燕窩中結合唾液酸調節5種益生菌生長以及孕婦腸道菌群組成的研究

魯佩涵,吳劍榮*,柳訓才,華玉蓉,詹曉北,高敏杰,張洪濤

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(廈門燕之屋絲濃食品有限公司燕窩研究院,福建 廈門,361000)3(江南大學附屬醫院,江蘇 無錫,214122)

唾液酸是一類神經氨酸衍生物的總稱,廣泛存在于哺乳動物組織、乳汁和卵類中,主要以低聚糖、糖蛋白或糖脂的形式存在[1]。其中N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)和N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc)是最常見的存在形式,主要有抗炎、協助神經發育和抑制病菌等作用[2]。另外,人類生存所需的動物源膳食如乳品、禽蛋和肉類等含有豐富的唾液酸,這類唾液酸多以結合態的形式存在,主要通過α2-6/α2-3糖苷鍵連接在半乳糖/半乳糖胺上,如燕窩糖蛋白、卵黏蛋白、酪蛋白糖巨肽、3′-唾液酸乳糖等[3]。

燕窩(edible bird’s nest, EBN)是金絲燕及多種同屬燕類利用唾液分泌物建造的巢穴,經過處理后可以作為食品。中醫理論認為燕窩具有補中益氣、入胃補脾和化痰止咳等功能[4]。許多研究表明燕窩具有促進大腦發育、改善記憶[5]和抗病毒[6]等功效。燕窩的主要成分為富含唾液酸的黏蛋白,唾液酸含量占干重的7%～15%,不同產地來源的燕窩唾液酸含量差別較大[7]。

女性在妊娠期會通過自身的代謝對胎兒的生長發育產生影響。孕婦血液中的唾液酸會隨著妊娠階段的不同有所改變,研究表明母體會合成唾液酸并通過胎盤提供給7～9個月的胎兒,以供其生長發育所需[8]。BRIESE等[9]發現母體是胎兒唾液酸的主要來源,對胎兒在妊娠晚期的發育起重要作用。研究表明,攝入外源唾液酸可以提高妊娠期女性血液中唾液酸含量[10],而燕窩經過消化后糖鏈結構的改變可能對人類,特別是妊娠期女性的腸道健康產生影響。

腸道微生物對宿主健康至關重要[11]。腸道微生物可以發酵糖類物質產生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs),主要包括乙酸、丙酸和丁酸,它們對機體生理代謝的調節起重要作用[12]。益生菌是指對宿主有益并有利于腸內菌群生態平衡的活性微生物,在改善腸道環境,參與免疫調節等方面具有潛在的應用價值[13]。本研究以富含唾液酸的燕窩為研究對象,通過酸處理切除燕窩糖蛋白末端唾液酸(acidolysis bird’s nest,ABN)為對照,分別比較EBN、ABN和Neu5Ac的功能,探究燕窩糖蛋白末端唾液酸完整性對其抗氧化活性的影響,以及對益生菌生長和孕婦腸道菌群調節的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

短雙歧桿菌FWX346、動物雙歧桿菌ZJTZ1M2、干酪乳桿菌FJSSZ4L6、鼠李糖乳桿菌FFJLY7L1、嗜黏蛋白阿克曼黏細菌(Akkermansiamuciniphila),江南大學(中國無錫)食品微生物菌種保藏中心;燕窩樣品,廈門燕之屋生物工程有限公司,將即食的燉煮燕窩用去離子水沖洗過濾3次,收集沉淀凍干制成EBN凍干粉備用。

EBN脫唾液酸的方法參照文獻[14],略作修改。將凍干得到的EBN粉末以1 mol/L鹽酸在37 ℃下處理12 h,再次清洗過濾,收集沉淀,得到ABN作為對照。

MRS培養基(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5、葡萄糖3、CH3COONa 5、K2HPO42、MnSO40.2、MgSO40.2、CaCl20.45、L-半胱氨酸0.5、檸檬酸銨2和1 mL吐溫-80,pH 6.5。

基礎營養培養基(g/L):蛋白胨2、酵母提取物2、NaCl 0.1、KH2PO40.04、K2HPO40.04、NaHCO32、膽鹽0.5、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5、MgSO40.01、CaCl20.025、維生素K 0.002、氯化血紅素0.025、2 mL 吐溫-80,pH 6.5。

1.2 體外模擬消化

1.2.1 模擬唾液消化

將KCl(1.126 g/L)、NaHCO3(1.143 g/L)、NaCl(0.12 g/L)、CaCl2(0.167 g/L)和α-淀粉酶(150 U/mL)溶解于去離子水中制備唾液消化液。然后,以1∶1體積比例分別與EBN、ABN溶液在EP管中混合,在80 r/min、37 ℃水浴振蕩。消化15 min后,在100 ℃水中煮沸10 min滅酶。

1.2.2 模擬胃液消化

將人工胃液與模擬唾液消化液按1∶1體積比混合,使用0.1 mol/L鹽酸將所得溶液的pH值調節至2.0,在80 r/min、37 ℃水浴振蕩。消化4 h后,在100 ℃的水中煮沸10 min滅酶。

1.2.3 模擬小腸液消化

將上述得到的胃消化液用1 mol/L的NaHCO3溶液將pH值調為7.0,再向其中加入等體積的人工小腸液,80 r/min、37 ℃水浴振蕩。消化6 h后,在100 ℃的水中煮沸10 min滅酶,得到最終的消化液。

1.3 唾液酸的檢測方法

參考文獻[15]的方法使用間苯二酚-鹽酸法測定唾液酸的含量。

1.4 抗氧化活性的檢測方法

1.5 雙歧桿菌和乳桿菌的培養方法

在厭氧培養箱進行單個細菌的體外培養。在MRS培養基中激活菌株。將EBN和ABN作為碳源以5 g/L的終質量濃度、Neu5Ac和菊粉作為對照以0.5 g/L的終質量濃度取代MRS培養基中的葡萄糖。不含葡萄糖的MRS作為空白。每組進行3個平行,以10%(體積分數)的接種量于37 ℃培養24 h,使用紫外分光光度計測量光密度(OD600nm)。

1.6 SCFAs的氣相色譜檢測方法

使用GC進行測定,HP-INNOWAX色譜柱,Agilent-7890A氣相色譜儀。取1 mL離心后的發酵上清液,添加終濃度為1 mmol/L的2-甲基丁酸作為內標,再向其中添加250 μL濃鹽酸和1 mL乙醚,混勻。收集有機層,使用0.22 μm的有機濾膜過濾雜質后備用。以1∶20的分流比將5 μL樣品注入儀器,進樣器溫度220 ℃,檢測器溫度250 ℃。使用N2作為載氣,流速為1.5 mL/min。計算SCFAs的含量。

1.7 志愿者和糞便的收集

使用無菌的糞便收集管從3名適齡未妊娠健康女性(食用中國傳統膳食,年齡20～30歲)志愿者收集健康女性的糞便樣本,從無錫市江南大學附屬醫院婦產科的6名孕晚期孕婦志愿者收集孕晚期孕婦的糞便樣本(江南大學附屬醫院醫學倫理委員會的批準號:LS2021066),并且收集了所有志愿者的書面知情同意書。主要收集的信息包括年齡和孕周(表1),按照年齡差距分為2組,組Ⅰ的年齡較小,組Ⅱ的年齡較高。參與者在糞便樣本捐贈前至少2個月沒有服用益生菌或益生元,并且沒有胃腸道疾病史。收集的糞便樣品立即保存在厭氧培養袋中,置于冰盒,在6 h內送到實驗室作下一步處理。

表1 糞便捐贈者的基本信息Table 1 Basic information of feces donors

1.8 健康女性和不同年齡段孕晚期孕婦糞便微生物的體外發酵

將EBN和ABN消化液作為碳源以5 g/L的終質量濃度、唾液酸單體(Neu5Ac)作為對照以0.5 g/L的終質量濃度添加到基礎營養培養基中。將每組3個人的糞便樣本等量混合,并用無菌的生理鹽水梯度稀釋,無菌的4層紗布過濾。將糞便稀釋液以10%的體積分數轉接到培養基中?；A營養培養基作為空白組,每組3個平行,37 ℃培養24 h。分別收集0 h和24 h的發酵液樣品。

1.9 糞便菌群組成的檢測方法

使用CTAB方法從樣品中提取細菌基因組DNA,帶Barcode的特異引物擴增16S rRNA基因的V3～V4區。使用TruSeq-DNA PCR-Free樣品制備試劑盒生成測序文庫并進行測序。根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣本數據,進行拼接和過濾處理,得到的有效數據利用Uparse算法聚類成為OTUs。對OTUs序列進行物種注釋,用Mothur方法與Silva 138.1的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析,獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算α多樣性指數等。

1.10 統計分析

所有樣品均設置3個平行,使用SPSS 25.0統計軟件進行分析。數據以平均值±標準差表示。使用單因素方差分析數據,在P<0.05時確定具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 燕窩中結合唾液酸對其抗氧化活性的影響

a-DPPH自由基清除率;b-·OH清除率;清除率;d-還原力測定圖1 抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity注:維生素C;▲EBN:燕窩;▼ABN:酸處理燕窩;62N-乙酰神經氨酸

2.2 燕窩中結合唾液酸對雙歧桿菌和乳桿菌生長的影響

雙歧桿菌和乳桿菌是受到廣泛認可的益生菌,有益于宿主健康。例如雙歧桿菌在免疫增強、改善胃腸道功能和抵抗病原菌等方面發揮著關鍵的作用[18]。我們進一步研究EBN、ABN和Neu5Ac對雙歧桿菌和乳桿菌生長的影響,結果如圖2所示。在發酵24 h后,EBN和Neu5Ac顯著增加短雙歧桿菌的生物量分別至0.97±0.03和0.85±0.03,顯著高于ABN和菊粉組。這可能是由于雙歧桿菌的生長與代謝來自多種多聚寡糖和糖蛋白的復雜碳水化合物的能力有關。CHEN等[19]發現在人腸道菌群體外發酵過程中添加唾液酸化免疫球蛋白G能夠顯著促進雙歧桿菌的生長。短雙歧桿菌具有去糖基化糖蛋白和利用聚糖作為碳源的能力,還可以通過胞外唾液酸酶從低聚糖中釋放唾液酸[20]。因此,脫去唾液酸的ABN無法像EBN那樣顯著改善短雙歧桿菌的生長。EBN和ABN顯著增加了干酪乳桿菌和動物雙歧桿菌的生物量,空白、菊粉和Neu5Ac組之間的差異不大?？赡苁怯捎谶@2種益生菌可以利用燕窩中的其他營養成分導致的。鼠李糖乳桿菌在添加了菊粉的培養基中生長最好,EBN、ABN和Neu5Ac組則沒有顯著差異。

a-短雙歧桿菌;b-動物雙歧桿菌;c-干酪乳桿菌;d-鼠李糖乳桿菌圖2 燕窩中結合唾液酸對雙歧桿菌和乳桿菌生物量的影響Fig.2 Effect of bound sialic acid of EBN on the growth of Bifidobacterium and Lactobacillus注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

SCFAs對人體健康起重要作用,如乙酸是結腸上皮細胞的能量來源,丙酸在降低脂肪的合成及血清膽固醇水平方面具有關鍵作用,丁酸可以通過刺激抗菌肽的生成改善腸道屏障[21]。檢測在發酵24 h內積累SCFAs的濃度,如圖3所示。4株益生菌在體外發酵EBN過程中分別產生(83.22±16.46)、(106.76±6.09)、(73.09±1.78)、(101.4±4.58) mmol/L的乙酸,顯著高于其他組(P<0.05),2株乳桿菌產生的丙酸總體高于雙歧桿菌。短雙歧桿菌、動物雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌在體外發酵EBN過程中產生的丁酸濃度顯著高于其他組(P<0.05)?？梢钥闯?燕窩能夠促進雙歧桿菌和乳桿菌的生長,糖鏈結構完整的EBN可以顯著促進能夠利用唾液酸的益生菌生長(如短雙歧桿菌)并增加益生菌產生有機酸的量以改善腸道環境,而脫去唾液酸的ABN則無此效果。

a-乙酸;b-丙酸;c-丁酸圖3 燕窩中結合唾液酸對雙歧桿菌和乳桿菌產SCFAs的影響Fig.3 Effect of bound sialic acid of EBN on the production of SCFAs by Bifidobacterium and Lactobacillus

2.3 燕窩中結合唾液酸對阿克曼黏細菌生長的影響

嗜黏蛋白阿克曼黏細菌(Akkermansiamuciniphila)被認為是一種很有應用潛力的候選益生菌,具有多種對宿主有益的活性功能。它在體內的豐度與結腸炎、Ⅱ型糖尿病[22]、肥胖、動脈粥樣硬化[23]等諸多疾病呈負相關,可以改善脂代謝、調節免疫、改善腸道屏障[24]等。如圖4-a所示,在體外發酵過程中,EBN和菊粉都可以很好的促進A.muciniphila的生長,在24 h內細菌生物量的生長顯著高于ABN和Neu5Ac組(P<0.05)。檢測A.muciniphila在發酵24 h積累SCFAs的濃度,在體外發酵過程中EBN組的乙酸濃度在24 h內顯著高于ABN組(P<0.05),丙酸和丁酸產量較少且差別不大。A.muciniphila的特征是高度適應在黏蛋白降解物中生存,EBN中豐富的唾液酸黏蛋白含量也印證了這一點,但是破壞了末端唾液酸的ABN則沒有顯著促進A.muciniphila生長的能力,據此我們推測,EBN末端唾液酸是發揮其生物活性的重要結構組成。

a-細菌生物量;b-乙酸;c-丙酸;d-丁酸圖4 燕窩中結合唾液酸對阿克曼黏細菌生物量和產SCFAs的影響Fig.4 Effect of bound sialic acid of EBN on the growth and the production of SCFAs of Bifidobacterium and Lactobacillus

2.4 燕窩中結合唾液酸對健康女性和孕婦腸道菌群的影響

2.4.1 燕窩中結合唾液酸對糞便微生物有機酸生成的影響

腸道微生物在結腸發酵常常伴隨著SCFAs的產生,這些有機酸具有抑制有害病原體生長、調節上皮屏障功能、降低結腸pH值和預防結直腸癌等作用[25]。用健康女性和孕婦的糞菌發酵EBN、ABN和Neu5Ac,SCFAs生成結果如圖5所示。與健康女性組相比,EBN在孕婦組產生的乙酸比其他組的差異更加顯著(P<0.05)。妊娠期的女性易發妊高癥,乙酸鹽能夠誘導血管舒張和降低血壓[26],乙酸積累量的增加對孕婦健康有益。健康組、孕婦組Ⅰ和孕婦組Ⅱ發酵EBN的丙酸積累量分別為(2.16±0.34)、(5.73±0.93)、(9.72±0.25) mmol/L。丙酸經結腸吸收后由肝臟代謝用作能源,還能降低血糖和胰島素水平[27],有助于妊娠期女性調節血糖,降低妊娠期糖尿病的風險。

a-乙酸;b-丙酸;c-丁酸圖5 燕窩中結合唾液酸在體外糞菌發酵中SCFAs的影響Fig.5 Effect of bound sialic acid of EBN in vitro fecal bacteria fermentation on the production of SCFAs

2.4.2 燕窩中結合唾液酸對健康女性和孕婦糞便菌群組成的影響

人體腸道菌群結構容易受飲食、年齡、生活方式及藥物等因素影響。如CHANG等[28]研究發現靈芝多糖能夠逆轉肥胖小鼠腸道微生態失衡,促進腸道屏障完整,降低厚壁菌門與擬桿菌門間的比值。本研究通過16S rRNA高通量測序探究EBN、ABN和Neu5Ac對體外發酵過程中糞便菌群變化的影響,結果如圖6所示。

a-健康組門水平;b-健康組屬水平;c-孕婦組Ⅰ門水平;d-孕婦組Ⅰ-屬水平;e-孕婦組Ⅱ-門水平;f-孕婦組Ⅱ-屬水平圖6 燕窩中結合唾液酸在體外糞菌發酵中對菌群組成的影響Fig.6 Changes in bacterial composition during in vitro fecal fermentation of bound sialic acid of EBN

在門水平上,與空白和Neu5Ac組相比,EBN和ABN在健康女性和孕婦的糞菌發酵中均可顯著地增加厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度,降低變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度。在屬水平上,與空白和Neu5Ac相比,在EBN和ABN兩組燕窩發酵中擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)和糞球菌屬(Coprococuus)的相對豐度更高,而空白組和Neu5Ac組中大腸桿菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的相對豐度較高。糞桿菌屬(Faecalibacterium)是丁酸的重要產生者之一,具有抗炎作用,能夠維持細菌酶的活性,保護消化系統免受腸道病原體的侵害[29]。糞球菌屬(Coprococcus)是厚壁菌門毛螺菌科重要成員,是腸道重要的菌屬,積極發酵碳水化合物,和Faecalibacterium一樣可以產生丁酸。糞球菌可用作評估人體胃腸道健康狀況的微生物生物標志物,可能有助于抑制免疫反應,降低過敏反應的嚴重程度[30]。2組燕窩均有效抑制了以上病原菌的富集,孕婦組的EBN在富集有益菌和抑制病原菌上的效果優于ABN組。

LEfSe分析顯示了EBN、ABN、Neu5Ac和空白之間具有顯著差異的菌群(LDA值>4),如圖7所示。

在健康女性組,擬桿菌科(Bacteroidales)和擬桿菌屬(Bacteroides)分別在EBN和ABN發酵中顯著富集。擬桿菌科和擬桿菌屬擁有強大的碳水化合物利用系統,可以分解利用腸道中的糖類物質產生乙酸鹽和丙酸鹽等,改善腸道環境,是潛在的益生菌[31]?？瞻捉M會在發酵過程中顯著增加腸桿菌屬(Enterobacter)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)等致病菌的豐度,而EBN組可以在不同水平顯著富集擬桿菌,同時,在健康女性組還可增加乳桿菌目(Lactobacillales)和普雷沃氏菌屬(Prevotalla_9),在孕婦組Ⅰ可以富集梭菌綱(Closteridia)和顫螺菌目(Oscillospirales),在孕婦組Ⅱ也可富集梭菌綱(Closteridia)和厚壁菌門(Firmicutes)。結果顯示,空白組會增加病原菌的生長,而EBN對以上主要病原菌有明顯抑制作用。

研究顯示,人或動物體內的黏蛋白具有抵御微生物入侵的作用,是維持包括腸道在內的消化系統健康的重要保障[32]。如酪蛋白糖巨肽是一種含有唾液酸的活性糖基磷酸肽,具有多樣化的生物功能活性,如抑制細菌與病毒黏附、促進腸道益生菌增殖等[33]。卵黏蛋白主要存在于禽蛋中,是一種糖基化程度很高的蛋白質,有研究發現其對大腸桿菌和幽門螺桿菌有顯著抑制作用[34]。燕窩是富含唾液酸的優質外源黏蛋白,本研究發現EBN在抗氧化、促進益生菌生長和抑制病原菌富集等方面具有顯著效果,其末端唾液酸在被破壞后,生物活性明顯下降。因此,黏蛋白糖鏈結構的完整性對其生理活性的影響值得進一步探究。

3 結論

本文主要研究了燕窩唾液酸糖蛋白經過消化后的生理功能,驗證了EBN經過消化后具有良好的抗氧化活性,EBN糖鏈末端唾液酸的缺失會導致其抗氧化活性有所降低。EBN可以改善乳桿菌和雙歧桿菌的生長情況,對于能夠分解利用Neu5Ac的菌株如短雙歧桿菌,ABN與EBN相比在促進細菌生長和積累有機酸方面有明顯差異。EBN還可以顯著促進嗜黏蛋白阿克曼黏細菌(A.muciniphila)的生長。通過健康女性和孕婦糞便的體外發酵驗證了EBN對腸道菌群的影響:相比健康女性的糞菌結構,EBN能夠降低孕晚期孕婦糞菌中大腸桿菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)等致病菌的相對豐度,增加潛在益生菌擬桿菌屬(Bacteroides)的相對豐度,提高糞桿菌屬(Faecalibacterium)和糞球菌屬(Coprococuus)等產SCFAs菌的相對豐度。ABN和Neu5Ac在抗氧化、改善益生菌生長和調節腸道菌群等生理活性與EBN存在明顯差距,EBN中結合唾液酸糖鏈結構的完整性對其生物活性具有重要意義。