黃芩素抑制Toll樣受體4/核因子-B炎癥通路改善小鼠腦出血后腦損傷的作用及機制研究

王春喜，余永佳，黃立添，馮大勤

出血性腦卒中是最常見腦出血類型，占腦出血病例15%，卻有50%卒中相關死亡，每年全球因此死亡約280 萬人[1]。存活腦出血患者由于不可逆的神經損傷導致多數遺留殘疾，僅20%左右在6 個月后具有功能獨立性[2]。有證據表明，炎癥反應導致神經細胞死亡及隨后的神經功能障礙，在腦出血后腦損傷中起著關鍵作用[3-4]。腦出血多種裂解產物可刺激激活Toll樣受體4（TLR4），啟動核因子- B（NF- B）釋放促炎子TNF- 及IL- 介導炎癥反應，而抑制TLR4/NF- B 信號通路，可緩解腦出血后炎癥反應，改善腦損傷[5]。黃芩素是從中藥黃芩提取的主要生物活性成分，具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用，是一種潛在的神經保護藥物[6-7]。近年來，黃芩素在多種急性腦損傷模型中的神經保護作用得以證實[8-10]，其中也包括腦出血[11]，而其具體保護機制尚不完全清楚。最近研究顯示，黃芩素可直接與TLR4 結合，從而靶向抑制TLR4 的激活[12]。本研究擬研究黃芩素抑制TLR4/NF- B炎癥通路改善小鼠腦出血后腦損傷的作用與機制，報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物 所有動物使用流程均符合美國國立衛生研究院的《實驗動物護理和使用指南》。雄性C57BL/6J小鼠（10 ～12 周鼠齡，體質量20 ～25 g）購于南京大學，許可證：SYXK（蘇）2019-0056。所有小鼠均被飼養在具有12 h黑暗-光照周期的環境，并可以自由獲得充足的飼料和水。

1.2 儀器與試劑 黃芩素（98%純度，Sigma公司），二甲亞砜（DMSO，Sigma 公司）；Ⅳ型膠原酶（Sigma公司）；TLR4、p65、p-p65 及二抗（Santa Cruz Biotechnology 公司），Iba1（Wako 公司），Alexa Fluor 二抗（Invitrogen 公司）；Fluoro-Jade C（FJC）染色試劑盒（Chemicon公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、ECL 化學發光試劑盒和5×loading buffe（r碧云天生物技術公司）；酶標儀、切片機（Thermo）；熒光顯微鏡（蔡司）；Western blot 電泳儀（Bio-rad）。

1.3 小鼠膠原酶誘導腦出血模型建立 根據文獻[13]所述方法，通過基底節區注射Ⅳ型膠原酶來制作。小鼠通過吸入含有2%異氟醚100%氧氣進行深度麻醉，并以1%異氟醚維持麻醉。麻醉成功后，將小鼠的頭部被固定于立體定向器儀上，剪除頭頂毛發，消毒后，中線處切開頭皮以暴露前囟門，在前囟門后方1.0 mm 和右側面2.5 mm 處顱骨上開一個1 mm 的孔，直到穿透硬腦膜。用27 號針頭將IV 型膠原酶（0.06 U/0.5l 0.9%氯化鈉注射液）注射到基底節區，深度為3.5 mm，注射完成后保持3 min 以防止腦脊液滲漏。骨蠟密封鉆孔，縫合頭皮。在37 ℃下觀察小鼠從麻醉中恢復的30 min，小鼠完全蘇醒后再放回溫暖的籠子。通過盲法將動物隨機分配到藥物或溶劑治療組，假手術組通過單純注射0.5l 0.9%氯化鈉注射液制作。所有的手術程序都是在上午9∶00-12∶00 進行。

1.4 分組及給藥 將黃芩素溶解于DMSO保存，在藥物注射前將其溶解于0.9%氯化鈉注射液（最終黃芩素濃度為10 mg/ml，DMSO 含量為10%）。黃芩素通過腹腔注射。實驗分為3 步：（1）根據前期研究[10]，使用3 種濃度的黃芩素（10、50 及100 mg/kg）來測試黃芩素對腦出血的神經保護作用。在腦出血后1、12 h 腹腔注射黃芩素（n=6），然后每12 小時注射一次黃芩素，持續3 d。在假手術組和腦出血組中，予同等體積的含10%DMSO 的0.9%氯化鈉注射液。評估完神經功能缺損后，腦出血3 d 時進行深度麻醉，取各部分腦組織進行腦水含量測定。（2）小鼠（n=6）在腦出血誘導后6 或12h用黃芩素或溶劑進行治療，然后每12 小時用黃芩素或溶劑治療3 d。在評估神經功能缺損后，腦出血3d 時進行深度麻醉，取各部分腦組織進行腦水含量測定。（3）小鼠在腦出血誘導后1 和12 h 用黃芩素（50 mg/kg）或溶劑治療，然后每12 小時給藥1 次，持續3 d。對小鼠進行深度麻醉取腦組織，行Westernblot 檢測目標蛋白表達（n=6）、組織學檢測（n=3）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）（n=6）。

1.5 神經功能評分及腦水含量 使用改良的28 分神經系統評分[14]評估神經功能，分別于在手術前，腦出血后24、48 及72 h 進行。檢測腦水含量采用文獻[14]方法，小鼠在腦出血后72 h 行深度麻醉并立即取出腦組織并分成3 部分，包括同側和對側半球和小腦，小腦被用作參考。立即對它們進行稱重以獲得濕重，然后在100℃烤箱中干燥24 h 以獲得干重。腦水含量=（[濕重—干重）/濕重]×100%。

1.6 FJC 染色及Iba1 免疫熒光 以血腫中心為中心點，前后間隔200m 進行冠狀位進行冰凍切片。將冰凍切片浸泡在由1% NaOH 和80%酒精組成的堿性酒精溶液中5min，然后用70%的乙醇洗滌2min，隨后在蒸餾水中洗滌2 min，將切片浸泡于0.06%高錳酸鉀溶液中，搖床震搖10 min。用蒸餾水洗滌2次，然后在0.001%FJC 溶液中孵育10 min（避光）。然后用蒸餾洗滌2 次，風干，蓋上載玻片，熒光顯微鏡觀察。所有切片都在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

小膠質細胞的免疫組化檢測，首先將冰凍切片使用PBS 清洗，接著使用10%正常山羊血清進行封閉后，用兔抗小鼠Iba-1 抗體在4 ℃下孵化過夜，然后在搖床上用PBS 洗3 次，每次10 min，然后用適當的二抗體Alexa Flour 594 在室溫下反應1 h，然后用PBS 清洗。蓋上載玻片，用熒光顯微鏡進行拍照。

在熒光顯微鏡下，由1 名對實驗組分組不明的研究人員對血腫周圍的四個區域而每個動物的三個切片進行觀察和拍照。使用熒光顯微鏡在200 倍放大視野下對每個切片的四個區域中的FJC、Iba-1 陽性細胞進行計數，每只動物有3 個切片被計數。FJC和Iba-1 陽性細胞以細胞/200 視野面積表示。

1.7 Western blot 及酶聯免疫吸附試驗（ELISA）小鼠在腦出血后72 h 進行深度麻醉后處死，灌注后取血腫周圍腦組提取蛋白后進行Western Blot檢測，等量（40 g）的總蛋白在10%的SDS-PAGE 中電泳分離并轉移到硝酸纖維素膜上。使用抗TLR4、抗p-P65、p65 和抗-actin 和恰當二抗體。使用ECL化學發光試劑盒對條帶進行曝光，并使用Image J 軟件（NIH）通過測量灰度值進行量化。結果以與-actin 的相對灰度表示，隨后與sham組的平均值進行歸一化。

根據說明書使用ELISA 試劑盒來量化TNF-和IL-1 的水平，根據標準曲線由一名對分組不知研究人員將測量的光密度值轉換為濃度值。

1.8 統計方法 數據采用GraphPad Prism 8 軟件分析，計量資料采用均數±標準差表示。多組間比較采用F 檢驗，多重比較采用LSD-t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素減少小鼠腦出血后神經功能缺損及腦水腫 小鼠腦出血模型中，黃芩素以濃度依賴的方式改善了神經功能障礙并減輕了腦水腫。腦出血后1h用50 或100 mg/kg 的黃芩素治療，均可明顯減輕神經功能障礙，并在腦出血后72 h 時明顯減少同側半球的腦水腫（均P ＜0.05），見封三彩圖1。

圖1 黃芩素治療可緩解小鼠腦出血后3d神經功能缺損及腦水腫(與腦出血組比較,*P<0.05,**p<0.01)

腦出血后延遲到6 h 予黃芩素治療仍能減少神經功能障礙以及減少腦出血后72 h 同半球的腦水腫，見封三彩圖2。腦出血后12 h 才開始予黃芩素治療組，可見在腦出血后3 d有減少神經功能障礙和腦水腫的趨勢，但差異無統計學意義（P ＞0.05）。

圖2 黃芩素(50mg/kg)治療小鼠腦出血的時間窗(與腦出血組比較，*P<0.05)

2.2 黃芩素抑制腦出血后神經細胞退變 在假手術組中檢測到少量FJC 陽性細胞。在腦出血組，FJC陽性細胞與假手術組相比明顯增加，而黃芩素治療后FJC 陽性細胞明顯減少，見圖1。

圖1 黃芩素治療減少小鼠腦出血3 d 時神經細胞退變（與假手術組相比，***＜0.001；與腦出血組比較，###＜0.001）

2.3 黃芩素抑制腦出血后小膠質細胞激活 在假手術組，腦內檢測到較少的Iba-1 陽性細胞，腦出血組的小膠質細胞被急劇激活，而黃芩素治療明顯減少了腦出血后3d血腫周圍區域的激活小膠質細胞的數量，見圖2。

圖2 黃芩素治療減少小鼠腦出血3 d 時小膠質細胞激活（與假手術組相比，***＜0.001；與腦出血組比較，###＜0.001）

2.4 黃芩素抑制腦出血后TLR4/NF- B 的激活Western blot 結果顯示，在假手術組腦內TLR4 及pp65 蛋白表達水平均較低，而與假手術組比較，腦出血后血腫周圍腦組織TLR4 及p-p65 蛋白表達水平明顯升高，黃芩素治療后顯著減少腦出血后TLR4 及p-p65 的表達，見圖3。

圖3 黃芩素治療降低了小鼠腦出血3 d 后TLR4 及p-p65 的表達（與假手術組相比，***＜0.001；與腦出血組比較，#＜0.05）

2.5 黃芩素減少了腦出血后損傷腦組織中促炎癥因子的產生 假手術組的TNF-a和IL-1 的濃度較低，腦出血后急劇增加，用黃芩素治療后，它們大大減少，見圖4。

圖4 黃芩素治療降低了小鼠腦出血3 d時促炎因子（TNF- 和IL-1 ）（與假手術組相比，***P ＜0.001；與腦出血組比較，#P ＜0.05，##P＜0.05）

3 討論

本研究發現黃芩素在小鼠膠原酶誘導腦出后腦損傷中起著保護作用，進一步機制研究發現，黃芩素的神經保護作用可能是通過抑制TLR4/NF- B 介導的炎癥通路及小膠質細胞活化所介導的。

腦出血原發性損傷主要是血管破裂后血液進入腦實質形成血腫，導致的機械性損傷，由于其難以預見，因此潛在的干預策略是非常有限的[15-16]。臨床主要針對繼發性腦損傷進行干預，而繼發性腦損傷主要是由于血液及其裂解產物產生的一系統復雜的反應導致的。其中腦出血后腦內的炎癥反應在腦出血后繼發性腦損傷中起著至關重要的作用[3-4]。炎癥通路的激活導致神經細胞死亡、小膠質細胞活化及腦水腫等，因此炎癥反應是腦出后繼發性腦損傷的關鍵治療靶點[17]。本研究也是針對腦出血后的炎癥反應，從天然藥物中尋找潛在的神經保護劑。

黃芩素在包括阿爾茨海默癥、帕金森、缺血性卒中等多種神經系統疾病中起著神經保護作用[6-7]。本研究首先在膠原酶誘導的腦出血模型中，通過腹腔注射不同濃度的黃芩素（10、50 及100 mg/kg）評估了黃芩素的神經保護作用。研究發現，在小鼠腦出血模型中，經腹腔注射黃芩素可減輕神經功能缺損及減少腦水腫，并呈現出劑量依賴性。在其他腦出血研究中也得到證實[11]。此外，本研究還進一步探討了選擇中劑量的黃芩苷（50 mg/kg）在小鼠腦出血模型中的治療時間窗，小鼠在模型誘導后不同時間點（6 及12 h）使用對照溶解或者黃芩素進行治療，發現模型誘導后6 h 使用黃芩素仍能緩解神經功能缺損及減輕腦水含量，12h 后治療后有改善趨勢。這表明在膠原酶誘導小鼠腦出血模型中，黃芩素的治療時間窗可以拓展到出血后6h，然而其具體的保護作用仍不明確。

由于小膠質細胞作為中樞神經系統的固有免疫細胞，在腦出血后被激活后釋放炎癥因子，加急神經炎癥，導致腦出后腦損傷[18]，并且黃芩素在多種體內體外模型中抑制小膠質細胞活化及炎癥因子釋放[19-20]。本研究發現，使用黃芩素治療后，腦出血受損傷的腦組織中小膠質細胞激活減少，表明黃芩素可通過減少小膠質細胞激活減少腦出血所誘導的神經炎癥。此外，通過FJC染色顯示，經過黃芩素治療的小鼠血腫周圍變性神經細胞想到減少，表明黃芩素可以保護神經細胞免受腦出血引起的腦損傷。這些結果表明，抑制小膠質細胞的激活和神經細胞的變性可能是黃芩素發揮其神經保護作用的機制。

TLR4 在調控小膠質細胞活化及神經炎癥中起著至關重要的作用[21]，TLR4 作為一種損傷相關分子模式受體，在腦出血后多種被幾個具有損傷相關分子模式的內源性配體（如血紅蛋白和纖維蛋白原）激活，隨后激活其下游轉錄因子NF- B，增強促炎癥細胞因子的產生，從而誘發先天性免疫反應而導致神經功能缺損[22]，因此TLR4/NF- B 是腦出血后治療腦損傷的關鍵靶點。而筆者在蛛網膜下腔出血模型中證實黃芩素可抑制TLR4/NF- B 通路介導的神經炎癥反應，緩解早期腦損傷[10]，其他研究者在腦缺血中也觀察到相似結果[23]。更有研究表明黃芩素可直接與TLR4 結合，從而靶向抑制TLR4 的激活[12]。本研究觀察到黃芩素治療后，可抑制腦出血后TLR4 的表達以及NF- B（p65）的磷酸化，從而減少下游促炎癥因子（TNF- 及IL- ）的釋放。這些結果提示黃芩素可抑制腦出血后TLR4/NF- B 通路介導的炎癥反應。

綜上所述，黃芩素可以保護腦出血引起的腦水腫，并改善腦出血后的神經功能；并進一步證明，黃芩素保護腦出血導致神經細胞退變的影響。此外，黃芩素通過抑制小膠質細胞激活、TLR4/NF- B 通路介導促炎因子（TNF- 及IL- ）的釋放而發揮了抗炎作用。