喉癌內皮細胞THBS1 的表達與臨床意義

王嘉寧 沈志森 林晨 王嘉達 沈一鳴

喉癌是頭頸部最為常見的惡性腫瘤之一，2007 至2017 年，我國喉癌發病率大幅增加[1]。2020 年全球有18 萬例喉癌新發病例，其中10 萬人死亡[2]。聲門上型喉癌富含血管和淋巴管，早期可發生血行轉移和淋巴轉移，是造成不良預后的主要原因。內皮細胞既是構成血管和淋巴管通道的主要細胞成分，也是腫瘤微環境中重要的基質細胞，在腫瘤的進展和侵襲中發揮關鍵作用。內皮細胞可分泌血小板凝血酶蛋白（thrombospondin，THBS）家族成員之一的THBS1，有研究表明THBS1 與多種腫瘤的發生、發展密切相關[3]。Pal 等[4]發現在口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）腫瘤微環境中，腫瘤細胞可以誘導內皮細胞表達THBS1，THBS1 刺激腫瘤細胞的遷移和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達，從而促進口腔鱗癌的侵襲。本研究采用單細胞轉錄組測序對來自5 例聲門上型喉癌患者的腫瘤組織、癌旁組織及轉移淋巴結中的內皮細胞進行分群，挖掘其生物學功能，比較內皮細胞亞群組成差異，結合免疫組化染色研究THBS1 在喉癌內皮細胞中的表達，并探討該因子在喉癌臨床診斷及治療中的潛在價值，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 標本采集 采集2019 至2021 年在寧波市醫療中心李惠利醫院接受手術治療的3 例伴淋巴結轉移的喉癌患者的術中新鮮標本，包括喉癌腫瘤組織、配對的癌旁組織、轉移淋巴結，以及2 例無淋巴結轉移喉癌患者的腫瘤組織。納入標準：（1）經病理學檢查證實為聲門上型喉鱗狀細胞癌；（2）患者為初次診斷，未進行放化療；（3）所取癌旁組織遠離腫瘤邊界至少0.5 cm，且所取腫瘤組織、癌旁組織及轉移淋巴結組織經病理檢查證實。5 例患者的臨床資料見表1。本研究經醫院醫學倫理委員會批準（批件號：KY2020PJ191），患者術前均簽署知情同意書。

表1 5 例喉癌患者臨床資料

1.2 方法

1.2.1 單細胞懸液制備、單細胞轉錄組測序 將新鮮的組織標本切碎，經PBS 洗滌2～3 次后保存于4 ℃保存液中，送至實驗室。根據制造商指南使用人類腫瘤分離試劑盒（德國Miltenyi Biotec 公司, 批號：130-095-929）解離組織。隨后通過細胞篩過濾及離心后獲得單細胞懸液，去除紅細胞及細胞碎片，細胞存活率＞85%，符合上機要求。采用微流控系統進行細胞分選，裂解細胞后行逆轉錄和擴增，構成cDNA 文庫，隨后應用NoveSeq 6000 系統測序儀進行測序。

1.2.2 單細胞轉錄組測序數據預處理 利用Cell Ranger 軟件處理原始數據，將測序輸出的數據與人類參考基因組進行比對。將處理定量后的測序數據加載到R 包Seurat（版本：4.2.1），利用“scDblFinder”軟件過濾雙細胞數據，在質量控制過程中剔除線粒體、血細胞、核糖體等基因的干擾。數據過濾及質量控制標準包括：過濾掉基因表達＜700 或＞2 000，線粒體基因表達＞20%的細胞。

1.2.3 細胞類型和亞型鑒定 為了糾正單細胞技術導致的樣本間差異，采用SCTransform 算法進行數據標準化并計算表達值，隨后運行Harmony 算法進行多樣本批次矯正及數據整合。主成分分析（principal component analysis，PCA）對數據進行降維，最終確定25 個主成分，利用t-分布領域嵌入算法（t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE）及統一流行逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）進行非線性降維及可視化。利用Seurat 中的Find-Neighbors 函數和FindClusters 函數以0.5 的分辨率聚類后可獲得25 個細胞亞群，最后通過FindAllMarkers 函數計算各亞群特征基因，每個聚類的特征基因通過Wilcoxon 秩和檢驗，結合生物學背景知識人工鑒定各亞群類型?；诘湫偷膬绕ぜ毎麡酥疚锾崛?56個內皮細胞，對其進一步降維聚類后將內皮細胞分為4 簇。

1.2.4 基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomics，KEGG）分析 利用“GOplot”包、“topGO”包、“enrichplot”包“circlize”包、“clusterProfiler”包，對內皮細胞亞群顯著差異基因進行GO 功能注釋和KEGG 富集分析，探索細胞亞群的主要功能，尋找富集的顯著通路。

1.2.5 癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）隊列分析 從TCGA 數據庫中下載123 例喉癌樣本的基因表達數據和臨床參數信息，其中腫瘤樣本111 例，正常樣本12 例，利用“Survival 包”對內皮細胞中高表達的差異基因進行Kaplan-Meier 生存分析。

1.2.6 免疫組化染色 40%甲醛溶液固定手術切除的喉癌及正常組織標本，石蠟包埋后切片，石蠟切片經過梯度乙醇及二甲苯脫蠟、脫苯后，乙二胺四乙酸抗原修復液中孵育20 min，進行高溫高壓抗原修復。3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，3%牛血清白蛋白溶液進行血清封閉。分別滴加THBS1 抗體（美國Abcam 公司，批號：267388，1∶500）、FLT1 抗體（美國Abcam 公司，批號：32152，1∶50）和絲氨酸蛋白抑制劑E1（serine protease inhibitor clade E member 1，SERPINE1）抗體（美國Abcam 公司，批號：154591，1∶100），室溫孵育1 h，PBS 漂洗3 次，滴加與一抗相應種屬的二抗（1∶1 000），PBS 再次漂洗后用二氨基聯苯胺（美國Sigma公司，批號：ZLI-9018）溶液顯色，蘇木素復染，脫水后封片。

2 結果

2.1 喉癌腫瘤微環境單細胞表達圖譜 經過多重質量控制獲得45 207 個高質量的單細胞納入下一步分析，通過PCA 及t-SNE 得到25 個細胞簇，利用生物學知識對各簇細胞的標記基因進行注釋，共鑒定出以下幾種主要細胞類型：上皮細胞（epithelial cells）、內皮細胞（endothelial cells）、單核細胞（monocyte cells）、T 細胞（T cells）、CD8+T 細胞、自然殺傷性T 細胞（natural killer T cell，NK T)、B 細胞（B cells）、肥大細胞（mast cells）、樹突狀細胞（dendritic cells）、巨噬細胞（macrophage cells），成纖維細胞（fibroblasts cells），見圖1（插頁）。

圖1 通過單細胞轉錄組測序分析喉癌組織的腫瘤微環境組成（A：喉癌樣本收集及單細胞轉錄組測序工作流程；B：展示主要細胞類型的t-SNE 圖）

2.2 內皮細胞亞群功能表征及組成分析 基于典型的內皮細胞標志基因PECAM1（CD31）、CDH5、ERG 等確定了656 個內皮細胞，對其進一步降維聚類后發現喉癌腫瘤微環境中主要包括血管內皮細胞（vascular endothelial cells，vECs）及淋巴管內皮細胞（lymphatic endothelial cells，lECs），vECs 根據其特征基因可分為以血管內皮生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1/FLT1）為標志基因的血管內皮細胞（vECs-FLT1），特異高表達非典型趨化因子受體1（atypical chemokine receptor 1，ACKR1）的內皮細胞（vECs-ACKR1），及顯著高表達G 蛋白信號轉導調節蛋白5（regulator of G protein signaling 5，RGS5）的血管內皮細胞（vECs-RGS5）。淋巴管內皮細胞中CC 類趨化因子配體21（CC chemokine ligand 21，CCL21）顯著上調（lECs-CCL21）。內皮細胞亞群豐度差異分析顯示腫瘤組織中含量最豐富的內皮細胞為vECs-FLT1，其次為vECs-ACKR1，癌旁組織中含量最高的是vECs-ACKR1，其次是vECs-RGS5。vECs-FLT1 在腫瘤組織中的含量顯著高于癌旁組織及轉移淋巴結，提示富含FLT1 的vECs 可能是構成腫瘤供血血管的主要細胞成分。見圖2（插頁）。

圖2 單細胞轉錄組測序評估喉癌腫瘤微環境內皮細胞異質性（A：UMAP 圖顯示降維聚類后內皮細胞亞群及樣本分布；B：內皮細胞各亞群在LC、LM、PT 中的豐度差異；C：氣泡圖示各內皮細胞亞型中差異基因表達）

2.3 GO 分析和KEGG 分析結果 GO 分析示vECs-FLT1 特征基因功能富集于“阿米巴樣細胞遷移”、“調節血管新生”、“調節血管”以及“上皮細胞的遷移”。在細胞組分方面大部分過表達基因是細胞外基質中的膠原蛋白編碼基因。在生物過程方面主要集中于“細胞外基質構成”，“生長因子的結合”及“整合素的結合”等。KEGG 示vECs-FLT1 中上調的基因主要與“磷脂酰肌醇3 激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3 kinase/serine—threonine protein kinase，PI3K/Akt）信號通路”、“局灶黏附”及“HPV 病毒感染”等通路有關。通過富集基因與所在功能通路關系發現THBS1同時參與“血管新生”及“阿米巴樣細胞遷移”。

vECs-ACKR1 亞群GO 富集分析及KEGG 富集分析示該亞群富含核糖體相關基因。vECs-RGS5 亞群GO 分析示大多數過表達基因功能主要富集于“阿米巴樣細胞遷移”，“上皮細胞遷移”及“組織遷移”，在細胞組分方面主要富集于“細胞外基質膠原”、“局灶黏附”及“細胞底部連接”等，在生物過程方面主要集中于“肌動蛋白結合”，KEGG 主要富集于“腫瘤蛋白多糖”相關通路。lECs-CCL21 細胞GO 分析結果顯示在生物過程方面主要集中于“傷口愈合”、“白細胞遷移”，在分子功能方面主要集中于“信號傳導受體激活”、“配受體激活”等，KEGG 分析結果主要包括“趨化因子信號通路”、“局灶黏附”。

2.4 THBS1 及SERPINE1 表達水平與總體生存率的比較 對vECs-FLT1 中高表達的差異基因行生存分析發現THBS1 及SERPINE1 的表達水平與患者生存相關（P＜0.05），喉癌組織中高表達THBS1 及SERPINE1 的患者具有更差的總生存率，見圖3，這提示THBS1 和SERPINE1 高表達可能與喉癌不良預后相關。

圖3 生存分析圖顯示喉癌組織中THBS1、SERPINE1 高表達組和低表達組患者總體生存率比較

2.5 免疫組化證實腫瘤血管內皮細胞高表達THBS1及FLT1 對手術切除的喉癌組織及配對的癌旁組織行免疫組化發現FLT1 在喉癌組織及血管內皮細胞中表達強陽性，為棕褐色，在正常組織中表達為陰性。THBS1 在腫瘤血管內皮細胞中陽性表達呈黃褐色，在正常組織中表達陰性。SERPINE1 在正常組織和腫瘤組織中表達均為陰性。

3 討論

近年來，盡管以手術為主，結合放化療、免疫治療的綜合治療在一定程度上提高了喉癌患者的5 年生存率，但仍有40%的患者死于喉癌復發和轉移[5]。且對于中晚期的患者，保守治療難以達到預期效果，大多需要行部分喉切除術甚至全喉切除術，患者術后會出現長久性的聲嘶甚至失聲、吞咽功能紊亂、吸入性肺炎等術后并發癥。術后生活質量受損及心理因素導致喉癌幸存者的自殺率居高不下[6]。因此發現新的靶向參與腫瘤微環境形成的分子和細胞迫在眉睫，從而優化現有的喉癌治療方案，為耐藥及無法應用PD-1/PD-L1 腫瘤免疫治療的患者提供另一可能的選擇。

早在1971 年，Folkman[7]開創性提出了“腫瘤血管新生”理論即腫瘤的浸潤、生長、轉移均依賴于腫瘤血管生成?；谠摾碚?，臨床發現了一系列抗血管靶向藥物，在非小細胞肺癌等晚期實體腫瘤的臨床應用中大獲成功，作為抗腫瘤治療靶點，在其他腫瘤的治療中也顯示出強大療效。隨著高通量測序技術的發展，臨床得以從單個細胞的水平描述內皮細胞的異質性，發現內皮細胞絕非單純的液體及細胞運輸管道構成成分，其在腫瘤微環境中所發揮的作用非常復雜，一方面，部分血管內皮細胞因其物理屏障作用可防止脫落腫瘤細胞的轉移，同時可通過對免疫細胞的招募和黏附參與抗腫瘤免疫的產生。另一方面，腫瘤內皮細胞通過形態學改變，分泌相關生長因子，上調血管生成相關基因等方式，主動或被動地參與腫瘤的內滲、轉移、免疫耐受及免疫逃避[8]。不同生物學功能的腫瘤內皮細胞在腫瘤轉移前微環境中具體構成比例、可塑性的調控方式、與微環境中其他細胞互作機制是新的研究熱點。Kalucka 等[9]通過對小鼠不同組織來源的內皮細胞進行單細胞轉錄組測序分析發現來自不同血管床（動脈、毛細血管、靜脈、淋巴管）的內皮細胞表現出跨組織的轉錄組相似性，組織類型而非血管類型決定了內皮細胞異質性。

本研究探討內皮細胞在喉癌腫瘤微環境中的異質性及功能，基于臨床5 例喉癌患者獲得的喉癌組織、癌旁組織及轉移淋巴結進行單細胞轉錄組測序，經過質控后獲得45 207 個單細胞，通過內皮細胞標志基因篩選出內皮細胞后，對內皮細胞進一步的亞聚類分析發現喉癌組織中的內皮細胞存在4 種細胞亞型，分別為vECs-FLT1、vECs-ACKR1、vECs-RGS5 及lECs-CCL21。vECs-FLT1 顯著表達特殊內皮“頂細胞”（tip cell）的 特 征 基 因FLT1 及 內 皮 聯 蛋 白（endoglin，ENG）。FLT1 基因通過編碼VEGFR1 參與VEGF 信號通路，ENG 被公認為腫瘤血管生成和新生血管形成的特異性標記，它是轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）家族蛋白質的輔助受體，在腫瘤微環境中，缺氧條件可刺激組織釋放VEGF 和TGF-β，并激活鄰近血管內皮細胞上的VEGF 和TGF-β 等信號通路,被激活的內皮細胞可隨著VEGF 的濃度梯度遷移，向外增殖延伸發育成新的血管[10]，由此可推測vECs-FLT 細胞參與血管出芽。在vECs-FLT1 中還可觀測到膠原亞基編碼基因COL4A1、COL15A1、COL4A2 以及硫酸肝素蛋白多糖2（heparan sulfate proteoglycan 2，HSPG2）的過表達。HSPG2 編碼的蛋白廣泛存在于血管基膜，肝臟及軟骨，參與腫瘤血管的形成[11]。此外質膜小泡相關蛋白（plasmalemma vesicle-associated protein，PLVAP）也在該亞群中上調，已有研究證明PLVAP 與基底血管通透性內皮膜的形成和維持有關，PLVAP 高表達可能在腫瘤細胞的侵襲及轉移中發揮作用[12]。ACKR1 為典型的靜脈標志物，局限表達于小靜脈內皮細胞，參與白細胞的招募[13]，提示vECs-ACKR1 參與構筑腫瘤小靜脈。

周細胞參與構成血管結構的完整性。RGS-5 被確認為血管周細胞的標志基因，可在癌前病變中被特異性誘導，在腫瘤血管中進一步升高，參與血管重塑[14]。此外vECs-RGS5 高表達趨化因子C-X-C 基序配體（CX-C motif chemokine ligand，CXCL）12 基因，Su 等[15]的研究發現CXCL12 作為細胞趨化因子存在于前列腺癌等上皮癌的細胞間質中，通過CXCR4 和CXCR7 受體進行信號傳導，參與激活腫瘤細胞生長和侵襲。

lECs-CCL21 高表達淋巴管內皮細胞標記基因Prospero 相關同源異形盒蛋白1（prospero homeobox 1，PROX1）和CCL21。淋巴管內皮細胞周圍可形成CCL21濃度梯度，調節樹突狀細胞和T細胞等免疫細胞的淋巴遷移及淋巴結歸巢，參與免疫耐受及腫瘤轉移[16]。

vECs-FLT1 主要來源于腫瘤組織，提示該亞型可能是腫瘤血管的主要構成成分，結合對該亞型的GO分析及KEGG 分析示該亞型功能富集于“阿米巴樣細胞遷移”、“血管新生”及“細胞遷移”，“阿米巴樣細胞遷移”是腫瘤細胞侵入和穿出血管的主要運動模式[17]，綜上所述該亞群主要功能可能與促進瘤生長、局部浸潤及遠處轉移有關。通過對vECs-FLT1 差異表達基因繪制生存曲線發現高表達SERPINE1 及THBS1 的喉癌患者具有更差的預后，免疫組化染色驗證了喉癌組織中FLT1 腫瘤血管內皮的存在，且腫瘤血管內皮中THBS1 為陽性表達,提示內皮細胞可能通過分泌THBS1參與腫瘤進展。

THBS1 在腫瘤微環境中的水平取決于腫瘤和基質細胞的表達，它是一個大分子三聚體糖蛋白，具有復雜的結構域和功能域，每個特定的結構域和功能域與不同種類的細胞因子結合可以發揮不同的生物學效應[18]。THBS1 既可以通過與內皮細胞膜上的白細胞分化抗原36、整合素相關蛋白相互作用抑制內皮細胞遷移并促進細胞凋亡，進而抑制血管生成[19]，也可與黏多糖結合，促進腫瘤細胞與內皮細胞的黏附和侵襲，THBS1 與轉化生長因子相互作用時可通過刺激血管生成而促進腫瘤生長和轉移[3]。因此THBS1 在腫瘤進展中起到矛盾而至關重要的作用，其在腫瘤預測及靶向治療上可能有廣闊的應用前景，但THBS1 在喉癌中發揮的功能及其對腫瘤的調控機制尚未完全明確，仍需進一步研究證實。

綜上所述，本研究利用單細胞轉錄組測序成功揭示喉癌內皮細胞的異質性，THBS1 表達情況可以作為輔助區分腫瘤內皮細胞與非腫瘤內皮細胞的參考依據。THBS1 不僅可以作為喉癌不良臨床預后的獨立預測因子，也可能為喉癌的治療提供了一個新的方向與思路，但THBS1 發揮作用的具體調控機制需要進一步的研究。