半胱氨酸通過抑制氧化應激和炎癥減輕鎘誘導的小鼠肝臟脂質代謝紊亂

王靖雯,房志家,高原,關文浩,孫力軍,劉穎

(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋生物制品工程實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東 湛江,524088)

隨著工農業生產的發展,鎘廣泛存在于環境中,會造成食品的污染,對人類健康造成了極大的威脅[1]。研究表明,鎘在體內累積,可導致腎臟、肝臟、睪丸、肺等器官的病理損傷[2-3]。肝臟被認為是鎘積聚并發揮其毒性作用的靶器官[4]。以往的研究表明,鎘會增加氧化應激,促進炎癥和肝功能損傷[5]。此外,各種應激刺激下引起的氧化應激會導致肝細胞脂質代謝紊亂[6-7]。肝臟是脂質代謝的關鍵器官,接觸鎘可引起脂質代謝紊亂而導致肝功能障礙[8]。以前的研究表明,鎘可引起血脂異常,包括總甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白-膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)水平升高[9]。

氨基酸(amino acids, AAs)是構成動物營養所需蛋白質的基本物質,在減少體內過量脂肪方面發揮著重要作用[10]。半胱氨酸,作為一種生物體內常見的氨基酸,在保護雄性大鼠肝臟細胞免受鎘毒性中發揮作用[11]。據報道,半胱氨酸在抗氧化、抗炎、促進脂質代謝方面表現出良好的效果[11-12]。有研究顯示,半胱氨酸可保護肝臟免受重金屬的毒性影響,膳食半胱氨酸影響抗氧化酶活性以及血清和肝臟中的脂質水平[13]。但目前關于不同劑量半胱氨酸對鎘暴露所致肝臟損傷保護作用的研究尚不明確。因此,本研究以小鼠為研究對象,通過組織學檢查和生化指標分析,研究半胱氨酸對急性鎘暴露致肝細胞損傷的保護作用。此外,還評估了肝臟脂質代謝變化,全面闡明半胱氨酸對急性鎘暴露的小鼠肝細胞氧化應激、炎癥和脂質代謝的保護及作用機制。這些發現可能有助于為半胱氨酸臨床應用提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

SPF雄性小鼠(25～35 g),長沙天勤生物科技有限公司;氯化鎘(CdCl2,CAS:7790-78-5),汕頭西龍化工;L-半胱氨酸(CAS:52-90-4)、Trizol試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司;BCA蛋白檢測試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;過氧化氫酶(catalase, CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;TG試劑盒、TC試劑盒、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒,南京建成生物工程研究所;IL-6 ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒,江蘇酶免實業有限公司;去基因組DNA反轉錄預混試劑(StarScript II RT Mix with gDNA Remover),北京康潤誠業生物科技有限公司。

XS105DU型十萬分之一分析天平, 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;Varioskan LUX多功能酶標儀, 美國賽默飛世爾科技有限公司;DMI4000B倒置熒光顯微鏡, 徠卡(Leica)生物系統有限公司;CFX96熒光定量PCR系統, 美國伯樂(biorad)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與處理

24只體重相近的雄性小鼠,將所有動物飼養在含木屑的塑料籠中,并在22～25 ℃的房間中飼養,12 h 光照/夜間循環,自由獲取標準實驗室飼料和水。預飼養1周后,隨機分為4組,每組6只。對照組:每天腹腔注射0.9% NaCl,每天1次;鎘暴露組(Cd):小鼠經0.9%(質量分數)NaCl預處理后腹腔注射CdCl2劑量為5 mg/(kg·d)[14];低劑量半胱氨酸治療組(Cd+L-Cys):在腹腔注射5 mg/(kg·d) CdCl2的基礎上,每日灌胃0.04 mmol/(g·d)的L-半胱氨酸;高劑量半胱氨酸治療組(Cd+H-Cys):在腹腔注射5 mg/(kg·d) CdCl2的基礎上,每日灌胃0.08 mmol/(g·d)的L-半胱氨酸[15]。

1.2.2 動物分組與處理

小鼠自由飲水,禁食15 h后,眼球采血,3 500 r/min離心10 min,收集血清[16],于4 ℃保存備用,用于生化指標評估。7 d結束時,斷頸處死小鼠,取肝臟,并于-80 ℃保存待測。實驗得到了廣東海洋大學動物倫理委員會的批準(批號:GDOU-LAE-2020-009)。

1.2.3 小鼠AST和ALT的活性測定

血液樣本是通過小鼠眼球采集的。采用全自動酶標儀和檢測試劑盒分別測定血清AST和ALT的活性。

1.2.4 組織病理學分析

將肝臟置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定24 h,無水乙醇脫水后,石蠟包埋并進行切片,采用蘇木精和伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色對肝臟進行常規染色,利用倒置熒光顯微鏡在200倍下觀察肝組織。

1.2.5 生化指標測定

將肝勻漿離心以獲得上清液(3 500 r/min,4 ℃離心10 min),根據試劑盒說明書測定TG、TC、SOD、CAT和MDA水平。

1.2.6 炎癥指標測定

將每組的肝臟組織用裂解緩沖液勻漿。將勻漿在4 ℃下以3 500 r/min離心10 min?？偟鞍诐舛炔捎肂CA蛋白檢測試劑盒測定。通過使用ELISA試劑盒檢測肝臟組織中的IL-6、IL-1β和TNF-α濃度,嚴格按照試劑盒要求操作。

1.2.7 實時熒光定量PCR

按照說明書,使用Trizol試劑從肝臟組織中提取總RNA。根據制造商的方案,使用去基因組DNA反轉錄預混試劑(StarScript Ⅱ RT Mix with gDNA Remover)合成第一鏈cDNA。使用 CFX96熒光定量PCR系統(Bio-Rad,USA)對 cDNA 樣品進行實時熒光定量PCR,使用的引物如下[17-18]:SREBP-1(正向:5′-GCAGTCTGCTTTGGAACCTC-3′;反向:5′-CCACAAAGAAACGGTGACCT-3′);ACC(正向:5′-GTTGCACAAAAGGATTTCA-3′;反向:5′-CGCATTACCATGCTCCGC-3′);FAS(正向:5′-TACCAGTGCCACAGGAGTTCCA-3′;反向:5′-TAAACACCTCGTCGATTT-CGTTC-3′);SCD1(正向5′-CTGCCTCTTCGGGAT-TTTCTACT-3′;反向:5′-GCCCATTCGTACACGTGATTC-3′)和β-actin(正向:5′-AGAGGGGAATCGTGCGTGAC-3′;反向:5′-AGGAAGAGGATGCGGCAGTG-3′),所有樣本進行3個重復分析,采用2-ΔΔCt法分析基因表達水平。

1.3 統計學方法

數據使用JMP Pro 13進行顯著性分析,使用GraphPad Prism(美國,GraphPad軟件)進行繪圖。數據采用平均數±標準差表示,組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 半胱氨酸對鎘暴露小鼠血清肝功能酶活性的影響

在藥物中毒性肝細胞壞死時,ALT和AST大量釋放入血中,因此是診斷中毒性肝炎的重要指標。小鼠血清ALT和AST活性檢測結果見圖1。與對照組相比,鎘暴露組ALT,AST活性極顯著升高(P<0.01);與鎘暴露組相比,不同濃度的半胱氨酸處理組ALT,AST活性均極顯著降低(P<0.01)。

a-ALT活性;b-AST活性圖1 半胱氨酸對鎘暴露小鼠血清肝功能酶活性的影響Fig.1 Effect of cysteine on the activity of serum liver function enzymes in cadmium-exposed mice注:與空白對照組相比,**表示P<0.01;與鎘暴露組相比,##表示P<0.01(下同)

2.2 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝組織病理變化的影響

為了進一步評估半胱氨酸對Cd誘導的小鼠肝損傷的保護作用,本文評估了肝臟組織學變化。對照組中肝索細胞有序排列(圖2-a);鎘暴露組小鼠肝臟中央靜脈可見大量出血現象,中央靜脈周圍可見少量炎性細胞浸潤(圖2-b);低劑量和高劑量半胱氨酸組的肝臟病理變化較鎘組有所緩解(圖2-c、圖2-d)。這表明半胱氨酸緩解了鎘引起的肝臟組織損傷。

a-對照組;b-Cd組;c-Cd+L-Cys組;d-Cd+H-Cys組圖2 半胱氨酸對鎘中毒小鼠肝組織病理變化的影響(200×)Fig.2 Effect of cysteine on histopathological changes in the liver of cadmium-exposed mice(200×)

2.3 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟總TG和TC水平的影響

脂質代謝紊亂已被證明在肝損傷中起著關鍵作用。本文檢測了肝臟樣本中的TC和TG水平(圖3)。結果表明,鎘可提高肝臟中的TG和TC水平(P<0.01);給予半胱氨酸后TC水平極顯著降低(P<0.01),TG水平顯著降低(P<0.05)。這些結果表明,半胱氨酸對鎘干擾的脂質代謝具有緩解作用。

a-肝臟TC水平;b-肝臟TG水平圖3 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟總TG和TC水平的影響Fig.3 Effect of cysteine on the levels of total TG and TC in the liver of cadmium-exposed mice注:#表示P<0.05

2.4 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟MDA、SOD、CAT變化的影響

眾所周知,ROS過量產生會導致肝臟脂質代謝紊亂。為了確定半胱氨酸是否增強了參與抗氧化防御系統的酶的活性,本文研究了主要的抗氧化水平。如圖4和圖5所示,鎘暴露后抗氧化酶SOD、CAT活性極顯著降低(P<0.01),脂質過氧化MDA水平極顯著升高(P<0.01);而給予半胱氨酸后,SOD、CAT活性得到恢復;低劑量半胱氨酸組與鎘暴露組相比MDA水平顯著降低(P<0.05);高劑量半胱氨酸組與鎘暴露組相比MDA水平極顯著降低(P<0.01)。這些結果表明,鎘處理小鼠肝臟中脂質過水平升高可能是由于自由基的過度產生和鎘對抗氧化防御的侵蝕。通過半胱氨酸干預鎘暴露小鼠可以將這些氧化應激標志物的水平恢復到接近正常水平,表明半胱氨酸具有抗脂質過氧化和抗氧化作用。

圖4 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟MDA水平的影響Fig.4 Effect of cysteine on the level of MDA in the liver of cadmium-exposed mice

a-SOD活性;b-CAT活性圖5 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟SOD、CAT活性的影響Fig.5 Effect of cysteine on the activities of SOD and CAT enzymes in the liver of cadmium-exposed mice

2.5 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響

小鼠肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α水平測定結果見圖6。由圖6可知,與對照組相比,鎘暴露組小鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α水平極顯著升高(P<0.01);然而,半胱氨酸組處理促使這些標記物的水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。這些結果表明鎘可能通過增加炎癥細胞因子如TNF-α和IL-1β的產生而促進脂質的產生。在鎘中毒的小鼠中,用半胱氨酸預處理被證明可以使升高的炎癥水平正?；?。半胱氨酸可以通過降低促炎細胞因子的水平來保護免受鎘誘導的炎癥反應,從而有助于減輕肝損傷。

圖6 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響Fig.6 Effect of cysteine on the content of IL-1β, IL-6, and TNF-α in the liver of cadmium-exposed mice

2.6 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟脂類代謝相關基因表達的影響

為了確定半胱氨酸改善鎘導致脂質代謝異常的機制,本文進一步通過實時熒光定量PCR檢測參與脂質代謝的基因表達水平。如圖7所示,與對照組相比,鎘組的SREBP-1、ACC、FAS和SCD1等脂質合成基因表達水平顯著升高(P<0.01)。然而低劑量半胱氨酸(Cd+L-Cys)和高劑量半胱氨酸(Cd+H-Cys)處理組ACC和SCD1基因表達水平顯著低于鎘暴露組(P<0.05或P<0.01);高劑量半胱氨酸處理組SREBP-1和FAS基因表達水平顯著低于鎘暴露組(P<0.05),低劑量組差異不顯著?？傊?半胱氨酸減弱了Cd干擾脂質代謝相關基因的表達,從而改善了脂質積累,有助于肝損傷的恢復。

圖7 半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝臟脂類代謝相關基因表達的影響Fig.7 Effect of cysteine on the expression of genes related to lipid metabolism in the liver of cadmium-exposed mice

3 討論

有研究表明,鎘暴露可抑制肝細胞增殖能力,改變肝細胞形態,破壞肝細胞結構,最終引起細胞死亡[19]。先前的研究已經報道,鎘誘導的氧化應激和炎癥會導致肝臟損傷[20]。研究表明,鎘可誘導小鼠肝臟中抗氧化酶活性顯著降低和MDA水平的升高[21-22]。已知L-半胱氨酸等含硫氨基酸具有抗氧化作用[23]。以前的研究發現膳食L-半胱氨酸降低了砷誘導大鼠肝臟氧化應激水平[24]。本研究旨在評估L-半胱氨酸攝入對急性鎘暴露小鼠肝毒性的保護作用及機制。

ALT和AST是肝損傷的特異性酶標記物,與對照組相比,鎘可使血清中的肝功能酶活性(ALT和AST)水平升高。此外,鎘可引起肝臟病理改變,包括肝索排列不規則、胞漿空泡化等。氧化應激被定義為組織內促氧化劑/抗氧化劑平衡的紊亂[24]。在這里,L-半胱氨酸和氯化鎘聯合治療通過降低MDA水平以及恢復SOD和CAT活性來減輕肝組織中的氧化反應。除了氧化損傷外,炎癥反應在肝損傷中也起著關鍵作用。本實驗結果顯示,鎘暴露小鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α水平極顯著升高,而不同劑量組L-半胱氨酸治療阻斷了鎘誘導的炎癥反應。有研究發現乙酰半胱氨酸可通過減少促炎標志物(IL-6、IL-1β、TNF-α)來有效改善肝功能損傷[25]。

氧化應激和慢性炎癥刺激導致肝細胞脂質代謝紊亂[26-27]。脂質代謝指生物體內脂肪,在各種相關酶的幫助下,消化吸收、合成與分解的過程,受脂肪生成轉錄因子[包括固醇調節元件結合蛋白-1(SREBP-1)]、脂肪生成酶(包括FAS和ACC)基因的控制[18]。FAS和ACC是脂肪酸合成的兩個關鍵限速酶,SREBP是一種調節脂肪酸合成酶表達的轉錄因子,而SCD1主要促成單不飽和脂肪酸的形成[28]。前期的研究發現,鎘暴露導致脂質積累并改變參與細胞死亡或存活調節途徑[29]。LARREGLE等[9]研究發現鎘暴露直接或間接改變血清脂質含量和肝臟脂質代謝。本文的研究結果表明,鎘暴露可提高肝臟中的TG和TC水平。肝臟中SREBP-1、ACC、FAS和SCD1等脂肪酸合成相關基因表達水平升高,而補充L-半胱氨酸可通過下調脂肪酸合成相關基因(SREBP-1、ACC和FAS)表達預防血脂異常和肝脂肪變性,這表明L-半胱氨酸可以緩解鎘導致的脂質代謝紊亂。

4 結論

本研究通過評估半胱氨酸對鎘暴露小鼠肝功能酶活性、肝組織損傷、氧化損傷、炎癥及脂質代謝的影響發現,鎘誘導的氧化應激和炎癥可能觸發肝臟脂質積聚,導致小鼠肝臟損傷。高劑量半胱氨酸具有更好的抗氧化和抗炎效果,主要通過抑制氧化應激和炎癥減輕鎘誘導的小鼠肝臟脂質代謝紊亂。