大黃素對胰腺癌細胞5-甲基胞嘧啶表達的影響及對抑癌基因ppENK 去甲基化的作用

陳亮，唐堅，褚永權，葉劍宏，沈超，錢曉宇，姚旭楓

胰腺癌臨床表現隱匿、早期診斷困難、容易發 生遠處轉移，是預后很差的消化系統惡性腫瘤之一，總體五年生存率約10%[1]。盡管手術切除是唯一可能的治愈手段，但由于早期癥狀不典型、易發生轉移等特點，大部分胰腺癌患者就診時已無法行根治性切除[2-3]。而且接受了手術治療，其預后仍然不是十分理想。

大黃素具有抗菌、抗炎、免疫調節、抗腫瘤等作用，Liu 等[4]報道大黃素可通過多種途徑抑制胰腺癌細胞的生長，起到抗癌作用，但其具體作用機制尚不清楚。DNA 甲基化是指在 DNA 甲基轉移酶（DNMTs）的催化下，對CG 二核苷酸的胞嘧啶進行化學修飾，使其成為5-甲基胞嘧啶（5mc），DNMTs在腫瘤中的表達增強，引起高甲基化抑癌基因失活，最終促進腫瘤發生[5]。目前最常用的去甲基化藥物主要包括核苷類似物地西他濱和5AzA-cdR，在低濃度下通過抑制DNMT 活性發揮去甲基化作用[6]。本文主要研究大黃素對胰腺癌細胞基因組5mc 的影響，及對抑癌基因ppENK啟動子區CpG島的去甲基化作用，探討大黃素是否可以通過降低5mc 的表達來逆轉ppENK 的甲基化狀態，從而使其重新表達生物活性。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 大黃素、5AzA-cdR 購自sigma，CCK-8 試劑盒購自Gibco，細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心菌株型）購自上海杰瑞生物工程有限公司，EpiTect?MSP 套件購自QIAGEN。

1.2 方法

1.2.1 細胞系和培養 本課題組引進并保存胰腺癌細胞系Panc1 細胞株，培養于胎牛血清、鏈霉素和青霉素的DMEM培養基中，37 ℃，飽和水分和5%CO2條件下生長，每2 ～4 d 換一次培養基，當生長到70%～80%時傳代進行實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗（CCK-8） 取對數生長期的Panc1 細胞，每孔接種5×103/100l 細胞于96 孔板中，分別使用濃度為0、10、20、40 及80l 的大黃素處理細胞24、48、72 h。用酶標儀測定各孔在450 nm波長下的吸光度值（OD 值），實驗重復3 次。根據以下公式計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=（1-實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。

1.2.3 Dot-blot 各組作用于Panc1 細胞72 h后，用細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒按照說明提取各組DNA，使用HS dsDNA Kit和Qubit Fluormete（rInvitrogen）通過熒光測定術來測定DNA 的濃度。Dotblot 過程參考文獻[7]的方法。

1.2.4 mRNA-Seq Panc1 細胞用0、10、20及40mol/L大黃素和1mol/L 5AzA-cdR 處理72 h，然后用TRIzol?試劑提取每組總RNA，從5g 真核總RNA 開始。磁珠法分離mRNA，離子裂解mRNA，用TruseqTMRNA 樣品制備試劑盒合成雙鏈cDNA，連接index linker，經PCP 富集后，用2%的瓊脂糖膠回收目的條帶，TBS380（Picogreen）定量，按數據比例混合上機，cBot 上橋式擴增，用Truseq SR Cluster Kit v3-cBot-HS 生成clusters，Hiseq2000 測序平臺，進行1*50 bp 測序實驗[Hiseq2000 Truseq SBS Kit v3-HS（50cycles）]。

1.2.5 DNA的提取與亞硫酸鹽修飾 使用Cell/Tissue Genomic DNA Extraction Kit 按照說明書分別提取DNA，檢查DNA 的純度和濃度后，取1g DNA進行亞硫酸鹽修飾，修飾過程按照EpiTect的說明書進行，最后修飾的DNA 溶于30l 的Buffer EB 溶液中，立即用于PCR 反應或保存于-20℃冰箱備用。

1.2.6 甲基化特異性PCR（MSP） 根據EpiTect?MSP Kit 試劑盒說明要求，PCR 反應體系結束后，取10l PCR產物，經含GoldViewI型核酸染色劑的2%瓊脂糖凝膠電泳45min，電泳結束后紫外拍照分析。1.3 統計方法 采用SPSS17.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析和t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素對胰腺癌細胞的生長抑制作用 大黃素可以抑制Panc1 細胞的生長，表現為時間和濃度梯度形式。40mol/L 處理72h 后，生長抑制率為49.4%，80mol/L處理72h后，其抑制率達到了64.4%，見圖1。鑒于藥物的去甲基化作用通常在相應較低的藥物濃度下，不會對細胞產生毒副作用，因此大黃素的濃度選擇為0、10、20 和40mol/L，用于后續研究。

圖1 不同濃度大黃素對Panc1 的抑制作用

圖2 不同濃度大黃素對5mc、5hmc 表達的影響

2.3 不同濃度大黃素對ppENK 甲基化的影響 0、10、20 及40mol/L的大黃素作用于胰腺癌細胞48、72 h 后，ppENK 基因甲基化條帶表達有不同程度的減弱，非甲基化條帶由幾乎不表達到有不同程度的表達，且有隨著藥物濃度增加表達逐漸增多的趨勢，對照組5AzA-cd 作用明顯強于大黃素組。同一濃度的大黃素分別作用于胰腺癌細胞48、72 h，其甲基化條帶隨著時間有遞減的趨勢，非甲基化條帶具有增加的趨勢，見圖4。

圖4 不同濃度大黃素對ppENK 甲基化的影響

3 討論

胰腺癌是惡性程度最高的消化系統腫瘤之一，是目前美國癌癥相關死亡的第三大原因，其全球負擔在過去幾十年間增加了一倍以上[8-10]。大黃素可誘導胰腺癌細胞凋亡[11]、抑制新生血管形成[12]，與吉西他濱合用可提高胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性，但具體機制尚不十分清楚。本研究結果表明，大黃素可以通過去甲基化作用進而影響全基因組的表達，尤其是通過降低ppENK的甲基化水平發揮抗癌作用，闡明了大黃素抗腫瘤的表觀遺傳調控機制。

胰腺癌抑癌基因的啟動子區CpG 島甲基化被認為是表達失活的主要原因之一[13]。ppENK 基因與腫瘤細胞生長遲緩有關，ppENK 基因位于8q23-24，由4 個外顯子和3 個內含子組成。ppENK 基因編碼的產物是阿片類生長因子[14]。對包括胰腺癌在內的多種腫瘤都具有生長抑制功能，在胰腺癌細胞中檢測到ppENK 的高甲基化。Ueki 等[15]報道了11 種胰腺癌細胞系ppENK全甲基化，胰腺癌病理標本中ppENK 甲基化水平顯著高于正常胰腺組織，表明CpG 島的甲基化與ppENK 表達的失活有關。本研究結果顯示，大黃素、5-AzA-cdR 可以顯著地降低Panc1 細胞ppENK 的甲基化水平，但是大黃素作用強度要稍微弱于5-AzA-cdR。

本研究結果顯示大黃素可以隨著時間和濃度梯度抑制胰腺癌細胞的生長。當80mol/L 大黃素作用于Panc1 細胞72 h 后，生長抑制率為64.4%，細胞形態發生明顯改變，這與以往相關文獻報道一致[8]，但40mol/L時其抑制率為49.4%，細胞學形態學無明顯變化，故選擇0、10、20 及40mol/L的大黃素藥物濃度實驗。

DNA CpG 島甲基化（5mc）對基因轉錄沉默，基因組印跡和X染色體的失活等發揮了不可或缺的作用，但是最新研究熱點主要集中在5hmc 上。5hmc由Ten-eleven translocation 酶（TET 酶）催化5mc 氧化而來，TET 酶主要有TET1、TET2、TET3[16]，5hmc的具體功能不是很清楚，被認為可能是完成由5mc到C 去甲基化過程中的一個中間體，許多腫瘤組織中5hmc 的表達較正常組織相比明顯減少。本實驗Dot-blot 結果示40mol/L 的大黃素和1mol/L 的5AzA-cdR 可顯著減少5mc 的表達，但是各濃度用藥組對5hmc的表達均無明顯差異，說明大黃素可以通過抑減少5mc 的生成、降低5mc 的表達來逆轉ppENK的甲基化狀態，從而使其重新表達生物活性。