一株產纖維素酶菌株的分離純化及其產酶性質研究

黃翠欣,張桂容,劉軍,舒林,曹榮,溫雪瓶,李麗,4*

1(四川輕化工大學 生物工程學院,四川 宜賓,644000)2(四川思來生物科技有限公司,四川 成都,610000)3(四川太源井醋業有限公司,四川 自貢,643000)4(固態發酵資源利用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)

四川曬醋是麩醋的一類,以麩皮和大米為主要原料,用藥曲做糖化劑,采取糖化、酒化、醋化同池進行的生料開放式多菌混合固態發酵工藝。經蒸煮、發酵、日曬(其醋醅和成品醋均經日光暴曬)、陳釀四大工藝流程,20多道工序,使得四川曬醋色澤黑褐、無沉淀、香氣芬芳,具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠長、久存不腐的特點[1-2]。霉菌是食醋發酵過程中一類重要的微生物,包括毛霉、曲霉、青霉等,在發酵過程中不僅起著糖化、液化等作用,還與食醋風味、品質等緊密相關[3-4]。

在食醋釀造過程中,通過添加纖維素酶生產菌種可以提升食醋風味[5-6],微生物所產生的纖維素酶系是一個多組分酶系,通常將纖維素酶分為內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,可將纖維素水解成葡萄糖,用于生產乙醇、有機酸等化合物[7]。在這三類酶的協同作用下,纖維素可降解為葡萄糖,內切葡聚糖酶作用于纖維素的非結晶區,將纖維素切割成聚合度不同的短鏈纖維素;外切葡聚糖酶從短鏈纖維素的非還原端開始水解β-1,4糖苷鍵,釋放纖維二糖;β-葡萄糖苷酶通過將纖維素二糖轉化為葡萄糖來完成纖維素水解的最后一步[8-9]。

本研究從四川曬醋醋醅中分離得到一株能夠產纖維素酶的菌株,結合生理生化試驗和分子生物學手段鑒定為橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa),以內切葡聚糖、β-葡萄糖苷酶活力為指標,通過單因素試驗、正交試驗確定該菌的產酶條件及酶學性質,以期為后期橫梗霉菌與四川曬醋風味物質形成的相關性研究提供理論依據,并為四川曬醋的生產提供了一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

醋醅,采集于四川某曬醋廠。

主要試劑:羧甲基纖維素鈉、Na2SO3、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖(分析純),成都科隆化學品有限公司;牛肉膏、蛋白胨(生化級),成都奧博星生物技術有限公司;酵母膏(生化試劑),上海展云化工有限公司;剛果紅,天津市大茂化學試劑廠;水楊苷(分析純),上海阿拉丁科技股份有限公司;瓊脂(食品級),石獅市環球瓊膠工業有限公司;馬鈴薯,市售。

T-114電子天平,奧豪斯儀器有限公司;QYC-2102C型恒溫培養搖床,上海福馬實驗設備有限公司;BSG-24水浴鍋、THZ-98C恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;T6紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;YXQ-75SII高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;BM1000顯微鏡,南京江南永新光學有限公司;AT-710型pH計,日本京都電子制造有限公司;SW-CJ-1FD單人單面凈化超凈工作臺,上海滬凈醫療器械有限公司。

1.2 培養基

基礎培養基(g/L):(NH4)2SO45,KH2PO41,MgSO4·7H2O 5,CaCl2·2H2O 0.1,酵母膏0.2,NaCl 0.1,碳源10(氮源5)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基、羧甲基纖維素鈉培養基參考文獻[10-11]配制;胰蛋白胨大豆肉湯(tryptose soya broth,TSB)培養基、明膠培養基、淀粉水解培養基參考文獻[12]配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離鑒定

1.3.1.1 產纖維素酶菌株的篩選

取10 g醋醅投入盛有90 mL無菌水的三角瓶中,充分振蕩后梯度稀釋至10-1～10-6。取上述各梯度的稀釋液100 μL涂布于PDA平板上,30 ℃倒置培養至長出單菌落。挑取單菌落點接于羧甲基纖維素鈉培養基中,30 ℃恒溫培養48 h后,倒入1 mg/mL剛果紅溶液染色10 min,倒去剛果紅溶液,向平板加入1 mol/L的NaCl溶液浸泡15 min脫色,觀察菌落周圍有無水解圈,并測量菌圈比,并且將產纖維素酶活力較強的菌株進行斜面保藏。

1.3.1.2 菌株形態觀察

載片培養[13]后進行光學顯微鏡觀察。

1.3.1.3 菌株的生理生化特性觀察

根據《伯杰系統細菌鑒定手冊》[14]和《微生物分類學》[15]對菌種進行碳氮源利用試驗、溫度耐受試驗、鹽耐受試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗。

1.3.1.4 菌株分子鑒定

采用DNA試劑盒對篩選到的菌株進行全基因組提取,以ITS1/ITS4進行PCR擴增,經純化后送至上海派森諾生物科技有限公司測序。測序結果用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI核酸數據庫中的數據進行比對,得到與待測物種序列相似性最大的物種信息,利用軟件MEGA 6構建系統發育樹。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 培養時間對橫梗霉菌產酶能力影響

將菌株接種于PDA斜面培養基,于30 ℃培養48 h后,用無菌水洗脫孢子,調節稀釋倍數,用血球計數板計孢子數,使生物量為3.5×106CFU/mL,再以5%(體積分數,下同)接種量接種于PDA發酵培養基,分別測定培養12、24、36、48、60、72 h后的纖維素酶活力。

1.3.2.2 接種量對橫梗霉菌產酶能力影響

根據1.3.2.1節的測定結果,選擇最優培養時間,在此培養時間條件下探索不同接種量(0.5%、1%、3%、5%、7%和9%)對產酶的影響。

1.3.2.3 反應溫度對酶活力的影響

在確定接種量、發酵時間后,取粗酶液,設置不同的反應溫度(4、30、40、50、60 ℃),比較反應溫度對纖維素酶活性的影響。

1.3.2.4 pH值對酶活力的影響

在最適反應溫度的基礎上,設置不同酶反應體系pH值(3.0～10.0),測定不同pH值條件對纖維素酶活性的影響。

1.3.3 正交設計試驗

在單因素試驗基礎上,選用培養時間、酶反應底物pH值、酶反應溫度進行三因素三水平正交試驗,分別測定內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力,酶活力單位為U/mL,內切葡聚糖酶活力正交設計見表1,β-葡萄糖苷酶活力正交設計見表2。取最佳組合條件做驗證性試驗,比較結果,確定最佳酶作用條件。

表1 內切葡聚糖酶活力因素水平表Table 1 factor levels of Endoglucanase activity

表2 β-葡萄糖苷酶活力因素水平表Table 2 factor level of β-glucosidase activity

1.3.4 酶活力測定方法

發酵液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液。

采用DNS法[16-17]測定酶活力:取3支干燥潔凈的20 mL具塞刻度試管,分別在試管中加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL反應底物(內切葡聚糖酶活力測定采用羧甲基纖維素鈉溶液;β-葡萄糖苷酶活力測定采用水楊苷溶液),同時另取一組已滅活的粗酶液作為空白對照。50 ℃水浴30 min后,立即向試管中各加入2 mL DNS溶液,充分搖勻后沸水浴5 min,冷卻后用蒸餾水定容至20 mL,充分混勻。在540 nm波長下測定各試管溶液的OD值,根據葡萄糖標準曲線查相應的葡萄糖量,并計算相應的酶活力。

反應底物的制備:0.5 g羧甲基纖維素鈉(即1.0 g水楊苷)定容到100 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.2 mol/L pH 4.5)中。

在特定溫度、特定pH值條件下,每分鐘內催化底物產生1 μg還原糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U),計算如公式(1)所示:

(1)

式中:ρ,對照葡萄糖標準曲線得到的葡萄糖質量濃度,mg/mL;V0,反應體積,mL;t,反應時間,min;V,粗酶液體積,mL。

1.4 數據處理

實驗均平行測定3次,數據以平均值±標準差表示,采用Excel軟件處理數據,運用SPSS 22進行單因素ANOVA分析,并使用Duncan’s法進行多重比較,P<0.05表示差異顯著,數值后標注不同小寫字母表明差異性顯著。正交試驗結果采用極差分析法確定最優的組合。采用Origin 2021軟件繪制柱狀圖,運用MEGA 6軟件,Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株篩選結果

從曬醋醋醅中篩選出1株絲狀真菌,命名為CPM,通過將單菌落點接于羧甲基纖維素鈉瓊脂培養基進行培養,并進行產纖維素酶活力檢測,菌落1、2、3周圍形成無色暈圈,如表3所示菌圈比分別為2.61±0.14、2.72±0.13、2.69±0.05,初步確定該菌具有降解纖維素的能力[18]。因此,選擇該菌株進行后續實驗。

表3 菌株菌圈比Table 3 Ratio of bacterial ring

2.2 菌株生理生化試驗及形態特征結果

生理生化試驗結果見表4,本研究選用12種碳源、11種氮源培養基培養菌株CPM,發現其均可利用;在30 ℃、37 ℃均能生長,但37 ℃下生長較為緩慢;該菌可在含有0～10% NaCl溶液的培養基中生長;可分解明膠、淀粉。

表4 生理生化試驗結果Table 4 Physiological and biochemical test results

如圖1-a所示,于PDA培養基30 ℃條件培養,48 h后菌落呈疏松的絮狀,白色,邊界不清晰;72 h后鋪滿平皿,成熟菌絲轉變為黃色到不同程度灰色。

a-菌落形態;b-孢子囊及孢子形態圖1 菌株CPM菌落、孢子囊及孢子形態Fig.1 Colony, sporangium and spore morphology of CPM strain

由圖1-b可看出孢子囊表面光滑呈球形,孢子表面光滑呈橢圓形。根據文獻[19-20]初步鑒定該菌為真菌界、毛霉門(Mucoromycota)、毛霉綱(Mucoraceae)、毛霉目(Mucorales)、橫梗霉屬(Lichtheimia)。

2.3 菌株分子生物學鑒定

建立系統發育樹,比較菌株之間的同源性,如圖2所示,菌株CPM與橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa)同源性較高。結合菌株形態學觀察、生理生化分析,初步認定該菌為橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa)。

圖2 菌株CPM的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain CPM

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 培養時間的優化

葡萄糖標準曲線測定結果得到線性回歸方程:

y=1.454 6x-0.008,R2=0.999 1。如圖3-a所示,菌株CPM的產酶效果和接種時間存在一定關系。接種量為5%,培養36 h時,內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力最高,分別為(76.86±0.43)、(44.55±0.22) U/mL。當培養時間<36 h時,隨著培養時間的增加酶活力升高,而36 h后,酶活力下降,可能是由于培養時間較長,菌體老化,從而影響菌株的產酶能力[21]。

2.4.2 接種量的優化

如圖3-b所示,菌株CPM的產酶效果在接種量為1%時,內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力均為最高,分別為(96.52±0.26)、(49.72±0.36) U/mL。當接種量大于1%時,酶活力下降,可能是由于接種量過高,培養基中菌濃度較大,經36 h后培養基中缺乏營養物質,使菌株代謝受阻,進而降低產酶效果[22]。

2.4.3 反應溫度對酶活力的影響

由圖3-c可知,在50 ℃條件下反應30 min時,該菌的內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力均為最高,分別為(97.85±0.92)和(49.22±0.61) U/mL;60 ℃條件下反應30 min仍有較高的酶活力,說明內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶有一定的耐高溫特性,但是比50 ℃下的酶活力低,可見反應溫度太高依然會降低酶活力;4 ℃反應30 min條件下酶活力最低,內切葡聚糖酶酶活力為(28.57±0.79) U/mL,β-葡萄糖苷酶酶活力(19.91±0.55) U/mL,可見低溫會抑制酶的活性。綜上所述,內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為50 ℃,且有較好的耐熱性,耐高溫這一特性與HONG等[23]研究結果一致。

2.4.4 pH值對酶活力的影響

過酸或過堿條件下都會影響纖維素酶的結構,從而降低酶的活力[24]。由圖3-d可知,內切葡聚糖酶在pH 5.0時酶活力最高,為(96.72±0.83) U/mL,高于或低于pH 5.0酶活力均有所下降,說明該酶屬于酸性酶,并且pH值范圍在3.0～10.0均保持活性,說明菌株CPM所分泌出的內切葡聚糖酶具有良好的適應能力;pH 6.0時β-葡萄糖苷酶酶活力最高,為(51.07±0.83) U/mL,在pH值為3.0～10.0均保持活性,但是酸性條件下的酶活力均高于堿性條件,由此可知β-葡萄糖苷酶在酸性條件下的活力更高。

2.5 正交試驗結果

內切葡聚糖酶活力正交試驗結果如表5所示。經極差分析,可知對內切葡聚糖酶活力影響的主次關系為A>B>C,培養時間影響最大,其次是pH值和溫度;通過比較均值K,得到最佳組合為A1B2C3,即培養時間24 h、反應底物pH 5.0、反應溫度60 ℃;通過比較酶活力可知試驗2的酶活力最大,達(95.92±0.99) U/mL。

β-葡萄糖苷酶活力正交試驗結果如表6所示。經極差分析,可知對β-葡萄糖苷酶活力影響的主次關系為C′>A′>B′,溫度影響最大,其次是培養時間和pH值;通過比較均值K,得到最佳組合為A′1B′1C′2,即培養時間24 h、反應底物pH 5.0、反應溫度50 ℃;通過比較酶活力可知試驗11的酶活力最大,達(47.57±3.66) U/mL。

表6 β-葡萄糖苷酶活力正交試驗結果Table 6 Orthogonal test results of β-glucosidase activity

2.6 驗證性試驗

按正交試驗結果,取最佳組合1(A1B2C3)測定內切葡聚糖酶活力,最佳組合2(A′1B′1C′2)測定β-葡萄糖苷酶活力,試驗重復3次。結果如表7所示,正交試驗2號的內切葡聚糖酶活力高于最佳組合1,正交試驗11號的β-葡萄糖苷酶活力高于最佳組合2。故內切葡聚糖酶最優的酶作用條件為A1B2C2,即培養時間24 h、反應底物pH 5.0、反應溫度50 ℃;β-葡萄糖苷酶最優的酶作用條件為A′1B′2C′2,即培養時間24 h、反應底物pH 6.0、反應溫度50 ℃。

表7 驗證試驗結果Table 7 Results of verification test

3 結論

真菌產纖維素酶的主要特點是酶系全、產量高,并且能分泌到細胞外[25],橫梗霉菌屬于毛霉目的其中一種絲狀真菌,可產生羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶[5]、β-甘露聚糖酶[26]、淀粉酶[27]等。橫梗霉菌在醋醅中比較少見,常存在于大曲中[28-29]。本文從四川曬醋醋醅中篩選出的1株能夠產纖維素酶的橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa),通過單因素試驗、正交試驗探究其產酶條件與酶學性質。結果表明該菌所產的內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶分別在pH 5.0和pH 6.0條件下酶活力較高,具有較寬作用pH值和溫度范圍,對環境具有較強的耐受能力和適應性。后續還可以結合曬醋主料配方繼續優化發酵底物,測定橫梗霉菌在醋酸發酵過程中的代謝產物,這有助于橫梗霉菌與四川曬醋風味物質形成的相關性研究。