紫杉醇的耐藥性[29]。Chae 等[30]發現，ATR 可抑制JAK2、STAT3 的磷酸化，降低佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯誘導的人肥大細胞中的IL-6 水平。另有研究顯示，在膽管癌細胞系CL-6 中，ATR 以劑量依賴性和時間依賴性方式抑制STAT3 蛋白磷酸化，從而抑制CL-6 細胞的增殖和遷移[31]。本研究結果表明，ATR 可抑制NSCLC 細胞JAK2、STAT3 蛋白磷酸化水平，且呈藥物濃度依賴性，提示ATR 具有抑制JAK2/STAT3 通路激活的作用；給予STAT3 激活劑Colivelin 后，ATR 對JAK2、STAT3 蛋白磷酸化水平的抑制作用減弱，同時細胞增殖、遷移和侵襲能力增強，證實ATR 對NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲與EMT 的抑制作用可能是通過抑制JAK2/STAT3 通路活化實現的。

綜上所述，ATR 通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制NSCLC 細胞增殖、遷移與EMT，ATR 在NSCLC 中的抗腫瘤活性仍需結合動物模型進行更深入的研究。